Name: ב Vivo זיהום עם לישמניה מלכותית כדי להעריך טפיל התקפה אלימה בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: למדו להעריך זיהום עורי בעכברים באמצעות הזרקות תת-כפיות עם Leishmania amazonensis. פרוטוקול זה מאפשר הערכה סימולטנית של תגובת דלקתית ושכפול טפילים לחקר וירולנטיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

היינו רוצים להודות לפרופ ' ד ר נילס אולסן סאראמנה קמפמארה ממרכז בעלי החיים של המכון למדעים ביו-רפואיים של אוניברסיטת סאו פאולו לתמיכה ופרופ ' ד ר סילביה רנן אטול לספק את מטחנת רקמת הזכוכית. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן סאו פאולו מחקר (FAPESP-MFLS ' גרנט 2017/23933-3).

כל ההליכים הניסיוניים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמש במכון הביומדע של אוניברסיטת סאו פאולו (CEUA 342/2019), ונערכו בהתאם להמלצות ולמדיניות הטיפול והשימוש בחיות מעבדה של סאו פאולו המדינה (ליי Est, 11.977, de 25/08/2005) ו הממשלה הברזילאית (ליי הפדרלי 11.794, de 08/10/2008) כל השלבים המתוארים בסעיפים 1-5 צריכים להתבצע בתוך ארונות זרימה למינארי. ציוד הגנה אישי צריך להיות מנוצל תוך התמודדות עם לישמניה לחיות טפילים.
1. בבידול חוץ גופית של L. אמזונואנסיס פרוסטיטיס לתוך האקסון15,20,35,36,37,38
הערה: L. אמזונואנסיס (MHOM/BR/1973/M2269) (La) טפיל שימש באותו שימוש. בהתאם למטרת המחקר, הטופס טפיל זיהומיות ניתן להשיג גם על ידי טיהור של טופס metacyclic באמצעות הדרגתי צפיפות, כפי שתוארה בעבר14, או על ידי הבידול של promastigotes לתוך האקסון axenic, על פי הפרוטוקול הבא.
<ol><li>לגדול La promastigotes ב 25 ס מ2 תרבות התא בקבוקון המכיל 10 מ ל של בינונית עבור promastigotes (pro-medium) (pH = 7.0).</li>
	<li>מודטה ב -25 ° c במשך שלושה ימים. הערה: להשתמש בתרבויות promastigote שהיו בעבר מבחנה פחות מ 10x כדי למנוע אובדן של התקפה אלימה ושינויים אנאפלואידיה של טפילים39,40,41,42,43,44.</li>
	<li>פיפטה 5 מ ל של שלב הצמיחה לוגריתמי פרואסטיט התרבות לתוך חדש 25 ס מ בקבוקון2 .</li>
	<li>הוסף 5 מ ל של בינוני עבור האמסטיגוטים (ama-medium) (pH = 5.2).</li>
	<li>מודטה ב 34 ° c עבור 3-4 ימים.</li>
	<li>פיצול התרבות על ידי דילול עם אמה-בינוני ביחס של 1:3 לתוך חדש 25 ס מ בקבוקון2 .</li>
	<li>מודטה ב 34 ° c עבור 3-5 ימים. הערה: מודזת את האמסטיגוטים האקאסטוליטס עד 5 ימים, כפי שהוא מייצג את סוף ההבשלה37.</li>
</ol>2. C57BL/6 זיהום Footpad עם L. אמזונואנסיס
הערה: נשים C57BL/6 עכברים (6-8 שבועות) הושגו והחזיקו במרכז בעלי החיים של המכון למדעי ביו של אוניברסיטת סאו פאולו. בעלי חיים קיבלו מזון ומים ליביום.
<ol><li>לספור את התרבות של axenic amastigotes על ידי העברת סדרת מחלקים של ההשעיה הטפיל מדולל PBS לחדר של נויבאואר (כלומר, הומוציטוטר). , תספור את הטפילים הלא-מלאים. שמייצגים צורות של אמסטיגוטים הערה: לחילופין, כחול טרילון (1:1) יכול לשמש לספירת מספר האמסטיגוטים הקיימא (כלומר, אלה שאינם מוכתמים בכחול טריכאני).</li>
	<li>לדלל את האקסון האקאסטוליטים ב-PBS על פי המינון הרצוי מינון ומספר האיקולולים המיועדים (1 x 106 מדהים amaenic ב 50 μl של PBS מומלץ).</li>
	<li>לטעון מזרק טוברקולין עם מחט של 27 גרם עם ההשעיה הטפיל מוכן.</li>
	<li>לC57BL העכבר/6 באמצעות 3-5% isofלאנה, כפי שמומלץ על ידי אוניברסיטת ג'ונס הופקינס בעלי חיים הוועדה שימוש45. להעריך את עומק ההרדמה על ידי בדיקת תגובת העכבר כדי צביטה בבוהן.</li>
	<li>איחסן 50 μL של הבולם הטפיל הומוגניים (1 x 106 מאמציה axenic או המינון הרצוי) ברקמת subplantar של השמאלית הימנית footpad, באמצעות המזרק הטעון בעבר מזרק (שלב 2.3).</li>
</ol>3. עכבר הרגליים פיתוח הנגע
<ol><li>למדוד את ההתקדמות של הנגע פעם בשבוע על ידי מדידת עובי של שמאל (נגוע) ואת הזכות (לא נגוע) אפם באמצעות caliper.</li>
	<li>לחשב את ההבדל בין העובי בין שמאל וימין הרגליים האחוריות שבועי להערכת התקדמות הנגע.</li>
	<li>התווה את ההבדלים המחושבים בציר Y ובזמן ההדבקה על ציר ה-X וחשב את המשמעות הסטטיסטית. הערה: בהתאם להמלצות הטיפול בבעלי חיים והשימוש בוועדות, יש להקריב בעלי חיים לפני שהנגעים הנגועים יהיו כחולים, כי כיבים בעור עלולים לגרום לזיהום משני. כפי שמוצג באיור המשלים 1, זה לוקח בערך 10 שבועות על נגעים להציג סימנים של כיבית עם המינון טפיל (106 מדהים axenic) ואת המתח המארח (C57BL/6) בשימוש בפרוטוקול זה. העכברים צריכים להיות מוקרבים לחילוץ הנגע לפני סימני כיבית הם נצפו.</li>
</ol>4. עכברים מיצוי הנגע והטפיל הגבלת דילול
<ol><li>להכין צלחת הטוב 96 (התחתון שטוח) עבור הגבלת הצורך דילול מגבלה46,47 על ידי הוספת 180 μl של פרו-בינונית לכל הבארות. הערה: השתמש בארבעה מסלולי לוח (מחצית הצלחת) עבור כל חיה, המייצג את הכריכה (כלומר, בעלי חיים 1 = נתיבים A-D; בעלי חיים 2 = נתיבים E-H).</li>
	<li>הוסיפו 1 מ ל של פרו-בינונית בצינור מטחנת זכוכית לנגע ושוקלים את השפופרת. הערה: הצינור חייב להישמר סטרילי, כך להשתמש במכסה סטרילי לשקול את הצינור עם המכסה הסגור, אם במשקל מחוץ לארון הזרם למינארי.</li>
	<li>הקריבו את החיה בחדר CO2 , בעקבות ההמלצות לטיפול בבעלי חיים והשימוש בוועדות. לחטא את החיה על ידי ריסוס עם 70% אתנול.</li>
	<li>בלו הרגל של החיה על זה עקבים כדי לחלץ את footpad נגוע ריסוס 70% אתנול על footpad לחיטוי. להבטיח עיקור של מספריים ומלקחיים על ידי שמירה עליהם ספוגים ב-70% אתנול.</li>
	<li>מניחים את footpad נגוע צלחת פטרי סטרילית ונתח באמצעות מלקחיים סטרילי אזמל לאסוף את כל הרקמות הרך. . להיפטר מהעצמות הערה: האחידות בשלב הניתוח מומלצת למניעת התאוששות מרקמות משוחדת.</li>
	<li>להעביר את הרקמות שנאספו לצינור מטחנת רקמה זכוכית עם פרו-בינונית, ואז לשקול את הצינור שוב כדי לקבוע את משקל הנגע. הערה: הימנע הצבת מלקחיים ואזמל ישירות לתוך המדיום, כמו כרכים קטנים ניתן להסיר, וכתוצאה מכך משקל הרקמה המעיט. משקל הנגע מחושב על ידי הפחתת משקל הצינור המכיל pro-medium עם רקמת שנאסף ממשקל של צינור המכיל רק פרו-בינונית.</li>
	<li>המגון הרקמה 10x באמצעות מטחנת עבור הפרעה רקמת מלאה.</li>
	<li>לאפשר את התערובת משקע עבור 10 דקות, ולאחר מכן לאסוף 20 μL של סופרנטנט.</li>
	<li>טען 20 μL של supernatantבעמודה 1 של הנתיב 1st של 96 צלחת באר מוכן בשלב 4.1. חזור על זה עבור שלושת הנתיבים הבאים כדי לקבל מרובע עבור כל חיה (כלומר, עבור בעלי חיים 1 להוסיף 20 μL לכל טוב תווית A1, B1, C1, ו D1).</li>
	<li>המגון לסדר כל טוב ב 1 בעמודההראשונה 10x באמצעות הצינורות רב-ערוצי. לאחר מכן, העבר 20 μL של דגימות מדוללמהעמודה 1 לעמודה 2 . הערה: חשוב להמגון כל 10x היטב מטור אחד למשנהו.</li>
	<li>חזור על שלב 4.10 לכל העמודות הנותרות עד לעמודה האחרונה (12) ולאחר מכן מחק את20 ה-μl האחרונים של דגימה מדוללת. הערה: שינוי העצות לאחר כל דילול כדי למנוע זיהום צולב.</li>
	<li>אטום את לוחיות הרישוי באמצעות סרט ומודב 25 ° c במשך 7 ימים בחדר לח.</li>
</ol>5. החלטה מטען טפיל הנגעים
<ol><li>לנתח את הצלחות לאחר 7 ימים של דגירה באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לקבוע את שימוש הטפיל האחרון המכיל היטב עבור כל נתיב. הערה: ניתן גם לציין את התפתחותם של טפילים, או צפיפות התא, על ידי ניתוח חזותי של שינויי צבע ועכירות של המדיום.</li>
	<li>לחשב את העומס רקמת הטפיל עבור כל נתיב על ידי חלוקת גורם הדילול לכל משקל נגע. הערה: בנתיב מסוים, אם הטפילים נמצאים רק בעמודות 1-5 (כלומר, בארות A1-A5 הן חיוביות לצמיחה טפיל), משמעות הדבר היא כי עמודה 5 הכיל רק 1 טפיל, טור 4 הכיל 10 טפילים, וכן הלאה, בכפולות של 10. טור 1 מכיל 104 טפילים, אשר מייצג את מספר טפילים ב 20 μl הראשונית של סופרנטנט (המדגם לא מדולל בשלב 4.7). בגלל זה 20 μL היה מדולל עם 180 μL של פרו-בינונית, הצינור הראשוני הכיל 5 x 105 טפילים: (1 x 104)/(0.02 mL) = 5 x 105 טפילים/1 ml. לאחר מכן, הטפיל טען בנגע זה יכול להיות מחושב על ידי חלוקת הריכוז הראשוני של הטפיל על ידי משקל הנגע: (5 x 105)/נגע משקל (ראה שלב 4.6).</li>
	<li>התווה את ממוצע התוצאה הquadruplicated עבור כל חיה בעלת קנה מידה Y של יומן רישום.</li>
</ol>6. אנליזה סטטיסטית
<ol><li>ייצוג הנתונים כסטיית תקן ממוצעת של ± standard באמצעות לפחות חמש בעלי חיים לכל קבוצה ניסיונית כשכפל.</li>
	<li>בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות בדיקה דו-זנבית שאינה משויכת, בהתחשב בערך p < 0.05 כמשמעותי.</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הvivo הזיהום המתואר בפרוטוקול זה מאפשר לכל חוקר להעריך vivo עורית לישמניתבהתחשב האינטראקציה המארחת טפיל בתרחיש מערכתי. השיטות הללו שימשו על ידי קבוצות רבות22,24,27,29,31,32,34,49 וכאן הערכנו פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לתקנן שיטה זו תוך התחשבות במגבלות התשתית ...

Leishmaniases הם ברחבי העולם מחלות זיהומיות טפיליות המייצגים אתגרים חשובים במדינות מתפתחות מזוהים כאחד המחלות הטרופיות החשובים ביותר מוזנחים על ידי ארגון הבריאות העולמי1,2. הleishmaniases מאופיינים בביטויים של עורית, מיוקורסל ו/או הקרביים. לישמניאזיס העורית נגרמת בדרך כלל על ידי L. אמזונואנסיס, ל' מקסיאנה, ל. braziliensis, ל. גויאנאנסיס, ל' מייג, ל' טרופיקה ו -L. אתיופיקה3. צורה זו של המחלה היא לעתים קרובות ריפוי עצמי בבני אדם בשל אינדוקציה של תגובה חיסונית המגן הסלולר. עם זאת, התגובה החיסונית הסלולר עלול להיכשל, ואת המחלה יכולה להתקדם לתוך לישמניסטית עורית4,5. אין חיסון זמין בשל גיוון בין לישמניה מינים ורקעים גנטיים מארחים6,7. אפשרויות הטיפול מוגבלות גם כמו רוב התרופות הזמינות כיום הם יקרים, רעילים, ו/או עשוי לדרוש טיפול לטווח ארוך8,9. חוץ מזה, היו דיווחים על התנגדות לסמים. כנגד הטיפולים הזמינים10,11
הסוכן סיבתי של leishmaniases הוא פרוטוזומין טפיל לישמניה. הטפיל מציג שתי צורות מורפולוגיות ברורים במחזור החיים שלה: promastigotes, הטופס הדגל המצוי בזבובי חול; ואת amastigotes, הצורה התאיים נמצא בתוך החללים הפרזיטאטיים של מקרופאגים מארחים של היונקים12,13. היכולת של amastigotes לפלוש, לשרוד, ולשכפל למרות מנגנוני ההגנה של מקרופאגים של המארחים בעלי חוליות כפופים למחקרים רבים14,15,16,17. כתוצאה מכך, כמה קבוצות מחקר כבר לתאר בתחום מקרופאג מבחנה הזיהום בחני להעריך את ההשפעה של גורמים סביבתיים ספציפיים, כמו גם טפיל ומארח גנים על הנגועים טפיל. שיטת הפעולה מציגה מספר יתרונות, כגון היכולת להתאים את המחקרים לפורמט תפוקה גבוה, תקופה קצרה יחסית להשגת תוצאות, ומספר מופחת של בעלי חיים מעבדתיים הקריבו18. עם זאת, ממצאי מחוץ לעולם הספר מוגבלים כי הם לא תמיד לשכפל במחקרים vivo14,19,20,21. ב vivo בחני לספק סקירה פיסיולוגיים מערכתית של האינטראקציה המארחת-טפיל, אשר לא ניתן לחיקוי מלאה של מחוץ לבית הספר. למשל, מחקרים אימונולוגיים ניתן לבצע דרך אימונוהיסטוכימיה בחני מ אספו מקטעים רקמות footpad או אפילו מבלוטות הלימפה popliteal לניתוח של תאים חיסוניים התאושש22.
בעלי חיים משמשים לעתים קרובות כמודל למחלות אנושיות במחקר ביולוגי וביורפואי כדי להבין טוב יותר את המנגנונים הפיזיולוגיים הבסיסיים של מחלות23. במקרה של לישמניאזיס, המסלול, האתר, או המינון של החיסון התוצאה המחלה24,25,26,27. יתר על כן, הרגישות וההתנגדות לזיהום בבני אדם ועכברים מוסדרים מאוד על ידי הרקע הגנטי של הפונדקאי והטפיל4,5,22,28,29,30,31. עכברים BALB/c הם רגישים מאוד ל -L. אמזונאנסיס זיהום עורית, מראה התקדמות מחלה מהירה עם הפצת טפילים לבלוטות הלימפה, טחול, והכבד32. כאשר המחלה עשויה להתקדם גרורות עורית, הזיהום יכול להיות קטלני. לעומת זאת, C57BL/6 עכברים לעתים קרובות לפתח נגעים כרוניים עם המון טפיל מתמשך בשנת הזיהום L. אמזונואנסיס בחני אומר33. ובכך, L. אמזונואנסיס זיהום עם מינים אלה עכבר מסוים נחשב מודל מצוין ללמוד צורות כרוניות של לישמנית עורית בבני אדם, כי זה מחקה את התקדמות המחלה יותר טוב מאשר הזיהום balb/c הידבקות מודל5,34.
מכאן, אנו מציעים כי מורנין בזיהום vivo היא שיטה שימושית עבור לישמניה מחקרים פיסיולוגיים התקפה למחלות אנושיות, המאפשר תצוגה מערכתית של אינטראקציה מארח-טפיל. ביקור חוזר היטב מבוססת בחני22, אנו מציגים כאן פרוטוקול שלב אחר שלב הידור של vivo הזיהום של C57BL/6 עכברים עם L. אמזונואנסיס הכוללת את הבידול טפיל לתוך amaenic האמסטיטים, עכברים footpad הרגליים, התפתחות נגעים, ונחישות עומס הטפיל. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לזנים אחרים של עכברים ומינים לישמניה הגורמות leishmaniases עורית. לסיכום, השיטה המוצגת כאן היא חיונית בזיהוי מטרות תרופות אנטי-לישמניה חדשות וחיסונים, כמו גם במחקרים פיסיולוגיים של המערכת החיסונית מחשב מטבולית ואת התגובות לזיהום לישמניה .

<table><tbody><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>Greiner bio-ne</td><td>655180</td><td>צלחת תחתונה שטוחה להגבלת בדיקת דילול</td></tr><tr><td>אדנין</td><td>סיגמא</td><td>A8626</td><td>תוסף נוסף לקליפר מדיה של תרבית תאים M199</td></tr><tr><td></td><td>Mitutoyo</td><td>700-118-20</td><td>קליפר למדידת עובי</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים</td> של כרית כף הרגל <td>קורנינג</td><td>353014</td><td>בקבוק תרבית תאים בנפח 25 ס"מ2 לגידול</td></tr><tr><td>צנטריפוגת</td> טפיל לישמניה, <td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>ציוד המשמש להפרדת דגימות על סמך צפיפותו</td></tr><tr><td>CO2 incubator 34 & deg; C</td><td>Thermo Scientific</td><td>3110</td><td>אינקובטור לאמסטיגוטים התמיינות</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Merck</td><td>K50237083820</td><td>חומר חיטוי לפריטים כלליים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>תוסף נוסף לצינור מטחנת רקמות זכוכית M199</td></tr><tr><td></td><td>תומס סיינטיפיק</td><td>3431 E04</td><td>צינור לאיסוף ושיבוש רקמת</td></tr> <tr><td>כרית כף הרגל הנגועהתוסף גלוקוז</td><td></td><td>Synth G1008.01.AH</td><td>נוסף למדיית תרבית תאים M199</td></tr><tr><td></td> תוכנת <td></td><td>GraphPad Prism</td><td>תוכנה המשמשת להתוויית הנתונים ולחישוב מובהקות סטטיסטית</td></tr><tr><td>תוסף hemin</td><td>Sigma</td><td>H-2250</td><td>נוסף למדיה של תרבית תאים M199</td></tr><tr><td>תוסף HEPES</td><td>Promega</td><td>H5303</td><td>נוסף לחממת מדיה של תרבית תאים M199</td></tr><tr><td>25 &deg; C</td><td>Fanem</td><td>347CD</td><td>אינקובטור לגידול פרומסטיגוטים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>ציוד המשמש לניתוח חזותי של תרביות פרומסטיגוט ואמסטיגוט</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td></td><td></td> חומר <td>הרדמה נדיף לעכברים (3-5%)</td></tr><tr><td>ארון זרימה למינרית</td><td>Veco</td><td>VLFS-09</td><td>ארון בטיחות ביולוגית המשמש לאזור עבודה אספטי</td></tr><tr><td>תא M199 אמצעי תרבית</td><td>Gibco</td><td>31100-035</td><td>אמצעי תרבית תאים לגידול לישמניה</td></tr><tr><td>צינור מיקרו-צנטריפוגה</td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td>מיקרו-צינור המשמש לאיסוף דגימות, עיבוד ואחסון</td></tr><tr><td>פיפטה רב-שאנלית</td><td>Labsystems</td><td>F61978</td><td>פיפטה רב-ערוצית המשמשת להגבלת בדיקת דילול</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>תוסף נוסף למדיית תרבית תאים M199</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>תוסף נוסף למדיית תרבית תאים M199</td></tr><tr><td>תא נויבאואר HBG</td><td></td><td>2266</td><td>המוציטומטר לספירת מתלה הטפיל</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אופטי</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td>ציוד אופטי המשמש לספירת פרפילים</td></tr><tr><td></td><td>טפיל Bemis</td><td>349</td><td>פלסטיק גמיש ועמיד לאיטום צלחת</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תוסף גיבקו</td><td>15140122</td><td>נוסף למדיית תרבית תאים M199</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>צלחת סטרילית לניתוח ערכת פיפטמן רקמת כרית כף הרגל</td></tr><tr><td></td><td>גילסון</td><td>F167360</td><td>ערכת מיקרופיפטה המכילה ארבעה פיפטורים (P2 P20 P200 P1000)</td></tr> <tr><td>בקנה מידה</td><td>Quimis</td><td>BG2000</td><td>ציוד המשמש לשקילת כרית כף הרגל שנאספה אזמל נגעים</td></tr><tr><td></td><td>Solidor</td><td>10237580026</td><td>אזמל לחיתוך ואיסוף רקמת כרית כף הרגל</td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 10 מ"ל</td><td>Nest</td><td>327001</td><td>פיפטה סטרילית המשמשת להעברת נפחי מיליליטר קצות</td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td></td><td>קצה פיפטה המשמש להעברת נפחי מיקרוליטר</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>צבע המשמש לספירת טפילים ברי קיימא</td></tr><tr><td>טריפטיקאז פפטון</td><td>תוסף Merck</td><td></td><td>נוסף למזרק טוברקולין מדיה תרבית תאים M199</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>305945</td><td>מזרק עם מחט 27G לחיסון תרחיף הטפיל</td></tr></tbody></table>

ב vivo זיהום עם לישמניה מלכותית כדי להעריך טפיל התקפה אלימה בעכברים

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

לישמניה spp. הם פרזיזומין טפילים שגורמות leishmaniases, מחלות הקיימות ספקטרום רחב של ביטויים קליניים מן עורית לנגעים בקרביים. כיום, 12,000,000 אנשים מוערכים להידבק לישמניה ברחבי העולם ומעל 1,000,000,000 אנשים חיים בסיכון של זיהום. לישמניה אמזונואנסיס היא אנדמיים במרכז ובדרום אמריקה ובדרך כלל מובילה לצורה העורית של המחלה, אשר ניתן לדמיין ישירות במודל של בעל חיים. לכן, הזנים L. אמזונואנסיס הם מודלים טובים עבור לימודי עור לישמניה משום שהם גם מעובדים בקלות בתוך מבחנה. C57BL/6 עכברים לחקות את ה- L. אמזונאנסיסמונחה התקדמות המחלה נצפתה בבני אדם נחשבים לאחד מדגם העכברים הטובים ביותר של זנים עבור לישמנית עורית. ב המארח בעלי החוליות, טפילים אלה לאכלס מקרופאגים למרות מנגנוני ההגנה של תאים אלה. מספר מחקרים להשתמש מקרופאג מחוץ לגופית הזיהום בחני להעריך את הטפיל הנגועים בתנאים שונים. עם זאת, הגישה החוץ-גופית מוגבלת למערכת תא מבודדת המתעלמת מתגובת האורגניזם. כאן, אנו לקמפל בשיטה זיהום vivo murine המספקת סקירה פיזיולוגית מערכתית של אינטראקציה מארח-טפיל. הפרוטוקול המפורט של זיהום vivo של C57BL/6 עכברים עם L. אמזונואנסיס כולל בידול טפיל לתוך amastigotes, עכברים הרגליים footpad, התפתחות נגעים, ונחישות עומס טפיל. אנו מציעים זו שיטה מבוססת היטב כשיטה הנאותה ביותר עבור מחקרים פיסיולוגיים של המערכת החיסונית מטבולית התגובות לישמניה עורית.

לישמניה פרוטוזומין טפילים קיימים בשתי צורות התפתחותיות במהלך מחזור החיים שלהם חסרי חוליות מארחים בעלי חוליות: promastigotes, צורות מתרבים למצוא לומן של זבוב הנקבה; והאמסטיגוטים, הצורות המתרבים שנמצאו בחללים הפרזיטאטיים של תאי המארחים היונקים. Promastigotes יש גוף מוארך של כ 1.5 יקרומטר רוחב ו 20 יקרומטר ארוך, עם שכאלילום המתעוררים בדרך כלל מן הגפיים הקדמי. Amastigotes יש גוף מעוגל או דמוי החל בגודל מ 2-6 יקרומטר אורך ו 1.5-3 יקרומטר ברוחב, ובעלי הדגל בלתי נראה12...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הידור כדי להעריך את הזיהום עורית של עכברים עם לישמניה אמזונואנסיס. זוהי שיטה אמינה למחקר והתקפה של טפיל, המאפשרת מבט מערכתי של התגובה המארחת בעלי החוליות לזיהום.

ב Vivo זיהום עם לישמניה מלכותית כדי להעריך טפיל התקפה אלימה בעכברים

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

פרוטוקול זה מתאים לחקר ארסיות לישמניה, משום שהוא מספק תצוגה מערכתית של מארח החולייתנים לזיהום עורי. היתרון העיקרי של אימוץ פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לחוקרים להעריך את התגובה הדלקתית המארחת ואת שכפול הטפיל בו זמנית. שיטה זו יכולה לשמש לאפיון מספר מטרות וטיפולים הקשורים ארסיות, אשר יכול להביא תובנות חדשות לתוך בקרת לישמניאזיס עורית.זה יכול להיות מיושם גם על זני עכברים אחרים מיני לישמניה הגורמים לישמניאזיס עורית. בדיקה זו כוללת כמה צעדים קריטיים, כגון דרישת כוח אדם מיומן שנוח להם לעבוד עם עכברים ויש להם ניסיון בביצוע זריקות תת-כוכביות כדי למנוע חשיפה מקרית לחומר זיהומי. הדגמת ההליך תהיה ד"ר ריקרדו זמפיירי, טכנאי מהמעבדה שלי.התחל על ידי גידול L.amazonensis promastigotes בבקבוק תרבות תאים בריבוע 25 ס"מ, המכיל 10 מיליליטר של פרו בינוני, במשך שלושה ימים ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, פיפטה חמישה מיליליטר של תרבות פרומסטיגוט צמיחה לוגריתמית לתוך בקבוקון חדש. מוסיפים חמישה מיליליטר של אמא-מדיום לבקבוק, ומדירים אותו ב-34 מעלות צלזיוס במשך שלושה עד ארבעה ימים.לפצל את התרבות על ידי דילול אותו ביחס של אחד עד שלושה עם אמא בינוני טרי בבקבוקון חדש. ואז לה הדגירה אותו לעוד שלושה עד חמישה ימים. העבר aliquot של ההשעיה amastigotes גרזן מדולל PBS לתא Neubauer ולספור את הטפילים ללא דגל.לאחר מכן, לדלל

in-vivo-infection-with-leishmania-amazonensis-to-evaluate-parasite

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

אופטימיזציה של מודל ניסיוני אוגר leishmaniasis עורית על ידי הזרקה של...

Leishmaniasis עורית בעור הגב של אוגרים: מודל שימושי להקרנה של תרופות Antileishmanial

סרטון זה חוקר את האלימות של לישמניה על ידי טיפול במקרופאגים עם פרומסטיגוטים מטאציקליים, וכתוצאה מכך היווצרות של אמסטיגוטות תוך-תאיות. האישור לאלימות הלישמניה מושג באמצעות צביעת צבע פלואורסצנטי של חומצת גרעין. תובנה זו יכולה לתרום לפיתוח טיפולים חדשים ללישמניאזיס.

הערכת אלימות הלישמניה בתוך מקרופאגים מתורבתים

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפילים במקרופאגים שמקורם במח עצם (BMM). תאי המקרופאגים נגועים בשלבים הפולשניים התנועתיים והלא תנועתיים של לישמניה, פרומסטיגוטים מטאציקליים ואמסטיגוטים, בהתאמה. הטפילים פולשים למקרופאגים, מופנמים לחלל טפילי ומתרבים בפנים. צמיחת הטפיל התוך-תאי מכומתת באמצעות מיקרוסקופ על צביעה פלואורסצנטית של גרעיני המקרופאגים והטפילים.

בדיקה חוץ גופית לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפיל במקרופאגים

מאמר זה מדווח על שיטה מפורטת למדידה דינמית וכימות של מהירות זרימת הדם בתוך כלי דם בודדים של כלי הדם בכבד העכבר באמצעות הדמיית מיקרוסקופיה תוך-חיונית בשילוב עם מתודולוגיה ספציפית לרכישת וניתוח תמונה.

מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא<em&gt; שושנת יריחו</em&gt; זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה

כל המינים לישמניה פתוגניים שוכנים וישכפלו בתוך המקרופאגים של מארחיהם חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדביק מאתר מקרופאגים הנגזרות מח עצם בתרבות עם לישמניה, ואחריו כימות מדויק של קינטיקה גידול תאיים. שיטה זו שימושית עבור לימוד בודדים הגורמים המשפיעים על אינטראקציה פתוגן-פונדקאי, לישמניה התקפה אלימה.

כימות של צמיחה תאיים בתוך המקרופאגים הוא מהיר, שיטה אמינה להערכת של התקפה אלימה של טפילים לישמניה

כאן אנו מציגים הערכה אורכית של אוגרים זהובים הנגועים תוך צפקית (IP) או דרך תוך חניכיים (IG) עם L. infantum-Luc על ידי הדמיה ביולוגית ועל ידי PCR. אוגרים הוערכו יום אחד לאחר ההדבקה (1 dpi), שבוע לאחר ההדבקה (8 dpi) ו-3 שבועות לאחר ההדבקה (22 dpi) והורדמו ב-50dpi ו-8 חודשים לאחר ההדבקה.

ב Vivo הדמיה של אוגרים נגועים בלישמניה אינפנטום על ידי חיסון חניכיים של אמסטיגוטים אקסניים המבטאים לוציפראז

סטרונגילואידס ראטי היא נמטודה טפילית הגורמת לזיהומים חולפים בעכברי מעבדה, ומציגה שלבי נדידת רקמות וחיי מעיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשמירה על מחזור הטפילים בחולדות והדבקה ניסיונית בעכברים, כולל כימות טפילים בראש, בריאות ובמעי.

זיהום ניסיוני של עכברים בנמטודה הטפילית Strongyloides ratti

בדיקות אבחון רגישות מיקרוביאלית הנוכחי מסתמך על צמיחה של planktonic מבודד ב מזין, עשיר תנאים אירוביים. כאן, אנו מעסיקים בינוני חלופה כיח מלאכותית ללמוד הרגישות מיקרוביאלית של Pseudomonas aeruginosa biofilms תחת שני תנאים אירוביים ו microaerophilic נציג נוסף של הריאה סיסטיק פיברוזיס.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

טפיל הצלה והמהפך assay עם THP1 תאים...

Assay הצלה וטרנספורמציה טפילה להקרנת Antileishmanial נגד תאי<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; Amastigotes בקו THP1 אדם חריף Monocytic וקמיה של תאים

למדו להעריך זיהום עורי בעכברים באמצעות הזרקות תת-כפיות עם Leishmania amazonensis. פרוטוקול זה מאפשר הערכה סימולטנית של תגובת דלקתית ושכפול טפילים לחקר וירולנטיות.

ב Vivo זיהום עם לישמניה מלכותית כדי להעריך טפיל התקפה אלימה בעכברים

גלה סרטונים נוספים