Name: הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למד שיטת סינון לזיהוי מעכבי פירופוספטאז מעוגן ממברנה מ-Thermotoga maritima באמצעות תגובת מוליבדן כחולה בפורמט 96 באריות. פרוטוקול זה פשוט, יעיל ויציב אף בריכוזי פוספוליפידים גבוהים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי המענקים מקרן ג'יין ואטוס Erkko ו-BBSRC (BB/M021610) לאדריאן גולדמן, האקדמיה של פינלנד (No. 308105) ל Keni Vidilaseris, (מס ' 310297) לאנרי Xhaard, ו (No. 265481) כדי Jari Yli-Kauhaluoma, ואת אוניברסיטת הלסינקי כספי מחקר כדי גוסטב Boije af Gennäs. המחברים מודים לברנדט גהל על עזרתה הטכנית במהלך הפרויקט.

1. הכנת חלבון
הערה: הביטוי והטיהור של TmPPase תוארו במקום אחר13.
<ol><li>הכינו 10 מ ל של פתרון מאגר ההפעלה מראש המכיל 20 מ"מ 2-(N-dodecyl olino) החומצה ethanesulfonic (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) גליצרול, 2 מ"מ dithioitol (dtt), ו 0.05% maltoside (ddm).</li>
	<li>הכינו 10 מ ל של תערובת התגובה המכילה 200 mM טריס-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl2, 333 MM kcl, ו-67 Mm הנאל. הערה: Mg2 + נדרש כדי לאכול את הפירופוספט כמצע של Mppase, K+ נדרש כדי להגדיל את פעילות האנזים כמו Tmppase הוא mppase אשלגן תלוי, ו-Na+ נדרש עבור פעילות האנזים במהלך הטרנסלוקציה של הנתרן על ידי tmppase.</li>
	<li>הכינו 30 מ"ג/מ ג ליפוזומים לצורך אנזים ההפעלה.<ol>
<li>להוסיף 10 מ"ל של 20 מילימטר טריס-HCl pH 8.0 עם 1 מ"מ DTT כדי 0.3 g של L-α-פוספוליכולין מ סויה ל 10 מ ל של 20 מ"מ טריס-HCl pH 8.0 עם 1 מ"מ DTT.</li>
		<li>לשים את ליפומה על קרח, ו sonicate עם 1 מרווח הפעימה השנייה 1 דקה, הפסקה 1 דקה, ולחזור עד הפתרון הופך צהוב שקוף.</li>
		<li>הקפאת הליזומים, הקפא בחנקן נוזלי ואחסן ב-80 ° c עד שימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>. הפעל מחדש את האנזים<ol>
<li>מערבבים 40 μL של הפתרון ליפוזומים עם 22.5 μL של 20% DDM.</li>
		<li>מחממים את התערובת ב-55 ° c למשך 15 דקות ומאפשרים לו להתקרר לטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הוסף 36.5 μL של פתרון מאגר ההפעלה מראש, ערבב והוסף 1 μL של חלבון מרוכז (13 מ"ג/mL) כדי לבצע ריכוז מוחלט של 0.13 mg/mL. הערה: החלבון הוא קפוא בדרך כלל ב 10 μL ' ali, לאחר טיהור ולהפשיר על קרח לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>קח 20 μL של האנזים שהפעיל מופעל ולהוסיף ל 1,480 μL של תערובת התגובה, ואז לערבב בעדינות. הערה: יש לבצע את התוספת של האנזים שהוא מופעל לתערובת הריאקציה בדיוק לפני שימוש בו.</li>
</ol>2. הכנה מורכבת
<ol><li>מפזר את תרכובות diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להפוך את הפתרונות מניות של 25 ל-100 מ"מ ב 50 ליטר μL, מבוסס על זמינות של תרכובות. הערה: כל התרכובות המשמשות כאן (איור 2א) פורסמו בעבר9. אם מסיסות מורכבים נמוך, ריכוז המניה ניתן לכוונן בהתאם.</li>
	<li>הכן שלושה ריכוזים שונים. של כל תרכובת במים הערה: הריכוזים הסופיים בתערובת התגובה יהיו 1, 5, ו-50 micromolar או 1, 5, ו 20 micromolar עבור תרכובות מסיסים ומסיסים בהתאמה.<ol>
<li>לדלל את הפתרון במניה עם מים כדי 1 mL ב microtubes לתת 2 μM, 10 μM ו 100 μM עבור תרכובות מסיסים, או לחילופין 2 μM, 10 μM ו 40 μM עבור תרכובות מסיסים בחסכנות.</li>
		<li>מערבולת הפתרון המורכב מיד לאחר דילול הפתרון מניות עבור ערבוב נאות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בדוק אם יש צבירה מורכבת באמצעות נפלומטר. הערה: זה נלמד כמו טריפליטים בשלושה ריכוזים (1 μM, 5 μM ו -20 μM) ו מנורמל לריק ב 96 צלחת היטב.<ol>
<li>לחלק 75 μL של תערובת התגובה לתוך כל טוב באמצעות הצנרת רב-ערוצי.</li>
		<li>הוסף 75 μL של כל תרכובת (עבור הריק, השתמש 75 μL של מים במקום) ולערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה 5 ×.</li>
		<li>למדוד כל טוב ב 300 V באמצעות אימונולוגיה נפלומטר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ריאגנטים להכנת שיטת ההכנה
<ol><li>הכינו את התמיסה הארגיט-ציטראט.<ol>
<li>שוקל 5 גר' נתרן ארגיט ו -5 גר' טרינתרן ציטראט. התראה: הנתרן ארגיט הוא רעיל, ובכך להשתמש בציוד הגנה נאותים ולטפל בטיפול מיוחד. כאמצעי זהירות, אל תטפל בפני כל אמצעי הזהירות הנחוצים של בטיחות שנקראו והובנו. לטפל רק בתוך מכסה המנוע על מנת לא לשאוף אבק/אדים של התרכובת או הפתרון (של). אם שאפו, עברו לאוויר צח והשיגו טיפול רפואי. ללבוש משקפי בטיחות כימיים מתאימים, כפפות מגן וביגוד כדי למנוע בליעה והעין/עור מגע. אם בלע, קרא מיד למרכז הרעלים או לרופא/רופא. אם הוא מקבל על העור או בעין (s), לשטוף עם הרבה מים ולקבל טיפול רפואי.</li>
		<li>מתמוסס לתוך 100 מ ל של מים.</li>
		<li>הוסף 5 מ ל של חומצה אצטית קרחוני, לערבב, ולהוסיף מים 250 mL.</li>
		<li>החנות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור. הערה: הפתרון יציב למעלה משנה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו פתרון A ופתרון B.<ol>
<li>עבור פתרון A, להוסיף 10 מ ל קרח קר 0.5 M HCl כדי 0.3 g של חומצה אסקורבית. מפזר את החומצה האסקורבית על ידי וורטקסנג.</li>
		<li>עבור פתרון B, להוסיף 1 מ ל של מים קרים קרח כדי 70 מ"ג של אמוניום הפיטאמאוליבתאריך ומערבולת להתמוסס. הערה: אחסן את שני הפתרונות בקרח עד לשימוש. לגבי עקביות תוצאת הסדר, ניתן לאחסן את שני הפתרונות בקרח למשך שבוע מקסימום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין את פוספט (Pi) תקן עם הריכוז של 0 μm, 62.5 μm, 250 μm ו 500 μm עבור כיול.<ol>
<li>הוסף 0 μL, 25 μL, 50 μL, ו 100 μL של 5 מ"מ2hpo4 דימיים עד ארבע מיקרוצינורות המכילים 370 μl של תערובת התגובה.</li>
		<li>למעלה עד 1 מ ל עם מים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. שיטת הפעילות עבור 1 96 צלחת הבאר
הערה: ראה איור 1 עבור זרימת העבודה הסכמטית של המנה.
<ol><li>הוסף 1 mL של פתרון B כדי 10 מ ל של פתרון A, לערבב על ידי vortexing ולאחסן את הפתרון על קרח. הערה: פתרון זה צריך להיות שקוף וצהוב. שמור פתרון A + B על הקרח לפחות 30 דקות לפני השימוש. עם זאת, להשתמש בפתרון בתוך 3 h כפי שהוא ילך רע לאחר אחסון לטווח ארוך.</li>
	<li>הוסף 40 μL של 0 μM, 62.5 μM, 250 μM ו500 μM Pi רגיל לרצועות הצינורית בטריליפיטה באמצעות פיפטה רב-ערוצית. הערה: תערובת התגובה עם Pאני הוסיף ישמש ריק.</li>
	<li>הוסף 25 μL של פתרון מורכב לרצועות הצינור באמצעות מנקז רב-ערוצי. הערה: לכל תרכובת יש שלושה ריכוזים שונים בטריליפיאט, שמספיק להערכת הראשונית של הריכוז המקסימלי של חצי העכבות (IC50). For50 IC מדויק יותר הגדרה, שמונה ריכוזי מורכבות שונים ניתן להשתמש. עבור האנזים הבלתי מעוכב הפתרון המורכב מוחלף בכמות מים שווה. כמו שולטת חיובית 2.5 μM, 25 μM, ו 250 μM של שדדודיפוספט (IDP) מלח נתרן שימשו.</li>
	<li>הוסף 15 μL של תערובת התמיסה mPPase לפסי הצינור (למעט החצוצרות המכילות את התקן Pi ) באמצעות פיפטה רב-ערוצית.</li>
	<li>חותם את רצועות הצינורית באמצעות גיליון איטום מדבק. חותכים את גיליון האטימה כדי להפריד כל אחד ממפצל הצינורות.</li>
	<li>לפני הדגירה הדגימות עבור 5 דקות ב 71 ° c. מניחים את הדגימות על בלוק החימום עם מרווח של 20 s בין כל רצועה כדי למזער את צריכת הזמן במהלך השלבים הבאים.</li>
	<li>עבור כל רצועה, פתח את איטום דבק. הוסף 10 μL של 2 מ"מ נתרן פירופוספט dibasic באמצעות פיפטה רב-ערוצי ולערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה עבור 5 ×. אטום את רצועת הצינורית שוב באמצעות אותו איטום. הערה: שלב זה עשוי להיות קשה לביצוע במהלך 20 s; עם זאת, זה יהיה קל יותר לאחר כמה שאומר.</li>
	<li>מודקון ב 71 ° c עבור 5 דקות.</li>
	<li>מניחים את הדגימות על מנגנון הקירור עם מרווח של 20 s בין כל רצועה. תן להם להתקרר 10 דקות אבל צנטריפוגה כל רצועה בקצרה לאחר 5 דקות של קירור, כדי להוריד טיפות מים מתחת לסדין איטום, ואז לשים אותו בחזרה למנגנון הקירור ולהסיר את האיטום. הערה: מנגנון הקירור ניתן לעשות על ידי הצבת לוחית ה-PCR 96 היטב בקלקר צלחת פטרי (גודל 150 מ"מ × 15 מ"מ) מלא מים קפואים לפחות 1 h. יש להוציא את המנגנון מהמקפיא בערך 5 דקות לפני תחילת השיטת. אין להוציא את מנגנון הקירור ממש לפני קירור לדוגמה כפי שהוא להקפיא את תערובת התגובה ולעכב את התפתחות הצבע.</li>
	<li>לאחר 10 דקות של קירור, להוסיף 60 μL של הפתרון A + B, לערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה עבור 5 × ולשמור על פסי הצינור על מנגנון קירור עבור 10 דקות.</li>
	<li>הוסף 90 μL של הפתרון הארמיט-ציטראט ושמור בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות כדי לייצר צבע כחול יציב. התראה: בשל הרעילות שלה כל הפתרונות המכילים נתרן ארגיט צריך להיות מטופל עם טיפול נוסף בכל עת. לפיכך, יש לבצע את הוספת התמיסה של ארגיט-ציטראט בתוך מכסה המנוע.</li>
	<li>לוותר 180 μL של כל תערובת התגובה לתוך ברור 96 מיקרוצלחת פוליסטירן היטב.</li>
	<li>למדוד את ספיגת כל טוב ב 860 ננומטר באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרופלטה.</li>
</ol>5. ניתוח תוצאות
<ol><li>ממוצע הטריליליטים של כל אחת מהדוגמאות והסטנדרטים של Pi . לאחר מכן הפחת עם הריק כדי לבטל את אות הרקע.</li>
	<li>בצע עקומת כיול על-ידי התוויית ערכי הספיגה (A860) כנגד כמות התקן Pi (nmol) וביצוע רגרסיה ליניארית כדי להשיג את פונקציית קו המגמה באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ01a.jpg">
</li>
	<li>חישוב כמות הפוספט (nmol) ששוחרר מהתגובה האנזימטית המבוססת על נוסחת הרגרסיה הליניארית לעיל.</li>
	<li>חשב את הפעילות הספציפית באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ02a.jpg"> כאשר nPאני כמות של פוספט שוחרר מן התגובה (nmol), t הוא זמן התגובה (דקות), ו- mtmppase הוא כמות tmppase טהור בשימוש בתוך השיטת (mg).</li>
	<li>חשב את אחוז הפעילות עבור כל ריכוז מעכבי באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ03a.jpg"> כאשר saאניזההפעילות הספציפית של מדגם עם מעכב ו- SAun היא הפעילות הספציפית של המדגם עצורים.</li>
	<li>חשב את הלוגיקה50 (הערכה) ו-IC50 (הערכה) עם התאמה רגרסיה לא לינארית מעקומת מינון ארבע פרמטרים באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ04a.jpg"> כאשר X הוא הרישום של ריכוז (μM), Y היא פעילות (%), העליון והתחתון הם רמות באותה יחידה כמו Y (100% ו-0%, בהתאמה), לוגיקה50 יש את אותו יחידות יומן כמו X, ו-הילדרון = גורם מדרון או מדרון הגבעה, שהוא unitless. הערה: תוכנה (רשימת חומרים) משמשת למדידה. השתמש בריכוז של 0.01 μM (במקום 0.00 μM) עבור המדגם ללא מעכב כאשר הלוגריתם של אפס אינו מוגדר.</li>
</ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+research+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li>
<li>Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+pyrophosphatases%3A+a+novel+drug+target+for+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens.</a> AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).</li>
<li>Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrophosphate-Fueled+Na%2B+and+H%2B+Transport+in+Prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).</li>
<li>Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-PPases%3A+yesterday%2C+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">H+-PPases: yesterday, today and tomorrow.</a> IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuolar-H%2B-pyrophosphatase+%28TgVP1%29+is+required+for+microneme+secretion%2C+host+cell+invasion%2C+and+extracellular+survival+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).</li>
<li>Lemercier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyrophosphatase+regulating+polyphosphate+metabolism+in+acidocalcisomes+is+essential+for+Trypanosoma+brucei+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).</li>
<li>Belogurov, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+pyrophosphatase+of+Thermotoga+maritima+requires+sodium+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity.</a> Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).</li>
<li>Vidilaseris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+in+catalysis+by+Thermotoga+maritima+membrane-bound+pyrophosphatase+demonstrated+by+a+nonphosphorus+allosteric+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor.</a> Science Advances. 5 (5), (2019).</li>
<li>Lin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+membrane-embedded+H%2B-translocating+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase.</a> Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).</li>
<li>Fiske, C. H., Subbarow, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+colorimetric+determination+of+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The colorimetric determination of phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).</li>
<li>Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molybdenum+blue+reaction+for+the+determination+of+orthophosphate+revisited%3A+Opening+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box.</a> Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).</li>
<li>Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+and+purification+of+membrane-bound+pyrophosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases.</a> Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).</li>
<li>Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+orthophosphate+determination+of+thermostable+membrane-bound+pyrophosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity.</a> Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).</li>
<li>He, Z. Q., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+in+Soil+Science+and+Plant+Analysis%22%5BJournal%5D)">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).</li>
<li>Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorinated+tyrosine+phosphates+to+probe+the+substrate+specificity+of+the+low+molecular+weight+phosphatase+activity+of+calcineurin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).</li>
<li>Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+strategy+to+determine+the+dependence+of+membrane-bound+pyrophosphatases+on+K%2B+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor.</a> Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט עבור הקרנה פשוטה של מעכבי עבור פירופוספאז של קרום מאוגד מ T. קיסריה בפורמט 96 צלחת היטב מבוסס על vidilaseris ואח '14. פרוטוקול זה הוא זול ובעל בסיס של 12-פוספומוליפוליב חומצה, אשר נוצרת מאורתופדיה וmolybdate בתנאים חומציים ומופחתת למינים phosphomolybdenum עם צבע כחול ברור12. שיטה זו מועדפת על פני פרוטוקולים אחרים, כגון מלכית הירוק יותר רגיש16, כי שיטה זו אינה מראה הפרעה בנוכחות ריכוז פוספוליפיד גבוה הנדרש עב...

כ -25% של החלבונים הסלולריים הכולל הם חלבונים ממברנה ו 60% מהם הם מטרות התרופה1,2. אחת ממטרות התרופה הפוטנציאלית3, ממברנה מאוגד פירופוספסים (mppases הם אנזימים dimeric המשאבה פרוטון ו/או נתרן יון על ידי הידרוליזה של פירופוספט לשניאורטופד 4. mPPases ניתן למצוא אורגניזמים שונים5 כגון חיידקים, הארכונים, צמחים, וטפילים פרוטיסטים, למעט בני אדם ובעלי חיים4. ב טפילים פרוטיסטים, למשל פלמודיום falciparum, טוקסופלזמה gondii ו טריאנוסומה ברוסייאי, mppasesהם חיוניים עבור התקפה ואלימה הטפיל6 ו נוקאאוט של ביטוי זה טפילים להוביל לכישלון בשמירה על חומציות תאיים על חשיפה ל-ph הבסיסי החיצוני7. בשל חשיבותם וחוסר חלבון הומולוגי המצויים בחוליות, ניתן להתייחס ל-mPPases כמטרות התרופות הפוטנציאליות עבור מחלות הפרוסטל3.
הקרנת חוץ גופית של מעכבי mPPase בעבודה זו מבוססת על מערכת מודל TmPPase. Tmppase הוא שאיבה יון נתרן ומיון אשלגן תלוי mppase מ T. קיסריה ויש לו פעילות אופטימלית ב 71 ° צ'8. היתרונות של אנזים זה הם למשל הקלות שלה בייצור וטיהור, יציבות תרמית טובה ופעילות מסוימת גבוהה. Tmppase מראה גם דמיון גבוה בנוסף על שימור מוחלט של העמדה, כמו גם זהות של כל שאריות קטליטי כדי mpp,התלת ממדי 3,9 ולמבנה פתרו של ויגו radiata10 mppase. המבנים הזמינים של TmPPase בקונמציות שונות הן גם שימושיות עבור ניסוי מבוסס מבנה התרופה עיצוב (כמו הקרנה וירטואלית דה נובו עיצוב).
כאן אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט להקרנה של מעכבי TmPPase ב 96 בפורמט צלחת הבאר (איור 1). הפרוטוקול מבוסס על שיטת הצביעה של התגובה הכחולה מוליבדן, אשר פותחה לראשונה על ידי פיסק ו Subbarow11. שיטה זו כוללת את היווצרות של 12-פוספוליפוליב חומצה בmolybdate באמצעות מצבים חומציים, אשר מופחת אז לתת מינים אופייני בצבע כחול phosphomolybdenum12.

<table><tbody><tr><td>גיליון איטום דבק</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום הפטמוליבדט טטרהידראט</td><td>Merck</td><td>F1412481 636</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>95212-250G</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96Well Multidish</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Merck</td><td>1167431000</td><td></td></tr><tr><td>רצועות צינור PCR 8 בארות 0.2 מ"ל ללא כובעים (120)</td><td>Nippon genetics</td><td>FG-028</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl maltoside (DDM)</td> <td>Melford</td><td>B2010-100G</td> אתנול Merck 1009901001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Merck</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidodiphosphate נתרן מלח</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I0631-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-פוספטידיל כולין מלציטין פולי סויה</td><td>סיגמא</td><td>429415-100GM</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>8147330500</td><td></td></tr><tr><td>צלחות PCR מרובות 96 בארות</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9651</td><td></td></tr><tr><td>MultiSkan Go</td><td>Thermo Scientific</td><td>10680879</td><td></td></tr><tr><td>Nepheloskan Ascent (Type 750)</td><td>Labsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי פוליסטירן (גודל 150 מ"מ x 15 מ"מ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5981-100EA</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 תוכנה</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QBT2 חימום בלוק</td><td>Grant Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן מטא-ארסניט</td><td>פישר כימי</td><td></td><td></td>12897692</tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי (Pi)</td><td>Sigma</td><td>S0876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירופוספט דו-בסיסי</td><td>Fluka</td><td>71501-100G</td><td></td></tr><tr><td>טריסודיום ציטראט דיהידרט</td><td>Fluka</td><td>71404-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

פירופוספטסיס ממברנה (mPPases) הם אנזימים dimeric המתרחשים בחיידקים, הארכאית, צמחים, וטפילים פרוטיסטים. חלבונים אלה קליב פירופוספט לשתי מולקולות אורתופהונאים, אשר בשילוב עם פרוטון ו/או נתרן שאיבה על פני קרום. מכיוון שאין חלבונים הומוולוגיים להופיע בבעלי חיים ובבני אדם, mPPases הם מועמדים טובים בעיצוב של מטרות סמים פוטנציאליים. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט למסך עבור מעכבי mPPase ניצול מוליבדן תגובה כחולה במערכת 96 צלחת היטב. אנו משתמשים mPPase מן החיידק תרמופילית תרמוטוגה מארימה (tmppase) כאנזים מודל. פרוטוקול זה הוא פשוט וזול, הפקת תוצאה עקבית ואיתנה. זה לוקח רק שעה אחת כדי להשלים את פרוטוקול התאמת הפעילות מתחילתו של הסדר עד המדידה ספיגת. כיוון שהצבע הכחול המיוצר בתוך מעשה זה יציב למשך פרק זמן ארוך, ניתן לבצע את הפעולות הבאות מיד לאחר האצווה הקודמת, וניתן למדוד את הספיגה מאוחר יותר עבור כל הקבוצות בו. החיסרון של פרוטוקול זה הוא שזה נעשה באופן ידני ולכן יכול להיות מתיש, כמו גם לדרוש כישורים טובים של ליטוף ושמירה זמן. יתר על כן, התמיסה ארגיט-ציטראט המשמשת בטיפול זה מכילה נתרן ארגיט, שהוא רעיל ויש לטפל בו באמצעי זהירות נחוצים.

בפרוטוקול זה, שמונה תרכובות (1-8) נבדקו (איור 2 א) יחד עם idp, מעכבי נפוץ של פירופוספטיות, כשליטה חיובית. כל תרכובת נבדקה בשלושה ריכוזים שונים (1 μM, 5 μM ו-20 μM) בטרילקאט. זרימת העבודה של ההקרנה מתוארת באיור 1, החל ממדגם והכנה מגיב עד למדידה הספיגה ב 860 ננומטר.
בסוף פרוטוקול זה, לאחר תוספת של פתרון A + B ו-ארגיט-ציטראט, הפתרונות מפתחים צבע כחול יציב עם הספיגה המקסימלית ב709 ננומטר ו-860 nm14 בשל היווצרות מור...

כאן אנו מציגים שיטת ההקרנה עבור פירופוספאז ממברנה הממברנה (מתוך מעכבי התרמוטוגה) על בסיס מוליבדן תגובה כחולה בפורמט 96 צלחת היטב.

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

הפרוטוקול שלנו עובד ככלי כדי למצוא תרכובות המעכבות דה-פעילות של pyrophosphatase ממברנה קשורה. ומעכבים אלה עשויים לשמש לטיפול במספר מחלות נסיטיות. פרוטוקול זה זול ופשוט לייצר צבע יציב במשך זמן רב מבלי להראות כל הפרעה בנוכחות ריכוז פוספוליפיד גבוה הנדרש להפעלה מחדש של אנזימים.הכן 10 מיליליטר של פתרון מאגר ההפעלה מחדש, המכיל 20 מילימולרים M-E-S ב- PH 6.5, 3.5% נפח לפי גליצרול נפח, שני מילימולרים D-T-T ו- 0.05%D-D-M. הכינו 10 מיליליטר של מערבל התגובה, המכיל 200 מילימולרים טריס הידרוכלוריד ב PH שמונה. שמונה מילימולאר מגנזיום כלורי, 333 מילימולר אשלגן כלורי, ו 67 מילימולר נתרן כלורי.כדי להכין 30 מיליגרם למיליליטר ליפוזומים להפעלה מחדש של אנזימים. ראשית, להוסיף 10 מיליליטר של 20 מילימולר של טריס הידרוכלוריד ב PH שמונה, עם אחד מילימולר D-T-T ל 0.3 גרם של L אלפא פוספטידילכולין מפולי סויה. שים את ליפוזום על קרח sonicate עם מרווחים שלאחר שנייה אחת במשך דקה אחת.השתהה לדקה אחת וחזור על הפעולה עד שהפתרון יהפוך לצהוב שקוף. עליקוט ליפוזומים ב 100 microliters, להקפיא את החנקן הנוזלי ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס שלילי עד לשימוש. כדי להפעיל מחדש את האנזים, להפשיר את פתרון ליפוזום בטמפרטורת החדר.יש לערבב 40 מיקרוליטרים של תוסף ליפוזום עם 22.5 מיקרוליטר של 20%D-D-M. שומרים את התערובת על 55 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הוסף 36.5 מיקרוליטרים של פתרון מאגר ההפעלה מחדש. מערבבים ומוסיפים מיקרוליטר אחד של חלבון מרוכז כדי ליצור ריכוז כולל של 0.13 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן, להעביר 20 microliters של האנזים מחדש ל 1480 microliters של תערובת התגובה.מערבבים בעדינות ולהשתמש מיד. ראשית, להמיס את התרכובות D-M-S-O כדי להפוך פתרונות מלאי של 50 מילימולרים ב 200 microliters. עבור תרכובות מסיסים לדלל את פתרון המלאי עם מים למיליליטר אחד צינורות מיקרו, לתת שניים, 10, ו 100 micromolar.עבור כל דילול, מערבולת הפתרון המורכב לערבוב נכון. לאחר מכן, לבדוק את הסטייה מורכבת, באמצעות צינור רב ערוצי, לוותר 75 microliters של תערובת התגובה לתוך כל באר בצלחת 96-well. מוסיפים 75 מיקרוליטרים של כל תרכובת ומים כבקרה בטריליקט, ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה חמש פעמים.למדוד כל באר ב 300 וולט באמצעות נפאלומטר מיקרופלאט. כדי להכין את פתרון ציטראט ארסניט, משקל חמישה גרם של נתרן ארסניט וחמישה גרם של טריסודיום ציטראט דיהידראט, להמיס את שתי התרכובות לתוך 100 מיליליטר של מים. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית.מערבבים ומוסיפים מים ל-250 מיליליטר, מאחסנים בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. לאחר מכן, להכין פתרון A על ידי הוספת 10 מיליליטר של קרח קר 0.5 חומצה הידרוכלורית טוחנת ל 0.3 גרם של חומצה אסקורבית להמיס את החומצה אסקורבית על ידי מערבולת. הכן פתרון B על ידי הוספת מיליליטר אחד של מים קרים קרח ל 70 מיליגרם של אמוניום tetrathiomolybdate tetrahydrat, ומערבולת להתמוסס.חנות פתרון A ו- B על קרח. כדי להכין את תקן הפוספט עם ריכוז של אפס, 62.5, 250 ו 500 micromolar לכיול. הוסף אפס מיקרוליטרים, 12.5 מיקרוליטרים, 50 מיקרוליטרים ו-100 מיקרוליטרים של 5 מילימולרים דיהידראקט דיהידראקט פוספט לארבעה צינורות מיקרו המכילים 370 מיקרוליטרים של תערובת התגובה.למעלה עד מיליליטר אחד עם מים. עכשיו להוסיף מיליליטר אחד של פתרון B ל 10 מיליליטר של פתרון A, לערבב ביד ולאחסן את הפתרון על קרח. באמצעות צינור רב-ערוצי, הוסף 40 מיקרוליטרים של אפס, 62.5, 250 ו- 500 תקן פוספט מיקרומולרי לתסריטי הצינור ב- triplicate.לאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים של פתרון מורכב ו-15 מיקרוליטרים של תערובת פתרון M-P-P-A של כל צינור. חוץ מהצינורות המכילים תקן פוספט. לאטום את רצועות הצינור עם גיליון איטום דבק.חותכים את גיליון האיטום כדי להפריד כל רצועת צינור. לאחר מכן, הדגירה מראש את המדגם במשך חמש דקות ב 71 מעלות צלזיוס. מניחים את המדגם על בלוק החימום עם מרווחים של 20 שניות בין כל רצועה.עבור כל רצועה, לפתוח את איטום דבק. באמצעות צינור רב ערוצי, להוסיף 100 microliters של שני דיבסיק נתרן פירוספט טוחנת. ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה במשך חמש פעמים.לאטום את רצועת הצינור שוב באמצעות אותו איטום. דגירה שוב ב 71 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, מניחים את הדגימות על מנגנון הקירור עם מרווח של 20 שניות בין כל רצועה.תן להם להתקרר במשך חמש דקות ולאחר מכן צנטריפוגה כל רצועה לזמן קצר כדי decant טיפות המים מתחת גיליון האיטום. להחזיר את הרצועה למנגנוני הקירור, להסיר את האיטום ולתת להם להתקרר עוד חמש דקות. לאחר מכן מוסיפים 60 מיקרוליטרים של פתרון A ו- B, מערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה במשך חמש פעמים, ולשמור את פסי הצינור על מנגנון הקירור במשך 10 דקות נוספות.במכסה המנוע של האדים, הוסיפו 90 מיקרוליטרים של תסריט הארסניט ושמור על טמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. כדי ליצור צבע כחול יציב. מחלקים 180 מיקרוליטרים של כל תערובת תגובה למיקרופלסטיק פוליסטירן ברור של 96 באר.השתמש בספקטרופוטומטר מיקרופלאט כדי למדוד את הספיגה של כל באר ב 860 ננומטר. בפרוטוקול זה, שמונה תרכובות נבדקו יחד עם I-D-P, מעכב נפוץ של pyro phosphatase כשליטה חיובית. לאחר הוספת פתרון A ו- B, ו ארסניט ציטראט, צבע כחול ב 30 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר.כל שלושת הריכוזים של תרכובות לא מעכבות, הציגו את אותה עוצמת צבע כחול. כמו גם E-1 כדי E-3 ללא כל מעכב. העלילה של פעילות אנזימטית נגד הריכוז של כל תרכובת נבדק, מראה כי המתחם עם פעילות עיכוב נוצר עקומה לא ליניארית הולם.העלילה של I-D-P כשליטה חיובית, מראה בבירור ירידה בפעילות בריכוזים גבוהים יותר. עקומת העיכוב לתרכובות 1, 5, 6, 7 ו-8. מראה ריכוזי מעכבות מרביים למחצה ב 1.7 מיקרומולר, 21.4 מיקרומולר, 58.8 מיקרומולר, 239.0 micromolar, ו גדול מ 500 micromolar, בהתאמה.זכור להתכונן, פתרון M-P-P-A. ממש לפני תחילת ההתנגדות.

screening-for-thermotoga-maritima-membrane-bound-pyrophosphatase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

שיטת אבולוציה מכוונת רומן ספציפית לתחום הנדסת thermostability פותחה וכתוצאה מכך תוקפת לאנזימי bacteriolytic. לאחר סיבוב אחד בלבד של mutagenesis האקראי, אנזים bacteriolytic התפתח, PlyC 29C3, מוצג יותר מכפולה מפעילות שיורית בהשוואה לחלבון פרא מהסוג לאחר דגירת טמפרטורה גבוהה.

שיטת הקרנה חדשה לאבולוציה המכוונת של אנזימי Bacteriolytic Thermostable

מקור: Vidilaseris, K., et al. הקרנה למעכבי פירופוספאטאז הקשורים לממברנה של Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים בדיקה קולורימטרית לסינון מעכבים של פירופוספאטאז הקשור לממברנה חיידקית (mPPase) על ידי כימות שחרור אורתופוספט. השיטה מאפשרת זיהוי תרכובות המעכבות mPPase מ-Thermotoga maritima, מטרה פוטנציאלית לתרופה אנטי-מיקרוביאלית.

סינון מעכבים של פירופוסטאז הקשור לממברנה חיידקית באמצעות בדיקה קולורימטרית 

הדו"ח הנוכחי מתאר בדיקה אנזימטית במבחנה למדידת פעילות פוספטידיל-אתנולמין מתילטרנספראז באמצעות תמציות תאי לישמניה. בדיקה זו מבוססת על העברה של קבוצת מתיל רדיואקטיבית מ-S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine על פוספטידיל-אתנולמין אנדוגני.

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

עבודה זו מציגה שיטה לסריקת תפוקה גבוהה באמצעות מערכת סינון אנזימים גנטית אוניברסלית שניתן ליישם באופן תיאורטי על למעלה מ-200 אנזימים. כאן, מערכת הסינון היחידה מזהה שלושה אנזימים שונים (ליפאז, צלולאז ופוספטאז אלקליין) פשוט על ידי שינוי הסובסטרט המשמש (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ופניל פוספט).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

כמו קולטן קולטן (TLR) איתות משחק תפקיד חשוב פתופיזיולוגיה של מחלות דלקתיות רבות של האדם, ואת הסדרת תגובות TLR על ידי חלקיקי ביו צפוי להיות מועיל בתנאים דלקתיים רבים. תאי ה- THP-1 מבוססי תאים מספקים פלטפורמה סינון רב-תכליתי וחזק לזיהוי מעכבים חדשים של איתות TLR.

הקרנת חלקיקים ביואקטיביים בתאי החיסון Phagocytic עבור מעכבי איתות כמו קולטן איתות

פרוטוקול זה פותח כדי ללמוד את המעבר dimer-dodecamer של TmPep1050, M42 aminopeptidase, ברמה המבנית. זהו צינור פשוט החל מטיהור חלבונים לעיבוד נתוני רנטגן. Crystallogenesis, אינדקס סט נתונים, והחלפה מולקולרית הודגמו באמצעות מקרה של מחקר, TmPep1050H60A H307A משתנה.

קריסטלוגרפיה רנטגן כדי ללמוד את המעבר המדינה אוליגומרית של Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

היכולת להעריך מעורבות היעד על ידי מעכבי מועמד בתאים שלמים היא קריטית לגילוי סמים. פרוטוקול זה מתאר 384 גם פורמט התא סלולרי תרמי shift assay כי אמין מזהה מעורבות היעד הסלולרי של מעכבים מיקוד SHP2 מסוג פראי או גרסאות oncogenic שלה.

הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיית סקר פלואורומטרית המותאמת לזיהוי מעכבי מוצר טבעי/מולקולות קטנות של סינתזת חלבונים. הפרקטיות שלו הופכת אותה למתאימה הן להוראה לתואר ראשון בטכניקות גילוי תרופות והן ליישום בקמפיינים של כימיה רפואית.

פרוטוקול מבוסס פלואורסצנציה לסינון ראשוני של מעכבי סינתזת חלבונים ממקורות טבעיים

למד שיטת סינון לזיהוי מעכבי פירופוספטאז מעוגן ממברנה מ-Thermotoga maritima באמצעות תגובת מוליבדן כחולה בפורמט 96 באריות. פרוטוקול זה פשוט, יעיל ויציב אף בריכוזי פוספוליפידים גבוהים.

הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי

גלה סרטונים נוספים