Name: ואפופטוזיס השראה ואיתור בתרבות העיקרית של מלפפונים בתאי מעיים ים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: למד פרוטוקול תרבית תאים ראשונית למעיים של Apostichopus japonicus. שיטה זו מאפשרת גידול לטווח ארוך של תאי חסרי חוליות ימיים לחקר ביולוגיה ימית ומחקרים גנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לפרופ ' נאנג'לי ז'או מאוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג לעצתו הטכנית ולהכנת ציוד המעבדה שלו הזמין לשימוש. עבודה זו הייתה נתמכת כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (הענקת מספרים 41876154, 41606150, ו 41406137) ואת קרנות המחקר הבסיסי עבור אוניברסיטאות מחוזי ג'ה-ג'יאנג ומכוני מחקר [גרנט מספר 2019JZ00007 ].

1. הכנה לתרבות התא בינונית
<ol><li>
הכנת נוזלים קומטומית
	<ol>
<li>
אוסף הנוזלים קואוממית: בתנאים סטריליים, בנתח מלפפון ים בריא (משקל רטוב של 85-105 גרם), לאסוף נוזל קולאומית, ולאחסן אותו בבקבוקון זכוכית סטרילית.</li>
		<li>
הסרת תא קואוממית: צנטריפוגה את הנוזל קולאומית ב 50 mL צנטריפוגה צינורות ב 1,700 x g עבור 5 דקות ולהעביר את supernatant לתוך הבקבוקון זכוכית סטרילית חדשה; בשלב הבא, לאסוף את נוזל קולאומית ללא תא של מלפפון הים.</li>
		<li>
הפעלת רכיבים משלימים: דגירה הבקבוקון זכוכית סטרילי, המכיל את הנוזל מלפפון קואומית ים, ב 40-50 ° c באמבט מים עבור 20 – 40 דקות כדי להשיג רכיבים משלימים-נוזל קולאומית מופעל.</li>
		<li>
הסרת חיידק: הסרת חיידקים וכלמידיה על ידי סינון דרך מסנני קרום 0.22 יקרומטר. הבא, להסיר mycoplasma וחלקיקים עדינים אחרים על ידי סינון באמצעות 0.1 יקרומטר מסננים קרום להשיג פתרון מראש נוזל הטיפול הקדם.</li>
		<li>
כוונון מליחות: להתאים את המליחות של הפתרון הטיפול מראש הנוזל קולוממית ל 30‰ (נמדד על ידי salinometer) על ידי הוספת 20% ריכוז גבוה טרום מעוקר ומסונן פתרון (מדולל על ידי נוזל קולאומית מראש) או DDW (מים מזוקקים כפול). העבר את נוזל מלפפון קואוממית ים לתוך בקבוק סטרילי, לאטום את הבקבוק, ולאחסן את הנוזל ב 4 ° c עבור ניסויים נוספים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ליבוביץ ' של L-15 תרבות התא אופטימיזציה בינונית
	<ol>
<li>שוקלים 5.05 g של הנרוג, 0.135 g של KCl, 0.15 g של CaCl2, 0.25 g של Na2SO4, 0.975 g של mgcl2, 0.25 g של גלוקוז, ו 6.25 mg של טאורין ולדלל אותם ב 40 מ ל של ליבוביץ ' s-15 בינוני של לייבוביץ ' מדיום צנטריפוגה סטרילית. מתפרעים את הצינור על שייקר עבור 1 h כדי להבטיח את המלחים יש מומס לחלוטין.</li>
		<li>הוסף 2.5 mL של l-גלוטמין (100 mg/ml) ו 500 μl של פתרון VE (1.75 mg/L) לתוך הבינוני l-15 מוכן ליבוביץ ' s-בינוני ועוד לסנן את המדיום דרך מסנני ממברנה יקרומטר ב0.22.</li>
		<li>כוונן את הנפח הבינוני הכולל ל-500 mL עם מדיום לייבוביץ ' L-15 טרי עם 100 מ ל של נוזל קולאומית שהוכן בעבר; הבא, להתאים את ה-pH כדי 7.6 באמצעות NaOH פתרון. שמור את תהליך הפעולה בסביבה סטרילית. יחס הרכבה של נוזל קולוממית יכול להיות 10% – 50%, ו -20% מספיקה לתרבות של תאי מעיים .</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנה לתאי המעיים
<ol><li>
עיבוד המעי מלפפון ים
	<ol>
<li>מלפפונים הרדים ים בריאים בקופסת קרח. לנתח ולאסוף את המעיים הקדמי, ואז לחלק את דגימות הרקמה אנכית ולהסיר את התוכן הפנימי.</li>
		<li>רוחצים את דגימות הרקמה בתמיסת מלח מלוחים (PBS) פעמיים ולחטא אותם על ידי הטבילה בפתרון אתנול מימית (75% על ידי נפח) עבור לא יותר מ 2 s.</li>
		<li>לשטוף את דגימות רקמות ב-PBS שלוש פעמים כדי להסיר אתנול ולהעביר על 100 מ"ג של דגימת רקמות לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה סטרילית של 2.0 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אוסף תאים
	<ol>
<li>הוסף 1.5 mL של בינונית התרבות טרום אופטימיזציה לחסום את מלפפון הים רקמת מעיים לחסום את הבלוק עם מספריים כירורגי מעוקר עד הפתרון מעונן. הערה: עבור פרוטוקול מפושטת, הוסף 0.5 mL של בינוני התרבות ממוטבת מראש לחסום מלפפון מעיים של הים וחותכים את הבלוק עם מספריים כירורגיים מעוקר לתוך 1 מ"מ3. העבירו במישרין את הדגימות למנות תרבות ואחריו שלבי הדגירה הבאים.</li>
		<li>הוסף 400 μl של טריפסין (0.25%), ערבב את הפתרון על-ידי היפוך, ומארג אותו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר; לאחר מכן, סנן את הפתרון באמצעות מסננת תאים מבית 100 יקרומטר. הערה: היא אופציונלית להוסיף טריפסין לפיזור תאים בעת טיפול בדגימות רקמה שונות. את חומצת החומץ (EDTA) יש לכלול ב טריפסין פתרון כדי לצמצם את פעילות המעעכבות מ-Ca2 + ו-Mg2 + במדיום התרבותי.</li>
		<li>לאסוף את פילטרט חדש סטרילי 2.0 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה, צנטריפוגה ב 1,700 x g עבור 3 דקות, להיפטר supernatant, לאחר מכן להשעות את הגלולה במדיום התרבות (שיושלם עם אנטיביוטיקה) ולשטוף אותו פעמיים. הערה: הכינו בינונית חדשה ממוטבת לתרבות מראש שיושלם עם 2% פניצילין-סטרפטומיצין פתרון (10,000 U/mL פניצילין 10 מ"ג/mL סטרפטומיצין) ו 1% gentamicin (4 מ"ג/mL) לפני תחילת הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. תרבית תאים
<ol><li>
הגדרת החממה: יש לקבוע מראש את החממה לתרבות התא ולהריץ אותה מראש לפחות 24 שעות בטמפרטורה של 18 ° c ולחות רוויה. הערה: הזנה CO2 לתוך החממה בהתאם למאפיינים המדיום של תרבות התא; אין שיתוף2 צריך להיות מסופק בעת שימוש במדיום הבסיסי של ליבוביץ ' של L-15.</li>
	<li>
תרבות תא הבמה הראשונה
	<ol>
<li>כדי לעכב את התפתחותם של חיידקים ולקדם את התפשטות במהלך השלב הראשוני של תרבות התא, להוסיף 10 מ ל של הפתרון פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL פניצילין 10 מ"ג/mL סטרפטומיצין) ו 0.5 mL של gentamicin (40 mg/mL) לתוך כל 500 mL של מיטוב התרבות מראש. יתר על כן, תוספת כל 500 mL בינוני בתרבות עם 0.6 מ ל של אינסולין (10 מ"ג/mL), 100 μL של מקדם הצמיחה אינסולין כמו (0.1 μg/μL), ו -25 μL של הצמיחה פיברוהפיצוץ פקטור (0.1 μg/μL).</li>
		<li>לאסוף את התאים לתוך צינורות 1.5 mL, להשעות אותם באמצעות 200 μL של בינוני מצוין, ו ללטף אותם לתוך φ 4 ס מ מנות.</li>
		<li>תרבות התאים בחממה ולהוסיף 2.0 mL של מדיום המצוין כדי מנות התא culturing לאחר 6 h. לשנות את חצי המדיום כל 12 h עד להגיע לשלב הבא. הערה: טפל בשינוי הבינוני בעדינות, מכיוון שהתאים אינם מחוברים לכלים הדוקים. ניתן להשתמש במנות פולי-D-ליזין מצופות לחיבור באופן רופף לתאי הכלים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תרבות תא הבמה השנייה
	<ol>
<li>כדי להפחית את ההשפעות השליליות של אנטיביוטיקה לתאים התרבותיים, להפחית את הריכוז של אנטיביוטיקה המצוין (פניצילין, סטרפטומיצין, ו gentamicin) ב התרבות בינונית על ידי חצי. הערה: השימוש באינסולין ובגורמי גדילה תלוי בתנאי תרבות התא והוא אופציונלי.</li>
		<li>החלף את המדיום של תרבות התא; לנהל שינויים בינוניים כל שנתיים עד שלושה ימים בהתאם לצפיפות התא. הערה: שימו לב לתאים המתורבית מדי יום מתחת למיקרוסקופ והקליטו את תנאי הגדילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הפסיית תא הערה: המעבר ותת-תרבות התאים, כאשר צפיפות התא הראשית מגיעה ל-60%.<ol>
<li>שטוף את התאים המתורבתיים פעמיים באמצעות ה-PBS בטמפרטורת החדר. הוסף 200 μL של טריפסין תמיסה (0.25%) לכל מנה ומתפרעים באופן ידני את המנה המבטיחה שכל התחתון מכוסה. להשליך את התמיסה טריפסין ואת התאים הדגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>שטוף את התאים עם 1.0 mL של מדיום התרבות הטרייה על ידי ליטוף והשעיית התאים מחדש. העברת 0.5 mL של השעיית התא למנה חדשה, להוסיף 1.5 mL של בינוני טרי, ו מודחת התאים ב 18 ° c. הערה: ניתן להשתמש בתאי מגרדים לאיסוף תאים כאשר פתרון טריפסין נכשל בעיכול וניתוק תאים מהמנות (קווי תא מסוימים הם דביקים מדי). עם זאת, אל תערוך את שתי השיטות בו.</li>
		<li>לשנות את המדיום לאחר 12 h ולהתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את התנאים. תרבות התאים עבור ניסיוני נוסף.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ואפופטוזיס השראה וזיהוי בתאי מעיים של הפקוניקוס
<ol><li>
תרבית תאים וטיפול דקאמת1
	<ol>
<li>הכן תאי מעיים בעקבות הפרוטוקול שהוצג קודם לכן והוסף את התאים המדרוכים לצלחת של 12-היטב בנפח תא של 2 x 106 לכל טוב.</li>
		<li>לאחר שלושה ימים בתרבות, בעקבות השלבים של "תרבות תא הבמה הראשונה", לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולהחליף את המדיום עם בינונית אופטימיזציה (ללא אנטיביוטיקה וגורמי צמיחה).</li>
		<li>לדלל dexamethone (DXMS) בתווך התרבות כדי להכין טרי 2 μM ו-200 μM הפתרונות DXMS לפני תחילת הניסויים.</li>
		<li>הוסף פתרונות DXMS בריכוזים שונים לתאים מתורבתים גדל עם אותו נפח של בינונית culturing; הגדיר שלוש קבוצות נסיוניות כולל בקרה (CTL), 1 μM ו-100 μM DXMS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת הופסט 
	<ol>
<li>שטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים לאחר הדגירה עם/ללא DXMS עבור תקופות הזמן המצוין (0 h, 24 h, ו 48 h).</li>
		<li>הוסף 300 μL של Hoechst 33258 פתרון לכל טוב לצלחת 12-באר ו דגירה ב 18 ° c עבור 30 דקות. בעדינות מתפרעים את הצלחת לכסות את כל התאים להבטיח את ההכתמים שלהם.</li>
		<li>הסר את הפתרון כתמים ולתקן את התאים על ידי הוספת 300 μL של 4% הפתרון פאראפורמלדהיד (ב PBS) לכל טוב. . מתפרעים בעדינות במשך 15 דקות זהירות: פאראפורמלדהיד הוא רעיל בינוני על ידי מגע העור או אינהלציה, והוא מיועד כנראה מסרטן אנושי סביר. מנדפים כימיים, מארזים במאזן פרקו, או אמצעי הגנה אחרים יש להשתמש במהלך שקילה וטיפול של פאראפורמלדהיד.</li>
		<li>שטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים ב-PBS. אל תמחק את ה-PBS לאחר כביסה כדי לשמור על תאים מכוסים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אנליזה מיקרוסקופית פלורסנט
	<ol>
<li>הפעל את חומרת מיקרוסקופ הפלורסנט כולל כוח המנורה הכספית, כוח הפלורסנט, והמחשב. היכנס לחשבון מערכת ההפעלה, הפעל את התוכנה ובדוק את תצורתה.</li>
		<li>הניחו את הצלחת המוכנה על מיקרוסקופ הבמה. הצב את המדגם מעל העדשה האובייקטיבית באמצעות בקר הבמה.</li>
		<li>מצא את תאי העניין מתחת למיקרוסקופ האור, עבור למיקרוסקופ פלורסנט, ולכוד את התמונות על-ידי כוונון הפרמטרים. הערה: כדי להתבונן באות פלורסנט 33258 מאוגד ל-DNA גרעינים, מיקרוסקופ ניאון צריך להתבצע עם עירור ופליטה ב כ 352 ננומטר ו 461 nm, בהתאמה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenesis+in+primary+cell+cultures+from+larvae+of+the+abalone%2C+Haliotis+rufescens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Marine+Biology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens.</a> Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).</li>
<li>Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+regeneration+and+biomineralization+in+sea+urchins%3A+role+of+Notch+signaling+and+presence+of+stem+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers.</a> Plos One. 10 (8), 0133860(2015).</li>
<li>Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptional+time-course+analysis+of+oral+vs.+aboral+whole-body+regeneration+in+the+Sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Bmc+Genomics%22%5BJournal%5D)">A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis.</a> Bmc Genomics. 17, 718(2016).</li>
<li>Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+immune+response+to+bacterial+LPS+in+the+sea+urchin+Paracentrous+lividus+%28Lamarck%2C+1816%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816).</a> Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).</li>
<li>Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+variation+in+anaerobic+energy+metabolism+reflects+hypoxia+tolerance+across+the+intertidal+and+subtidal+distribution+of+the+Pacific+oyster+%28Crassostrea+gigas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).</li>
<li>Han, G., Zhang, S., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+metabolism+and+thermal+tolerance%3A+The+importance+of+opine+pathways+on+survival+of+a+gastropod+after+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction.</a> Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+cucumber+genome+provides+insights+into+morphological+evolution+and+visceral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration.</a> PLoS Biology. 15 (10), 2003790(2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTRAQ+reveals+proteomic+changes+during+intestine+regeneration+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+D%3A+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).</li>
<li>Xu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+loss+by+apoptosis+is+involved+in+the+intestinal+degeneration+that+occurs+during+aestivation+in+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+B%3A+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).</li>
<li>Yang, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+characteristics+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29+during+aestivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).</li>
<li>Xiang, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+regulation+in+aestivation+of+the+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%3A+evidence+from+metabolite+quantification+and+rate-limiting+enzyme+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+biology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses.</a> Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feedback+loop+involving+FREP+and+NF-kappaB+regulates+the+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+mRNA-miRNA+interaction+analysis+associate+with+immune+response+of+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+based+on+transcriptome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+and+Shellfish+Immunology%22%5BJournal%5D)">Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database.</a> Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).</li>
<li>Cai, X., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+invertebrate+cell+culture%3A+a+decade+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Marine invertebrate cell culture: a decade of development.</a> Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).</li>
<li>Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Approach+to+Primary+Cell+Culture+for+Octopus+vulgaris+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons.</a> Frontiers in Physiology. 9, 220(2018).</li>
<li>Pinsino, A., Alijagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+urchin+Paracentrotus+lividus+immune+cells+in+culture%3A+formulation+of+the+appropriate+harvesting+and+culture+media+and+maintenance+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions.</a> Biology Open. 8 (3), (2019).</li>
<li>Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+holothurian+tissues+as+a+source+of+cells+for+long-term+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures.</a> Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).</li>
<li>Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+Molecular+Mechanisms+and+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Excli+Journal%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity.</a> Excli Journal. 8, 155-181 (2009).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+proliferation%2C+and+morphology+during+vein+graft+remodeling+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits.</a> Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).</li>
<li>Kasibhatla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+suspension+cells+with+hoechst+33258+to+detect+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).</li>
<li>Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+long-term%2C+high-dose+dexamethasone+administration+on+proliferation+and+apoptosis+in+porcine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes.</a> Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).</li>
<li>Rinkevich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+marine+invertebrates%3A+new+insights+for+capturing+endless+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness.</a> Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).</li>
<li>Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cell+cultures+of+regenerating+holothurian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues.</a> Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+water+temperature+on+the+growth+and+fatty+acid+profiles+of+juvenile+sea+cucumber+Apostichopus+japonicus+%28Selenka%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thermal+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka).</a> Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

מאמצי מחקר נרחבים הקדישו להקמת קווי תאים בעשורים האחרונים, עם זאת, עדיין קשה לבצע התקדמות בתרבות ארוכת טווח של תאים מחסרי חוליות ימיים14,22. דווח כי תאים מתורבתים מליצור מתחדשות רקמות הולותאנית היו קיימא לתקופה ארוכה של זמן ופעילות גבוהה של התפשטות ניתן לזהות תאים ספציפיים17,23. עם זאת, עבור תאים רגילים חסרי חוליות ימיים, יש עדיין לא מעשית גישה לתרבות התא תוארה. הפרוטוקול המוצג כאן מספק שיטה יעילה ובעלת ש...

התאים המוגמרים בתנאים מלאכותיים, ולא בסביבתם הטבעית, מספקים חומרים ניסיוניים אחידים למחקרים ביולוגיים, במיוחד למינים שאינם יכולים להיות מתורבתים בקלות בסביבת מעבדה. בחשבון של יותר מ -30% מכלל המינים בעלי החיים הימיים,והם מספקיםחומרים ביולוגיים רבים למחקר התחייבות על מנגנוני הרגולציה של תהליכים ביולוגיים ספציפיים, כגון התחדשות2,3, לחץ התגובה4, והסתגלות סביבתית5,6.
מלפפון-ים האפוסטיקוס, הוא אחד מזני הקווצי הנלמדים ביותר הנמצאים במים ממוזגים לאורך החוף הצפוני של האוקיאנוס השקט. הוא ידוע גם כמינים חשובים מבחינה מסחרית ולחקלאות בקנה מידה גדול במזרח אסיה, בעיקר בסין7. שאלות מדעיות רבות לגבי היפנים, כולל מנגנוני הרגולציה שבבסיס התחדשות המעיים לאחר הוצאת המעיים8 וניוון בשנת9, בקרה מטבולית10,11, התגובה החיסונית12,13 תחת תרמי או פתוגניים מדגיש, משכו את תשומת לבם של חוקרים. עם זאת, בהשוואה לבעלי חיים מדגם היטב, מחקר בסיסי, בעיקר במישור הסלולר, מוגבל על-ידי צווארי בקבוק טכניים, כגון חוסר שיטות מתקדמות בתרבות התא.
החוקרים הקדישו מאמץ רב להקמת קווי תאים, אבל הם גם התמודד עם אתגרים רבים ולא קו התאים של כל חסרי חוליות ימיים הוקמה עדיין14. עם זאת, תרבויות התאים הראשוניים של חסרי חוליות ימיים מתקדמים בעשורים האחרונים15,16, והם סיפקו הזדמנות לניסויים ברמה התאית. לדוגמה, האינטסינוס הניתן ליצירה מתוך מקור הפקוניקוס נוצל כמקור תאים לתרביות תאים לטווח ארוך שסיפקו שיטה מעשית לתרבות התא הראשונית של חסרי חוליות ימיים17. פרוטוקול זה משולב ואופטימיזציה חסרי חוליות התרבות התאים מתקרב ופיתח שיטת התרבות הראשית מתאים באופן נרחב עבור מלפפון ים או חסרי חוליות ימיים אחרים.
אפופטוזיס היא תוכנית התאבדות התא הפנימי המופעל על ידי שונים הגירויים אנסוגני ואנדוגניים. אפופטוזיס מתואמת הוא חיוני למערכות ביולוגיות רבות18,19, וזה היה מעורב רגרסיה המעי של מלפפון ים במהלך הזמן הנכון9. כדי לחקור את תהליך האפוטוטיק באורגניזמים של עניין, סדרה של שיטות, כולל כתמים הוקוסט ומיקרוסקופיה, הוקמו והוחלו בהצלחה20. כאן, אנו מתנהל ואפופטוזיס השראה ואיתור בתאי המעי העיקרי תרבותי של מלפפון ים כדי להעריך את השימושיות של תאים ראשוניים במחקרים ביולוגיים של חסרי חוליות ימיים. Dexamethasone, אחד הנפוצים בשימוש גלוקוקורטיקוסטרואידים21, שימש כדי לגרום אפופטוזיס בתאי מעיים מתורבת מלפפון ים, ואות הופסט משמעותי 33258 התגלתה בהצלחה בתאי הכתמים על ידי מיקרוסקופ פלורסנט.

<table><tbody><tr><td>0.1 &mu; מסנן m</td><td>Millipore</td><td>SLVV033RS</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin</td><td>Genom</td><td>GNM25200</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m filter</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>4 ס"מ כלים</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0124</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פרפורמלדהיד 4%</td><td>סינופארם ריאגנט כימי</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>בצנטריפוגות PBS ספסל</td><td>בקמן</td><td>אלגרה X-30R</td><td></td></tr><tr><td>ערכת BeyoClick EdU-488</td><td>Beyotime</td><td>C0071S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>סינופארם מגיב כימי</td><td>10005817</td><td></td></tr><tr><td>חממה בטמפרטורה קבועה</td><td>Lucky Riptile</td><td>HN-3</td><td></td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>סינופארם מגיב כימי</td><td>XW00500221</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים תרמוסטטי חשמלי</td><td>senxin17</td><td>DK-S28</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סינופארם מגיב כימי</td><td>80176961</td><td>75%</td></tr> <tr><td>גורם גדילה פיברובלסטי (FGF)</td> <td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica DMI3000B</td><td>DMI3000B</td><td></td></tr><tr><td>מגיב כימי גרמיצין</td><td>סינופארם מגיב כימי</td><td>XW14054101</td><td></td></tr><tr><td>מגיב כימי גלוקוז</td><td>סינופארם</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33258 תמיסת צביעה</td><td>Beyotime</td><td>C1017</td><td></td></tr><tr><td>מגיב כימי אינסולין</td><td>סינופארם</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XW1106168001 גורם גדילה דמוי אינסולין (IGF)</td> <td>PEPROTECH</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>מגיב כימי סינופארם</td><td>10016308</td><td></td></tr><tr><td>L-15</td><td>Genom</td><td>GNM41300</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין (100 מ"ג/מ"ל)</td> <td>Genom</td><td>GNM-21051</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm מגיב</td> <td>כימי</td><td></td>XW77863031</tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Sinopharm מגיב כימי</td><td>10020518</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סינופארם</td> מגיב כימי <td>10019308</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm מגיב כימי</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1020</td><td>pH7.2-7.4</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Genom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GNM15140 מד PH</td><td>Bante</td><td>A120</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>SIGMA</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>VE</td><td>185791</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ואפופטוזיס השראה ואיתור בתרבות העיקרית של מלפפונים בתאי מעיים ים

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

תאים מתורבתים ראשוניים משמשים במגוון דיסציפלינות מדעיות ככלים חשובים במיוחד להערכה פונקציונלית של חומרים ביולוגיים או אפיון של פעילויות ביולוגיות ספציפיות. עם זאת, בשל היעדר התקשורת האוניברסלית הישימה של תרבות התא ופרוטוקולים, תיאר היטב שיטות התרבות תאים עבור אורגניזמים ימיים עדיין מוגבלים. בינתיים, הזיהום הנפוץ ביותר של חיידקים ותכונות פוליטרופי של התאים החסרי חוליות ימיים עוד לעכב את הקמת האסטרטגיה האפקטיבית תרבות התא עבור חסרי חוליות ימיים. כאן, אנו מתארים שיטה קלה לטפל לתאי מעיים culturing מלפפון ים האפוסטיקוס; בנוסף, אנו מספקים דוגמה האינדוקציה ואפופטוזיס מבחנה ואיתור בתאי המעי העיקריים תרבותי. כמו-כן, ניסוי זה מספק פרטים אודות השיטה המתאימה ביותר לאוסף התרבות ולאיסוף התאים. הפרוטוקול המתואר מתאים למגוון של דגימות רקמה בהיקף נרחב מאורגניזמים ימיים, כולל קווקדרפה, מוללוסקה וסרטנים, והוא יכול לספק תאים מספיקים עבור מספר יישומים ניסיוניים בעלי מבחנה. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לטפל ביעילות בתרבויות התאים הראשוניים מחסרי חוליות ימיים ולהקל על הערכה פונקציונלית של חומרים ביולוגיים ייעודיים על תאים.

כאן, הקמנו את התרבות הראשית של תאי המעי . איור 1 מראה תאים עגולים בשלבים שונים של culturing. ו-EdU מכתים לספק ראיות ישירות כדי לחשוף את הפעילות ההתרבות של התאים העגולים האלה בשלב מאוחר יותר (איור 2). אנחנו גם קצת להתאים את הפרוטוקול, culturing בלוקים הרקמה הקצוצה במקום תאים filtrated; יתרה מזאת, סוג תא ציר עשוי להיות מתורבת בהצלחה. סוג תא זה התרחש סביב בלוקים רקמת המעיים יכול להיות נצפתה לאחר ארבעה ימים של תרבות; עם זאת, הוא לא הצליח להיות מיושן (<stron...

פרוטוקול זה מספק שיטה קלה לאחיזה לתרבות תאי המעיים ממלפפון המים האפוסטיקוס והיא מתאימה למגוון של דגימות רקמה בהיקף נרחב מאורגניזמים ימיים, כולל קווקדרפה, מולסקה וסרטנים.

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

הפרוטוקול מספק שיטת תרבות תאים ראשית קלה לטיפול ותואמת באופן נרחב עבור חסרי חוליות ימיים. טכניקה זו נותנת לחוקרים דרך לתרבת את התאים חסרי החוליות הימיים במשך זמן רב יחסית. תרבות של תאים צריכה להיות מסופקת עם רקע גנטי עקבי עבור יישומים ניסיוניים ביולוגיים נוספים שונים במחקר ביולוגיה ימית.למחקר החדש בתחום זה, אנו מאמינים כי הפרוטוקול המפושט המצוין צריך להיות הבחירה הטובה לממש. לאחר הרדמה, לנתח ולאסוף את המעיים הפנימיים, ולאחר מכן לפצל את דגימות הרקמה אנכית ולהסיר את התוכן הפנימי. לשטוף את דגימות הרקמה PBS פעמיים לחטא אותם על ידי טבילה בתתבון 75%אתנול במשך לא יותר משתי שניות.ואז לשטוף את דגימות הרקמה PBS שלוש פעמים כדי להסיר את האתנול, ולהעביר כ 100 מיליגרם של דגימת רקמה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי שני מיליליטר. מוסיפים 1.5 מיליליטר של מדיום תרבות ממוטב מראש לגוש רקמת המעי של מלפפון הים וטחון את הבלוק במספריים כירורגיים מעוקרים עד שהפתרון מעונן. הוסף 400 מיקרוליטרים של 0.25%טריפסין.מערבבים את הפתרון על ידי היפוך ו דגירה אותו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לסנן את הפתרון באמצעות מסננת תא 100 מיקרון ולאסוף את הסינון בצינור צנטריפוגה מיקרו סטרילי חדש שני מיליליטר. עבור פרוטוקול אופציונלי פשוט, בלוקים רקמות לחתוך במדיה מתורבתת ניתן להעביר ישירות לתוך כלים ולאחר מכן דגירה.צנט

apoptosis-induction-detection-primary-culture-sea-cucumber-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים פרוטוקול פשוט לדמיין אזורים של מות תאים מתוכן (PCD) בעוברי עכברים ומבדילים (ES) תרבויות תאי גזע עובריות באמצעות צבע מסיס מאוד בשם LysoTracker.

שימוש בLysoTracker לזהות מות תאים מתוכנים בעוברים ומיון תאי גזע עובריים

הפרעות גנטיות מסוימות או חשיפה לרעלים עלולות לשבש תהליכי התפתחות תקינים ולהוביל למוות של סוגי תאים ספציפיים. הניתוח של Caspase 3 המופעל על ידי אימונופלואורסצנציה שלמה בעוברי דג הזברה חושף לוקליזציה ספציפית לשלב ולרקמות של תאים העוברים אפופטוזיס באופן ספציפי.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

המונח אנסטאזיס מתייחס לתופעה שבה תאים גוססים הופכים תהליך התאבדות של תאים בשלב מאוחר, מתקנים את עצמם ובסופו של דבר שורדים. כאן אנו מדגימים פרוטוקולים לאיתור ומעקב אחר תאים שעוברים אנסטאזיס.

אסטרטגיות למעקב Anastasis, תופעת הישרדות תא שהיפוך אפופטוזיס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת אירועי איתות תוך-תאיים המושרים בתאים ברי קיימא על ידי אינטראקציה פיזית עם תאים מתים או גוססים סמוכים. הפרוטוקול מתמקד באירועי איתות המושרים על ידי זיהוי בתיווך קולטנים של התאים המתים, בניגוד לספיגה הפגוציטית שלהם או שחרור של מתווכים מסיסים.

זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

זרימת עבודה באמצעות צנטריפוגה לזרום cytometry או דיפרנציאלית מפותחת לזהות, לבודד את הגופות אפופטוטיים להיפגע מן דוגמה אפופטוטיים להיפגע טוהר גבוהה לכמת.

זיהוי ובידוד של מוות לגופים טוהר גבוהה

נתאר כאן פרוטוקול לחקור cytotoxicity של טרום הופעל CD8+ T תאים נגד תאים סרטניים על ידי גילוי אפופטוטיים להיפגע סרטן תאים באמצעות בזמן אמת מיקרוסקופ. פרוטוקול זה יכול לחקור מנגנונים מאחורי מיאלואידית הנוצרות על-ידי תאי T cell דיכוי והערכת תרכובות שמטרתה חידוש תאי T באמצעות המצור של תאים חיסוניים מיאלואידית מדכאים.

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להכין thymocytes, מקרופאגים הצפק ולנתח את היעילות של efferocytosis ואת החסימה בתיווך מעכבי של האפוטוציטים thymocytes שתבלע. פרוטוקול זה יש יישום נרחב בסיווג התא-תיווך של חלקיקים אחרים כולל חרוזים מלאכותיים וחיידקים.

אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים

הפרוטוקול המוצג משתמש cy, לנסות לכמת את מספר התאים מתרבים ומתים בתוך העכבר התרבותי enteroids. שיטה זו שימושית להערכת ההשפעות של טיפול תרופתי בשגשוג והישרדות של אורגנואיד.

קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids

פרוטוקול זה מתאר מודל אנטרוקוליטיס נמקית (NEC)-בצלחת המשתמש באנטרוואידים של המעי הדק עם קוטביות הפוכה, ומאפשר גישה למשטח האפיקלי. אנו מספקים פרוטוקול צביעה אימונופלואורסצנטי לזיהוי הפרעה אפיתליאלית הקשורה ל- NEC ושיטה לקביעת הכדאיות של אנטרואידים אפיקליים הנתונים לפרוטוקול NEC-in-a-dish.

במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית לחקור ולכמת מוות תאי באורגנואידים אנושיים של המעי הגס בתגובה להפרעות ציטוטוקסיות כגון ציטוקינים. הגישה משתמשת בצבע מוות פלואורסצנטי של תאים (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), במיקרוסקופ פלואורסצנטי חי ובתוכנת ניתוח תמונות בקוד פתוח כדי לכמת תגובות אורגנואיד יחיד לגירויים ציטוטוקסיים.

כימות מוות תאי הנגרם על ידי ציטוקינים באורגנואידים של המעי הגס האנושי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי

למד פרוטוקול תרבית תאים ראשונית למעיים של Apostichopus japonicus. שיטה זו מאפשרת גידול לטווח ארוך של תאי חסרי חוליות ימיים לחקר ביולוגיה ימית ומחקרים גנטיים.

ואפופטוזיס השראה ואיתור בתרבות העיקרית של מלפפונים בתאי מעיים ים

גלה סרטונים נוספים