Name: הערכת הרעלת שאיפת חריפה של חלקיקי מוטס על ידי חשיפת תאי ריאה אנושיים בממשק האוויר-נוזלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למדו הערכת רעילות ריאתית חריפה של חלקיקים מוטסים באמצעות חשיפת תאי ריאה אנושיים בממשק אוויר-נוזלי. שיטה זו מפחיתה ניסויים בבעלי חיים ומספקת הערכה אמינה של סיכוני שאיפה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי משרד החינוך והמחקר הגרמני (Bundesministerium ger בילדונג ו Forschung, BMBF, גרמניה (גרנט 031A581, תת-פרוייקט A-D)) ועל ידי הקרן המחקר הגרמני (דויטשה פורשונגסגסםהסלבירכתיים, DFG, מחקר קבוצת הדרכה GRK 2338).

<ol><li>Faber, S. C., McCullough, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Through+the+Looking+Glass%3A+In+vitro+Models+for+Inhalation+Toxicology+and+Interindividual+Variability+in+the+Airway%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+In+vitro+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).</li>
<li>Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 (2018).</li>
<li>De Matteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+new+challenges+in+occupational+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Review%22%5BJournal%5D)">Current and new challenges in occupational lung diseases.</a> European Respiratory Review. 26 (146), 1-15 (2017).</li>
<li>LANUV Nordrhein-Westfalen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gesundheitliche+Risiken+von+Nanomaterialien+nach+inhalativer+Aufnahme%22">Gesundheitliche Risiken von Nanomaterialien nach inhalativer Aufnahme</a>. , (2009).</li>
<li>Bérubé, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Models+of+Inhalation+Toxicity+and+Disease.+The+report+of+a+FRAME+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+To+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">In vitro Models of Inhalation Toxicity and Disease. The report of a FRAME workshop.</a> Alternatives To Laboratory Animals. 37 (1), 89-141 (2009).</li>
<li>Lopez, A. D., Murray, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+disease%2C+1990-2020%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The global burden of disease, 1990-2020.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1241-1243 (1998).</li>
<li>Clippinger, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+approaches+for+acute+inhalation+toxicity+testing+to+address+global+regulatory+and+non-regulatory+data+requirements%3A+An+international+workshop+report%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+vitro%22%5BJournal%5D)">Alternative approaches for acute inhalation toxicity testing to address global regulatory and non-regulatory data requirements: An international workshop report.</a> Toxicology In vitro. 48, 53-70 (2018).</li>
<li>Agrawal, M. R., Winder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+Occurrence+of+LD50+Values+for+Materials+in+the+Workplace%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Frequency and Occurrence of LD50 Values for Materials in the Workplace.</a> Journal Of Applied Toxicology. 16 (5), 407-422 (1996).</li>
<li>Amtsblatt der Europäischen Union. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verordnung+%28EG%29+Nr.+1907%2F2006+des+Europ%C3%A4ischen+Parlaments+und+des+Rates%5BTitle%5D)+AND+%22Europ%C3%A4ische+Union%22%5BJournal%5D)">Verordnung (EG) Nr. 1907/2006 des Europäischen Parlaments und des Rates.</a> Europäische Union. 860, (2006).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+Organ-Level+Lung+Functions+on+a+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Human+Lung+Slices+in+Toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Human+and+Experimental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Use of Human Lung Slices in Toxicology.</a> Human and Experimental Toxicology. 13 (7), 466-471 (1994).</li>
<li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+Oxidative+Stress+Responses+of+an+Alveolar+Epithelial+Cell+Line+to+Airborne+Zinc+Oxide+Nanoparticles+at+the+Air-Liquid+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 12, (2013).</li>
<li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+as+an+in+vitro+exposure+method+to+assess+acute+pulmonary+toxicity+of+fine+dusts+and+nanoparticles+with+special+focus+on+the+intra-+and+inter-laboratory+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Use of the CULTEX Radial Flow System as an in vitro exposure method to assess acute pulmonary toxicity of fine dusts and nanoparticles with special focus on the intra- and inter-laboratory reproducibility.</a> Chemico-Biological Interactions. 206 (3), 479-490 (2013).</li>
<li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air-Liquid+Interface+In+vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+In+vitro+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Air-Liquid Interface In vitro Models for Respiratory Toxicology Research.</a> Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li>
<li>Eskes, C., Whelan, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEskes%2C+C+%22Validation+of+Alternative+Methods+for+Toxicity+Testing%22">Validation of Alternative Methods for Toxicity Testing</a>. 418, Springer International Publishing. (2016).</li>
<li>Rach, J., Budde, J., Möhle, N., Aufderheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+exposure+at+the+air-liquid+interface%3A+Evaluation+of+an+in+vitro+approach+for+simulating+inhalation+of+airborne+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Direct exposure at the air-liquid interface: Evaluation of an in vitro approach for simulating inhalation of airborne substances.</a> Journal Of Applied Toxicology. 34 (5), 506-515 (2014).</li>
<li>Aufderheide, M., Halter, B., Möhle, N., Hochrainer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CULTEX+RFS%3A+A+comprehensive+Technical+Approach+for+the+In+vitro+Exposure+of+Airway+Epithelial+Cells+to+the+Particulate+Matter+at+the+Air-Liquid+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">The CULTEX RFS: A comprehensive Technical Approach for the In vitro Exposure of Airway Epithelial Cells to the Particulate Matter at the Air-Liquid Interface.</a> Biomed Research International. 15, (2013).</li>
<li>Lieber, M., Todaro, G., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+tumor-cell+line+from+a+human+lung+carcinoma+with+properties+of+type+II+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells.</a> International Journal Of Cancer. 17 (1), 62-70 (1976).</li>
<li>Carterson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A549+lung+epithelial+cells+grown+as+three-dimensional+aggregates%3A+Alternative+tissue+culture+model+for+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+And+Immunity%22%5BJournal%5D)">A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: Alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection And Immunity. 73 (2), 1129-1140 (2005).</li>
<li>Kim, K. J., Borok, Z., Crandall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+useful+in+vitro+model+for+transport+studies+of+alveolar+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">A useful in vitro model for transport studies of alveolar epithelial barrier.</a> Pharmaceutical Research. 18 (3), 253-255 (2001).</li>
<li>OECD. Test No. 403: Acute Inhalation Toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+4%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4</a>. , OECD Publishing. Paris. (2009).</li>
<li>OECD. Test No. 436: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+4%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4</a>. , OECD Publishing. Paris. (2009).</li>
<li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+for+the+assessment+of+the+acute+inhalation+toxicity+of+airborne+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+vitro%22%5BJournal%5D)">Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles.</a> Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).</li>
<li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+exposure+system+generating+nebulized+aerosol+of+sulfur+mustard+in+comparison+to+the+standard+submerse+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure.</a> Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Johns Hopkins School of Public Health. http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (1959).</li>
<li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+CULTEX+radial+flow+system+for+in+vitro+investigation+of+lung+damaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents.</a> Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).</li>
<li>Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li>
<li>OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+4%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4</a>. , OECD Publishing. Paris. (2018).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidance+Document+on+Inhalation+Toxicity+Studies%22">Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies</a>. , OECD Publishing. Paris. (2018).</li>
</ol>

המחברים AT, ק ג, AB, SH, HM, TG, HT ו-DS אין מה לחשוף. החברה Cultex טכנולוגיה GmbH (לשעבר מעבדות Cultex GmbH) מייצרת מכשירים (g., CULTEX RFS, CULTEX DG) בשימוש במאמר זה. NM הייתה עובדת של GmbH מעבדות Cultex במהלך המחקר הזה. בסדר הוא עובד של Cultex הטכנולוגיה GmbH (לשעבר מעבדות Cultex GmbH). PCT פטנט/EP2009/007054 עבור המכשיר הוא להחזיק על ידי מייסד הטכנולוגיה Cultex GmbH פרופ ' ד ר אולריך Mohr (לשעבר מעבדות Cultex GmbH).

מודלים רבים של הרעלת שאיפת בעלי חיים לא פותחו בשנים האחרונות על מנת לקבל מידע על מפגעי האינהלציה החריפה של חלקיקי שאיפה ולהפחית ולהחליף ניסויים בבעלי חיים על פי עיקרון ה-3R25.
במונחים של מודלים של תרבות התא, חשיפה של תאים ניתן לבצע בתנאים מתחת לאור או ב-ALI. חשיפת התאים בתנאים שמתחת לתחתית עלולה להשפיע על התכונות הפיזיקאלית-כימיות ולכן התכונות הרעילות של חומר מבחן12. לעומת זאת, במודלים של עלי שאיפת מבחנה, מחקים את מצב החשיפה האנושית עם דמיון ביול...

האינהלציה של חלקיקים רעילים מוטס היא דאגה לבריאות הציבור, המובילה להמון סיכונים בריאותיים ברחבי העולם ומיליוני מקרי מוות מדי שנה1,2. שינוי האקלים, הפיתוח התעשייתי המתמשך והביקוש העולה לאנרגיה, מוצרי חקלאות וצרכן תרמו לגידול מחלות הריאות בשנים האחרונות3,4,5,6. ידע והערכה של חומרים הניתנים לאינהלציה בנוגע לרעילות האינהלציה החריפה שלהם, מספקים את הבסיס להערכת סיכונים ולניהול סיכוני, אך מידע זה עדיין חסר במגוון רחב של חומרים אלה7,8. מאז 2006, החקיקה הכימית של האיחוד האירופי (רישום, הערכה, מתן הרשאות והגבלת כימיקלים) דורשת שמוצרים קיימים וחדשים שכבר עוברים אפיון של הרעילות, כולל תוואי האינהלציה לפני ההנחה בשוק. לכן, הגעה מתמקדת בשיטות חלופיות וחופשיות לבעלי חיים, יישום העיקרון "3R" (החלפה, עידון והפחתה של ניסויים בבעלי חיים) והשימוש המתאים במודלים של חוץ גופית9. בשנים האחרונות, שונים והולמים שאינם בעלי חיים הרעלה רעילות מודלים (g., בתרביות תאים מחוץ למים, מודלים של ריאה על שבב, מדויק לגזור פרוסות ריאה (pcls)) פותחו על מנת להעריך את רעילות האינהלציה חריפה של חלקיקים מוטס5,7,10,11. במונחים של מודלים של תרבות תא מבחנה, תאים מעובדים ניתן לחשוף בתנאים מתחת לאור או ב-ALI (איור 1). עם זאת, את תוקפו של מחקרים חשיפה שקוע מוגבלת ביחס להערכת רעילות של תרכובות מוטס חלקיקים בעיקר. טכניקות חשיפה מתחת לגוף אינן מתאימות לאדם במצב vivo; המדיום של תרבות התא המכסה את התאים עלול להשפיע על המאפיינים פיזיקאלית-כימיים ולכן, את התכונות הרעילות של חומר מבחן12,13. עלי במודלים של שאיפת חוץ גופית מאפשרים חשיפה ישירה של תאים לחומרים בדיקה ללא הפרעה של מדיום התרבות התא עם חלקיקי מבחן, ובכך, מחקה את החשיפה האנושית עם דמיון פיזיולוגי וביולוגי גבוה יותר מאשר כיווני אויר12,14.
לתהליכים הרגולטורים כגון הגעה, לעומת זאת, רק דגמי בעלי חיים זמינים בתחום הרעלים החריפים, משום שאין אלטרנטיבה בשיטות החוץ-גופית שאושרו מספיק והתקבלו באופן רשמי עד כה14. לשם כך, יש לאמת את המודלים הבסיסיים בהתאם לדרישות המעבדה להתייחסות לאיחוד האירופי לחלופות לבדיקות בעלי חיים (EURL-ECVAM) על חוקיות הבדיקה15.
מחקר טרום-אימות לשעבר ומחקר אימות שהושלם לאחרונה הפגינו בהצלחה את אזור היישום של מערכת החשיפה CULTEX RFS ואת ההעברה, היציבות והיכולת להיות בלתי מנוצח13. מערכת חשיפה זו היא מערכת חשיפה מבוססת תא מחוץ למערכת המאפשרת חשיפה הומוגנית של תאים לגזים, חלקיקים או אטמוספרות מורכבות (למשל, עשן סיגריות) בבית עלי בשל קונספט הפצת התרסיס הרדיאלי שלה וההולכה של תרסיס הבדיקה בזרימה רציפה על התאים16. המודול הבסיסי של מערכת הזרימה הרדיאלי הזאת מורכב ממתאם האוויר, המודול המנחה את התרסיס עם התפלגות התרסיס הרדיאלי, מודול הדגימה והשקע, ומודול נעילה עם גלגל יד (איור 2). החלקיקים שנוצר להגיע לתאים באמצעות מתאם מפרץ ומודול המנחה תרסיס ומופקד על מוסיף תרבות התא, אשר ממוקמים בשלושה מסודרים רדיוally חדרי החשיפה של מודול הדגימה. המודול המנחה תרסיס, כמו גם מודול הדגימה יכול להיות מחומם על ידי התחברות לאמבטיה מים חיצוניים17.
במסגרת שני המחקרים, השתמשו בתאי A549 לכל ניסויי החשיפה. קו התא A549 הוא קו האפיתל מונצח האנושי כי הוא מאופיין היטב, שימש מודל בלתי מתורבת עבור סוג II מכתשיים האפיתל במחקרים רבים לאחר הרעילות. התאים מאופיינים בגופים מלוניים, הפקת חומרים מקצועיים ומספר גורמים הרלוונטיים לדלקת,18. הם גם מראים מאפיינים של תאים אפיתל ברונכיט בשל ייצור ריר שלהם19. יתר על כן, הם יכולים להיות מתורבתים ב-ALI. למרות שהקו הנייד הזה חסר בבניית קשרים סלולריים, הטיפוח של תאים אלה הוא הרבה יותר נוח, פחות עלות יקרה ותוצאות שנגזרות מהם אינן תלויות ביחס לתאים הראשוניים20.
A549 תאים שופרה בשנת 6-היטב התרבות תאים מוסיף (קרום PET, 4.67 ס מ2, הנקבוביות גודל 0.4 מ"מ) עם צפיפות של 3.0 x 105 תאים לכל הוספה ומעובד עבור 24 h תחת תנאים שקועים. תאים נחשפו לאחר מכן בשלוש מעבדות עצמאיות כדי לנקות אוויר ושלוש מינונים חשיפה שונים (25, 50, ו 100 μg/cm2) של 20 חומרי בדיקה ב-ALI. מינון החשיפה מתואם את זמן התצהיר וכתוצאה מכך שיעור חלקיקים קבוע של 25 μg/ס"מ2, 50 μg/cm2 ו 100 μg/cm2 על התאים לאחר 15, 30 או 60 min, בהתאמה. החלקיקים שהופקדו, לעומת זאת, לא נשטפו לאחר התצהיר, אך נשארו על התאים במשך 24 שעות. זמני התצהיר של החלקיקים היו אפוא 15, 30 ו 60 דקות, אבל החשיפה של התאים נמשך 24 h בסך הכל. שיעור התצהיר של חומרי הניסוי נקבע בניסויים ראשוניים על פי שיטות קודמות17.
באמצעות הכדאיות של התאים כאינדיקציה לרעילות הוערך 24 שעות לאחר תצהיר החלקיקים באמצעות שיטת הכדאיות של התא. מיקוד מיוחד הוגדר על איכות של בקרות אוויר נקי, אופטימיזציה ועידון של פרוטוקול החשיפה, מחדש הפנים והבין מעבדה ה, הקמת מודל חיזוי (PM). חומרים שהובילו לירידה של הכדאיות התאית מתחת 50% (PM 50%) או 75% (PM 75%) בכל אחת משלוש מנות החשיפה נחשבו לפגעי שאיפת חריפה. התוצאות הושוו לקיים בנתונים vivo (מבוסס על לפחות מחקר אמין אחד על פי מבחן ה-OECD מנחה (tg) 403 או tg 43621,22), המוביל לקונקורדנציה כוללת של 85%, עם ספציפיות של 83% ורגישות של 88%23.
מלבד המדידה של הכדאיות התא, נקודות קצה אחרות כגון שחרור ציטוקינים, בדיקת שלמות התא או ממברנה באמצעות שיטת ldh ניתן להעריך אך לא נדרשו עבור מחקר אימות. לפיכך, מערכת החשיפה (למשל, CULTEX RFS) הוכחה כמערכת סינון חזוי להערכה האיכותית של רעילות האינהלציה החריפה של החלקיקים המוטסים שנבדקו, המייצגים שיטה חלופית מבטיחה לניסויים בבעלי חיים. הפרוטוקול הבא מומלץ לניסויים בחשיפה לחלקיקים מוטס באמצעות מערכת חשיפה זו.

<table><tbody><tr><td><חזק>תאים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td><חזק>מדיום תרבית תאים ואספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ביוכרום, ברלין, גרמניה</td><td>FG 0415</td><td>משמש כמדיום גידול</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Invitrogen, דרמשטדט, גרמניה</td><td>22320</td><td>משמש כמדיום חשיפה</td></tr><tr><td>FBS superior</td><td>Biochrom, ברלין, גרמניה</td><td>S 0615</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin (10 מ"ג/מ"ל)</td><td>Biochrom, ברלין, גרמניה</td><td>A 2710</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Th. Geyer, Renningen, גרמניה</td><td>L 0180</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom, ברלין, גרמניה</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)</td><td>Biochrom, ברלין, גרמניה</td><td>L 2143</td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומר תרבית תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY כוסות</td><td>Roche Diagnostic GmbH, מנהיים, גרמניה</td><td>REF 05651794</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים</td><td>קורנינג, ויסבאדן, גרמניה</td><td>3516</td><td>צלחות 6 & ביישנות;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> צלחות באר; 0.4 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASYton</td><td>Roche Diagnostic GmbH, מנהיים, גרמניה</td><td>REF 05651808001</td><td></td></tr><tr><td>אוויר דחוס (DIN EN 12021)</td><td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&szlig; heim, גרמניה</td><td>2290152</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Abcam, קיימברידג', בריטניה</td><td>ab155902</td><td></td></tr><tr><td>Instruments + equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY Cell Counter</td><td>Sch&auml; rfe System GmbH, רויטלינגן, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרמוסטט זרימה</td><td>LAUDA, Lauda-K&ouml; nigshofen, גרמניה</td><td>Ecoline RE 100</td><td></td></tr><tr><td>CULTEX HyP - מכבש הידראולי</td><td>Cultex&reg; Technology GmbH, הנובר, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX להכניס שרוול</td><td>Cultex&reg; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX RFS - מערכת זרימה רדיאלית סוג 2 (מודול לחשיפת חלקיקים)</td><td>Cultex&reg; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX RFS - מערכת זרימה רדיאלית סוג 2 (מודול לחשיפה לאוויר נקי)</td> <td>Cultex&reg; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX אספקת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקר זרימה 0-30 מ"ל/דקה (IQ-Flow)</td>בקר זרימה <td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0-1,5 ליטר/דקה (EL-Flow)</td><td>מסנני Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(גדולים)</td><td>Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, גרמניה</td><td>LP-050</td><td>Munktell מסנן סטרילי; יעילות שימור חלקיקים > 99,999%</td></tr> <tr><td>מסננים (קטנים)</td> <td>Parker Hannifin Corporation, מיינץ, גרמניה</td><td>9933-05-DQ</td><td>מסנן חד פעמי Balston</td></tr><tr><td>משאבה בינונית</td><td>Cole-Parmer GmbH, ורטהיים, גרמניה</td><td>Ismatec IPC מתקן רב ערוצי דיוק גבוה</td><td>משאבה פריסטלטית דיגיטלית</td></tr><tr><td>קורא Microplate Infinite M200 Pro</td><td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>משאבת Vakuum</td><td>KNF, פרייבורג, גרמניה</td><td>N86 KT.18</td><td></td></tr><tr><td>V&ouml; בקר זרימת מסה gtlin 0,2-10 ליטר לדקה</td><td>TrigasFI GmbH</td><td>V&ouml; ווסת קומפקטי gtlin אדום-y, מס' טיפוסי: GCR-C3SA-BA20</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>LAUDA, Lauda-K&ouml; nigshofen, גרמניה</td><td>Ecoline Staredition RE 104</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת הרעלת שאיפת חריפה של חלקיקי מוטס על ידי חשיפת תאי ריאה אנושיים בממשק האוויר-נוזלי

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

כאן, אנו מציגים מודולרי מעוצב במיוחד במערכת חשיפה מחוץ לגוף המאפשרת חשיפה הומוגנית של תאי הריאה האנושיים מעובדים על ALI לגזים, חלקיקים או אטמוספרות מורכבות (למשל, עשן סיגריות), ובכך לספק פיסיולוגיים מציאותיים חשיפת המשטח האפיפיורי של האזור האנושי הכתשיים לאוויר. בניגוד מודלים חשיפה רציפים עם הדרכה תרסיס ליניארי, העיצוב המודולרי של מערכת הזרימה הרדיאלי עונה על כל הדרישות של הדור המתמשך והובלה של אווירת הבדיקה לתאים, התפלגות הומוגנית והפקדת את החלקיקים ואת ההסרה הרציפה של האטמוספירה. שיטת חשיפה זו מיועדת בעיקר לחשיפת תאים לחלקיקים מוטס, אך ניתן להתאים לחשיפה של אירוסולים נוזליים וגזים רעילים ואגרסיביים מאוד בהתאם לשיטת הדור התרסיס ולחומר של מודולי החשיפה .
במסגרת מחקר אימות שהושלם לאחרונה, מערכת חשיפה זו הוכחה כשיטת הקרנה להעברה, מוכחות וחזוי להערכת האיכות של רעילות הריאות חריפה של חלקיקים מוטס, ובכך שעלולים להפחית או להחליף ניסויים בבעלי חיים שבדרך כלל יספקו את ההערכה הטוקסיולוגית הזאת.

CULTEX RFS הוא מודולרי תוכנן במיוחד מערכת חשיפה מחוץ למערכת המאפשרת חשיפה ישירה והומוגנית של תאים ב-ALI. במסגרת מחקר טרום-אימות לשעבר, הישימות הכללית של מערכת החשיפה הזאת והיכולת שלה, היציבות והתוכסות הוכחו בהצלחה. בפרויקט מחקר שנערך לאחרונה במימון משרד החינוך והמחקר הגרמני, מערכת החשיפה אומתה בהצלחה והוקמה כמודל חיזוי (PM) עבור מפגעי אינהלציה חריפה של תרכובות נבדק. כאשר איכות השליטה באוויר הנקי התברר כפרמטר קריטי במהלך מחקר טרום-האימות, מספר מיטובי פרוטוקול ושיטות (למשל, שינוי של מוסיף ת...

אנו מציגים חזקה, להעברה וניבוי מערכת חשיפה מחוץ למערכת להקרנה וניטור של חלקיקים מוטס בנוגע לרעילות חריפה של הריאות שלהם על ידי חשיפת מעובד בתאי הריאה האנושיים בממשק האוויר-נוזלי (ALI).

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

הקרנת חלקיקים הנישאים באוויר בנוגע לציטוטוקסיות ריאתי חריפה על ידי חשיפת תאי ריאות אנושיים מעובדים ב- ALI באמצעות מערכת חשיפה זו במבחנה יכולה לעזור להפחית ניסויים בבעלי חיים. היתרון העיקרי של מערכת חשיפה זו הוא מושג התפלגות אירוסול רדיאלי המוביל להתפלגות הומוגנית ואת המיקום של החלקיקים על התאים. לפני זריעת התאים, להוסיף 2.5 מיליליטר של בינוני צמיחה מחוסמת לכל באר של צלחת שש היטב.מקם את תרבות התא מוסיף ללא תאים בזהירות בתוך הבארות ולהוסיף מיליליטר אחד של צמיחה בינוני לכל תרבות התא להוסיף. דוגרים את הצלחות במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר טריפסיניזציה של תאים, לדלל 100 microliters של ההשעיה תרבות התא ב מלא 10 מיליליטר של פתרון איזוטוני.להטות את ה לאט בלי לרעוד. ב מונה תאים, קבע את מספר התאים הקיימים למיליליטר ואת הכדאיות לתא בהתבסס על פרמטרי המדידה הספציפיים לתא של תאי A549. לאחר טמפרמנט של הצלחת, שאפו את המדיום בתוך תרבות התאים וזרעו מיליליטר אחד של תאי A549 עם צפיפות של שלוש כפול 10 לתאים החמישיים למיליליטר בכל תוסף תרבות תאים.להפיץ את ההשעיה התא על ידי נדנדה עדינה דגירה במשך 24 שעות. הגדר את זמן הלחיצה באמצעות בקרת הזמן בצד הקדמי של העיתונות. פתח את אספקת האוויר הדחוסה בשסתום האוויר הדחוס.באמצעות ווסת הלחץ בצד הקדמי של העיתונות, הגדר את לחץ האוויר הדחוס לשני ברים בקירוב. משוך את המגירה, לחץ על לחצן לחץ וקרא את הלחץ הקשה על מתג הלחץ הדיגיטלי. ממלאים את מיכל החומר בכמות קטנה של חומר הבדיקה.הכנס את הבוכנה לתוך מיכל החומר ולהפוך אותו מעט קדימה ואחורה כדי להפיץ באופן שווה את האבקה במיכל. מניחים את מיכל החומר, עם הבוכנה, במגירה וללחוץ על כפתור הלחיצה. פתח את המגירה והסר את הבוכנה.צעד קריטי הוא לחיצה על חומרי בדיקה שיש לדחוס במיוחד לעוגת אבקה בתוך מיכל החומר על מנת לאפשר חשיפות חלקיקים יציבות. הסר את מתאם ההתרסה ואת רפלקטור ההתמדה מהמודול המנחה של תרסיס. סגור את שלושת נשאי האכלת אירוסול במודול המנחה אירוסול עם תקעים וחיבורי אספקה בינוניים במודול הדגימה עם מדפים דמה.חבר את קווי הוואקום עם מחבר הצינור של המודול המנחה של תרסיס. השתמש בגלגל היד כדי לסגור את המודול ולמדוד את הערך של בקרי הזרימה. כמה דקות לאחר הסגירה, הערכים יורדים מתחת לחמישה מיליליטר לדקה.הפעל את תוכנת מחולל אירוסול. אם מגרד החומרים אינו במיקום הנמוך ביותר, לחץ על לחצן מצב ביות. מניחים את מיכל החומר עם חומר הבדיקה לחוץ במהופך על מגרד החומר.ודא כי הזכוכית של מיכל החומר פונה לחזית. מניחים את לוחית הנעילה בחריץ מעל מיכל החומר ומהדקים את הבורג השחור. שנה את הערכים עבור הזנה וסיבוב להגדרות הרצויות.השתמש בחצים כלפי מטה כדי לדחוף את השקופית עם מיכל החומר עד מגרד החומר הוא ליד החומר לחוץ. פתח את אספקת האוויר הדחוסה לגנרטור אירוסול עם ברז של בקר הזרימה ההמוני ולהתחיל את הדור אירוסול על ידי לחיצה על כפתור התחל. הגדר את קצב ההזנה ל- 15 עד 20 מילימטרים לשעה כדי למנוע זמני המתנה ארוכים.שלוט בדור החלקיקים הנכון על ידי התבוננות בענן האבק המשובח עם פנס קטן ממוקם מלמטה מאחורי צינור הזכוכית של האלוטריאטור. התחל את האספקה הבינונית עם מדיום חשיפה שחומם מראש ומלא את מודולי הדגימה עד שהמורדים יכסו בזמן שהמודול פתוח. הכנס תריס תאים עיוורים מוכנס לתוך מודול החשיפה, לשאוב את מדיום החשיפה למטה עד downpipes מכוסים בינוני ואת הצד התחתון של המוסיף נמצאים במגע עם בינוני.הפעל את מחולל אירוסול, לסגור את מודול החשיפה, ולחבר את מודול החשיפה לשקע מודול החשיפה של מחולל אירוסול. 30 דקות לאחר זמן ההובלה, לאטום את שקע מודול החשיפה של elutriator עם תקע גומי ולהסיר את מוסיף עיוור. מילוי מחדש של מדיום החשיפה עד שהמורדים מכוסים במדיום.הסר את מוסיף תרבות התא משש צלחות הבאר בעזרת פינצטה. יוצקים את מדיום הצמיחה בזהירות מתרבות התאים מוסיף על ידי הפלת מוסיף ולהשתמש פיפטה כדי לשאפת ולהשליך את הנוזל שיורית. מניחים את המכניסים בתאי החשיפה של מודולי החשיפה ואוויר נקי.סגור את המודולים והתחל את ניסויי החשיפה על ידי חיבור מודול החשיפה לשקע מודול החשיפה של מחולל התרסיס ומודול האוויר הנקי לאספקת הגז המוביל בו זמנית. לאחר השלמת הניסוי, נתק את מודולי החשיפה ואוויר נקי ואטם את שקע מודול החשיפה. לעצור את אספקת האוויר הדחוסה ואת גנרטור אירוסול על ידי לחיצה על כפתור עצור.פתח את מודול החשיפה ואוויר נקי ולהשתמש פינצטה להעביר את תרבות התא מוסיף את מוכן לאחר הדגירה שש צלחות היטב. הדגירה שש צלחות היטב, כמו גם את תרבות התאים שלא נוספה מוסיף, במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני בממשק נוזלי האוויר. 24 שעות לאחר החשיפה, הכנס את תרבות התאים מוסיף שש צלחות באר מוכנות חדשות.הוסף מיליליטר אחד של פתרון WST1 שהוכן טרי לכל הוספת תרבות תא. רוק הצלחות בזהירות על מנת להפיץ את הפתרון הומוגנית על התאים. הדגירה שש צלחות באר עם תרבות התא מוסיף במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.לאחר מכן, להעביר 100 microliters של supernatant ב triplicates מכל שישה צלחת גם לצלחת 96 גם. באמצעות קורא מיקרופלסטיק, למדוד את הספיגה ב 450 ננומטר עם אורך גל התייחסות של 650 ננומטר. ה- CULTEX RFS היא מערכת מודולרית מיוחדת לחשיפה במבחנה המאפשרת חשיפה ישירה והומוגנית של תאים לחלקיקים הנישאים באוויר בממשק נוזלי האוויר.חשיפה של תאים לאוויר נקי לא מובילה לירידה בכדאיות התא לאורך זמן. מערכת החשיפה אומתה בהצלחה והוותנה כמודל חיזוי למפגעי שאיפה חריפים של התרכובות שנבדקו. חשיפה של תאי A549 לחומרי בדיקה שונים שלא הציגו רעילות, בינונית או חזקה.אנא ודא שאתה מקפיד לשמור על מסגרות הזמן שהם זמני הדגירה, זמן ההובלה של ייצור חלקיקים, ואת זמני התצהיר חלקיקים. שיטת חשיפה זו מיועדת בעיקר לחשיפת חלקיקים של תאים, אך ניתן להאריך אותה לחשיפה של אירוסולים וגזים נוזליים על ידי התאמת שיטת ייצור התרסיסים. שיטת סינון זו מאפשרת הערכה איכותית של חלקיקים נדיפים לגבי רעילות שאיפה חריפה במבחנה, ובכך להפחית את הניסויים בבעלי חיים שבדרך כלל יספקו הערכה טוקסיקולוגית זו.אל תשכח כי עבודה עם חומרי בדיקה רעילים יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, מסכה, תמיד צריך להילקח בעת טיפול תרכובות כאלה.

assessment-acute-inhalation-toxicity-airborne-particles-exposing

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פרוטוקול זה נועד להדגים שיטת חשיפה של תרביות תאים לכימיקלים רעילים בשאיפה. חשיפה של ממשק אוויר נוזלי מובחן תרבויות (עלי) של תאי אפיתל דרכי הנשימה מספקת מודל ייחודי של חשיפת דרכי הנשימה לגזים רעילים כגון כלור. בכתב יד זה אנו מתארים השפעה של חשיפת כלור בתרבויות ממשק אוויר הנוזלי של תאי האפיתל ותרבות שקועה של שריר לב. במבחנה מערכות חשיפה לאפשר מחקרים מכניסטית חשובים להעריך מסלולים כי אז יכול להיות מנוצל כדי לפתח סוכנים טיפוליים חדשניים.

בדגם תרבית תאים במבחנה לרעילה בשאיפת בדיקות כימיות

מטרת פרוטוקול זה היא לחשוף מודלים תלת-ממדיים של רקמות הסימפונות והאף האורגנוטיפיים האנושיים לעשן סיגריות מיינסטרים (CS) בממשק אוויר-נוזל. לאחר מכן נחקרת ההשפעה של CS על הרקמות באמצעות בדיקת פעילות ציטוכרום P450, מדידת פעימות ריסים וגישה של ביולוגיה מערכתית.

הערכת השפעה של חשיפה חוזרת ונשנית של דוגמניות תרבות רקמות Organotypic 3D הסימפונות ובאף לעשן סיגריות שלמות

על רקע העיקרון 3Rs, מודלים הנשימה חלופות מחקרים שנעשו בבעלי חיים כמו מתפתחים. במיוחד עבור הערכת סיכונים מחומרים בדרכי הנשימה, יש מחסור של מבחני המתאים. כאן, אנו מתארים את השימוש אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות להערכה לחומרים הנישאים באוויר.

הערכת ציטוטוקסיות ואפקטים Immunomodulatory של חומרים אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע חשיפות תרסיס סלולרי נייד ולמדוד את תגובת תאי. השיטה משתמשת בתאים, גדל הממשק אוויר נוזלי, מחקה ויוו פיזיולוגיה. תגובה תאית nanoparticle נחושת אירוסולים נצפתה כמו לחץ חימצוני באמצעות הדור מינים חמצן תגובתי cytotoxicity כמו שחרור לקטט דהידרוגנאז.

חדש נייד במבחנה חשיפה קלטת לדיגום אירוסול

מוצג כאן פרוטוקול לבידוד מונוציט דם אנושי ראשי, כמו גם ההבידול שלהם לתוך מקרופאגים ותאים דנדריטיים והרכבה עם תאים אפיתל לתוך מודל ריאות אנושי רב תאי. תגובות ביולוגיות של cocultures המורכבים תאים חיסוניים מובדלים או חדוציטים מבודדים טריים או מופשרים, עם חשיפה לגירוייםדלקתיים, מושווים.

מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים

המתוארת היא תרבות התא ושיטת החשיפה של מודל הסימפונות במבחנה לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לשאיפת חלקיקים לבדיקות רעילות.

מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לחלקיקים מוטסים לבדיקות רעילות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תאים דמויי אפיתל דמויי אפיתל פלוריפוטנטיים מסוג 2 המושרים על ידי בני אדם (iAT2s). תאים אלה יכולים להיות מתורבתים ככדורים המתחדשים בעצמם בתרבית תלת-ממדית או מותאמים לתרבית ממשק אוויר-נוזלי (ALI).

יצירת כדורים תלת-ממדיים ותרביות ממשק אוויר-נוזל דו-ממדיות של תאי אפיתל פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מסוג 2

אנו מקימים מודל מבחנה סטנדרטי לחקר חשיפה לאדי קנאביס בממשק אוויר-נוזל. מודל זה מספק גישה שיטתית לבחינת ההשפעות של קנאביס מאודה, תוך התייחסות לעניין הגובר במכשירי אידוי קנאביס כחלופה לעישון.

במבחנה חשיפות קנאביס של תאי אפיתל ריאה בממשק אוויר-נוזל

תאים אפיתל ריאתי יכול להיות מבודד דרכי הנשימה של עכברים תרבותי בממשק אוויר נוזלי כמודל של אפיתל הנשימה מובחן. פרוטוקול מתואר לבידוד, culturing וחשיפת תאים אלה לעשן סיגריות המיינסטרים, כדי ללמוד התגובות מולקולרית רעלן זה סביבתיים.

בידוד של תאים אפיתל עכבר הנשימה וחשיפה לעשן סיגריות בבית ניסויית ממשק האוויר נוזלי

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד תאי האנדותל הלימפה בדופן כלי אנושיים מום הלימפה כמו ציסטה-ועורלות באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS). culturing התא הבא והתרחבות של תאים אלה מאפשרים רמה חדשה של תחכום ניסיוני למחקרים גנטיים, proteomic, פונקציונליים והתמיינות תאים.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

למדו הערכת רעילות ריאתית חריפה של חלקיקים מוטסים באמצעות חשיפת תאי ריאה אנושיים בממשק אוויר-נוזלי. שיטה זו מפחיתה ניסויים בבעלי חיים ומספקת הערכה אמינה של סיכוני שאיפה.

הערכת הרעלת שאיפת חריפה של חלקיקי מוטס על ידי חשיפת תאי ריאה אנושיים בממשק האוויר-נוזלי

גלה סרטונים נוספים