שימוש בקרום כוראלאלי ממברנה במודל Vivo כדי ללמוד גינקולוגית ואורולוגיים סרטן

חריטה של גידולים על קרום העוף chorioallantoic, או CAM, ניתן להשתמש במחקרים של tumorigenicity, יעילות הטיפול או crosstalk הסלולר. שיטה זו מאפשרת גידול מהיר חסכוני בהגדרה אימונוטוולרנטית ב vivo. באמצעות מודל CAM, גישות טיפוליות חדשניות ניתן לבדוק במהירות באמצעות קווי תאים או אפילו דגימות גידול החולה.

ההיבטים המכריעים ביותר של פרוטוקול זה הם הבטחת היווצרות מצלמת נאותה ולא לשבש את CAM או כלי דם בעת פתיחת הביצים. ביום התפתחותי שבע או שמונה כאשר CAM התפתחה במלואה, לכבות את מסובב הביצים ולהחנות כ 1-3 ביצים לתוך מתלה הביצים בארון biosafety. עם האורות כבויים, מניחים נר ביצה על קליפת הביצה כדי לזהות ולסמן את המיקום של תא האוויר של ביצה אחת, ולאחר מכן להזיז את נר הביצה מעל הקליפה כדי למצוא רשת כלי דם גדולה, סיבוב הביצה לפי הצורך.

כלי דם אידיאלי יתענף ליד אמצע הביצה. השתמש בסמן כדי לעקוב אחר כלי הדם שישמש להשתלה. לאחר הפניית האור למכסה המנוע, השתמש בכלי סיבובי אלחוטי המצויד באבן שחיקה של קרביד סיליקון כדי לקדוח חור קטן במעטפת ישירות מעל מרכז תא האוויר.

כאשר רוב הקליפה הוסרה אך עם קרום פנימי לבן שלם, לקדוח עוד חור קטן שבו חלון כלי הדם ייפתח כפי שהודגם רק. כאשר החור השני מוכן, השתמש במחט מד 18 כדי לנקב בעדינות את הממברנה הפנימית הלבנה מעל תא האוויר ואת כלי הדם דואג כי הממברנה הפנימית הלבנה, אבל לא את CAM, הוא שיבש לאורך כל האזור שנקדח. עם אור מכסה המנוע כבוי שוב, להשתמש בנר הביצה כדי לוודא כי תא האוויר הועבר מקצה הביצה לאזור מעל כלי הדם.

במידת הצורך, מניחים צינורות ואקום מוכנס לתוך בקר פיפטה סביב החור מעל תא האוויר המקורי בעדינות להחיל יניקה בפרץ קצר כדי להזיז את תא האוויר. סמן את קווי המתאר של המיקום החדש של תא האוויר כ 0.5 ס"מ בתוך גבול מצלמת האוויר ולתקן חתיכת סרט אריזה רק גדול מספיק כדי לכסות את החור מעל תא האוויר החדש. לאחר הכנת שתי הביצים האחרות כפי שהודגם זה הרגע, החזירו את הביצים לאנקובטור ופתחו כל ביצים נוספות לניסוי בקבוצות של אחת עד שלוש כפי שהוכח.

כאשר כל הביצים נפתחו, להעביר אחת עד שלוש ביצים עם תאי אוויר שהועברו אל מתלה הביצה בארון biosafety ולהשתמש בכלי סיבובי אלחוטי מצויד גלגל חיתוך עגול לחתוך קו קטן מעל גבול תא האוויר לחלוטין דרך התא מבלי לשבש את CAM או vasculature. באמצעות מספריים מעוגלים, לחתוך סביב תא האוויר הנותר כדי ליצור חלון במעטפת ולאמת את הכדאיות של העובר. עוברים בני קיימא יציגו כלי דם נרחבים, אלבומין ברור, תנועת עוברים ו/או פעימות לב נראות לעין.

בעוברים שאינם ניתנים לשימוש, CAM עשוי להיראות אטום עם מעטים, אם בכלל, כלי קיים העוברים עשויים להיות קטנים או נעדרים ללא תנועה או פעימות לב. באמצעות מטליות סמקין, למשוך חתיכות קטנות של כותנה מכדור כותנה סטרילי בעדינות כתם את פני השטח CAM של העוברים קיימא כדי להסיר את כל אבק פגז ופסולת, ולאחר מכן לכסות את פתיחת הקליפה עם חתיכה אחת של שישה על שבעה סנטימטרים שקוף הסרט ההלבשה מבלי לגעת CAM ולהחזיר את הביצים לאנקובטור עם החלון נפתח פונה למעלה. השתמש חתיכת מתלה ביצה, הקצה של מסובב הביצה, או פריט מתאים אחר כדי לתמוך כל ביצים לשמור מתגלגל.

כדי להכין השעיית תאים סרטניים להשתלה, לקצור את התאים מתרבות התאים הסרטניים של עניין ומעים את התאים על ידי צנטריפוגה. שאף את העל-טבעי ולחץ מחדש מכנית על התאים במדיום השיורי. מניחים את ההשעיה התא על קרח ולהשתמש פיפטה כדי למדוד את נפח התאים באמצעי.

לאחר מכן בצע שימוש חוזר בתאים בריכוז של אחד עד שני מיליון תאים ב 20 עד 100 microliters של בינוני בתוספת 2.7 עד 4 מיליגרם למטריצה חוץ תאית מיליליטר וכל גורמי גדילה או תוספים אחרים של עניין. להשתלת תאים סרטניים, באמצעות טבעת שאינה מקל, מניחים עד שש ביצים להיות מושתלים על מתלה הביצים ולגלגל את הקצוות של הסרט השקוף להתלבש לכיוון החלון הפתוח כדי להסיר את הסרט מן הקונכיות. בדוק אם הביצים הן קיימא ובריאות.

ביצים אידיאליות יהיו כלי גדול עם כלי הסתעפות קטנים יותר בתוך מרכז השטח שנפתח. באמצעות מדפים קשתית מעוקלת, מניחים טבעת סטרילית שאינה מקל על CAM מעל כלי השיט באופן אידיאלי מעל נקודת ענף. השתמש מוט ערבוב זכוכית סטרילית בעדינות שוחקים את CAM ו pipette ההשעיה תא סרטן למרכז הטבעת.

כאשר כל התאים נמסרו, לאטום את הפתח עם חתיכה של רבע אחד של שישה על שבעה סנטימטרים שקוף הסרט ההלבשה ולתייג את הביצה עם ייעוד שתל מתאים. לאחר מכן מניחים את הביצים בבטחה באינקובטור עם פתיחת הקליפה הפונה זקוף. כדי להשתיל תאים סרטניים ללא שימוש בטבעת שאינה מקל, שאף את ההשעיה התא לתוך קצה פיפטה בגודל מתאים והחזקת החלק העליון של הקצה בזהירות להוציא את קצה פיפטה ולהמקם את הקצה אופקית לתוך צלחת סטרילית 10 ס"מ רקמות תרבות.

לאחר שהטיפים נטענו, מניחים את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 דקות, בודקים פולימריזציה לאחר 15 דקות. כמות קטנה של נוזל בדרך כלל לדלוף החוצה כמו כל קצה ממוקם בצלחת. השתמש בנוזל זה כדי להעריך את היקף הפולימריזציה בתוך הקצה.

כאשר המטריצה מוכנה, מניחים קצה אחד על פיפטה בגודל מתאים ומדכאים את הבוכנה כדי לאלץ את מתלי התאים המפולגים חלקית אל ה- CAM באופן אידיאלי מעל הנקודה המסועפות של כלי גדול ומפותח. בשיטות אלה, הן קווי תאים סרטניים של סרטן השחלות האנושית והן מורין וחתיכות הגידול העיקריות הביאו לחריטה מוצלחת של גידולים עם מורפולוגיות התואמות לאלה שנצפו במודלים אחרים של vivo. מתוך סוגי הגידולים שנבדקו, צמיחת סרטן השחלות הייתה הרבה פחות בולטת ובדרך כלל לא נראתה ללא סיוע של הדמיה bioluminescence.

ההשפעות של הוספת גורמי גדילה או הורמונים בזמן ההשתלה ניתן לבדוק גם באמצעות שיטות אלה. עבור סרטן הכליות, ההשתלה של תאים צלולים תאי הכליה קרצינומה של תאים מקווי תאים הוקמה או חתיכות מגידולים כליות אנושיים ראשוניים מייצרת היווצרות גידול מהירה וחזקה. כמו כן, מספר קווי תאים סרטניים של סרטן הערמונית האנושית ומורין וקווי תאים סרטניים בשלפוחית השתן האנושית וחתיכות הגידול העיקריות שימשו לביסוס גידולים באמצעות מודל זה.

זה חיוני כדי למנוע שיבוש CAM ואת כלי הדם ולוודא כי CAM אינו לדבוק הקליפה בעת פתיחת החלון. לאחר חריטה מוצלחת, מודל CAM יכול לשמש כדי להעריך את היעילות הטיפולית של טיפולים של עניין או אינטראקציות בין סוגי תאים שונים בתוך הגידול.