זיהוי מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת המערכת

האינטראקציה HBX-DDB1 הוא צעד מכריע לקידום שעתוק HPV מ cccDNA, כך פרוטוקול זה עשוי להיות נכס מפתח לגלות סוכנים טיפוליים חדשניים עבור תרופה פונקציונלית HPV. ההליך שלנו הוא פשוט ודורש זמן קצר בלבד כדי לסנן. את האינטראקציה שאני מערבב ניתן לזהות בזמן אמת מבלי לדרוש תות תא.

יתר על כן, איכות ההקרנה משביעת רצון עם ציון גבוה Z פריים. עיכוב האינטראקציה HBX-DDB1 מוביל לשחזור של Smc5/6, מה שמוביל לדיכוי של שעתוק HPV, ביטוי חלבון וייצור cccDNA. מנגנון חדשני זה של פעולה אנטי ויראלית עשוי להתגבר על הלימות של טיפולים HPV הנוכחי.

אינטראקציות חלבון-חלבון הן סוג חשוב של מטרות סמים. החומצה המבוססת על פיצול לוציפראז המתוארת כאן, אשר מתמקדת באינטראקציות בין חלבונים ויראליים וחלבוני HASS, עשויה לספק אסטרטגיה חדשה לפיתוח תרופות למחלות זיהומיות אחרות. למרות שהפרוטוקול שלנו פשוט וקל להבנה, ייתכן שיהיה קשה לשחזר כמה צעדים ללא ההדגמה החזותית.

לכן, ההדגמה החזותית תהיה לעזר רב כדי להבין את הפרוטוקול שלנו. התחל על ידי זריעת חמש פעמים 10 לתאי HEK293T 5 לתוך צלחת 100 מילימטר עם 10 מיליליטר של DMEM, ודגירה אותם לילה ב 37 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרת, לדלל מיקרוגרם אחד כל אחד HBx-LgBit ו SmBit-DDB1 המביעים פלסמידים DNA ומאגר עיבוי DNA עבור נפח כולל של 300 microliters.

מוסיפים 16 מיקרוליטרים של פתרון משפר, ומערבבים את הצינורות על ידי מערבולת לשנייה אחת. דגירה המדגם בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להוסיף 60 microliters של רגנט transfection. מערבולת הצינור במשך 10 שניות, ודגירה את המדגם לעוד שמונה דקות.

בינתיים, שאפו את המדיום מהצלחת עם התאים ושטפו אותם בחמישה מיליליטר של PVS. שאפו את ה-PVS והוסיפו שבעה מיליליטר של DMEM. מוסיפים שלושה מיליליטר של DMEM לצינור עם קומפלקסים transfection, פיפטה למעלה ולמטה לערבב, ולהוסיף את התערובת לתאים.

לאחר מכן, הדגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני במשך 10 שעות. לאחר הדגירה, להסיר את מדיום התרבות בילה, ולשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של PVS. הסר את PVS במיליליטר אחד של 0.25%trypsin EDTA, ולהדגר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק אותם.

לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של DMEM, ולפזר את המדיום על ידי צינורות אותו על פני השטח של שכבת התא מספר פעמים, ולהעביר את ההשעיה לצינור. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים G במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשליך את supernatant, ולהשעות מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של PVS. חזור על האטריפוגה והשליך את העל-טבעי.

לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא עם מדיום תרבות תאים במאגר בתוספת 10%FBS לצפיפות זריעה של מיליון תאים למיליליטר. פיפטה 50 מיקרוליטרים של ההשעיה התא לתוך כל באר של צלחת 96 באר, ולהחזיר את התאים לאנקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות. בעוד התאים דגירה, לדלל את תרכובות ההקרנה ממס ל 13.5 X ריכוז.

מוסיפים 12.5 מיקרוליטרים של מצע זוהר לכל באר, ומטגרים את הצלחת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. למדוד את הזוהר הבסיסי עם לומינומטר, ולהוסיף חמישה microliters של תרכובות DMSO מבוקר לכל גם מיד לאחר. למדוד זוהר כל 30 דקות במשך שעתיים, ולאחר מכן לחשב את ההשפעות המעכבות של תרכובות בהשוואה לטיפול DMSO.

אותות זוהר בסיסיים נמדדו ויחס האות לרקע חושב להיות גדול מ- 80. ה-Z prime היה גדול מ-0.5, מה שמצביע על כך שמערכת הבדיקות הזו מקובלת על סינון תפוקה גבוהה. על ידי הגדרת הסף ליותר מ 40% עיכוב לעומת השליטה DMSO בלבד, nitazoxanide זוהה תרופה מועמד.

זיהינו בעבר nitazoxanide כמעכב של האינטראקציה HBX-DDB1 על ידי הקרנת ספריית תרכובת בקנה מידה קטן תגובתי בשיטה זו. באמצעות nitazoxanide, אנו מאשרים כי עיכוב של האינטראקציה HBX-DDB1, כי הפחתה של שעתוק ויראלי, ואת רמות המוצר ויראלי הבאים. החלק האופטימלי של לוציפראז מפוצל התמזגו חלבון היעד חייב להיקבע מראש.

במקרה זה, HPX התמזגה לסיביות גדולות במסוף C של HPX ו- DDB1 מותכת לסיביות קטנות בסוף הסיום של DDB1 סיפקה את התוצאות הטובות ביותר.