Name: זיהוי מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת המערכת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: חקור שיטת סקר לזיהוי מעכבי האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות מערכת פיצול לוציפראז. השיטה מאפשרת גילוי בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-חלבון ללא פירוק תאים, ומסייעת בפיתוח סוכני טיפול חדשים נגד נגיף הפטיטיס B.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים בסיוע ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה, יפן (#19H03430 ו#17K09405 לשיטת הפעולה, ו #19J11829 ל K.S.), על ידי גרנט-in-Aid עבור מחקר מדעי על אזורים חדשניים (#18H05024 לשיטת הפעולה), על ידי תוכנית מחקר על הפטיטיס מן הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח, (כדי שיטת פעולה, #JP19fk021005), על ידי תוכנית על פיתוח חדשני ויישום של תרופות חדשות עבור צהבת B (#JP19fk0310102 K.K.) מ-, על ידי הקרן היפנית עבור אנזיולוגיה שימושית ומקרן קוביאשי לחקר הסרטן (כדי שיטת פעולה), על ידי יפן GSK מחקר מענק 2018 (כדי K.S.), ועל ידי מענק מן הקרן מייקאווה מחקר הזיכרון (כדי K.S.).

הערה: ייצוג סכמטי של שיטת הפיצול לוציפראז מוצג באיור 1A, ותהליך העיבוד מתואר באיור 1ב. ניתן למדוד את הדינמיקה ההדדית בזמן אמת ללא האפשרות לפירוק תאים.
1. הכנה לתא
<ol><li>לשמור על התאים הHEK293T תרבותי ב בינונית הנשר שונה ביותר של Dulbecco (DMEM) שיושלם עם 10% v/v העובר סרום (FBS), 1x פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° c בתוך 20% O2 ו 5% CO2.</li>
	<li>זרע 5 x 106 תאים לתוך צלחת 100 מ"מ עם 10 מ ל של dmem ו-מודטה ב 37 ° c לילה.</li>
	<li>Transfect 1 μg של HBx ו DDB1 עם פיצול לוציטיות לתוך התאים בהתאם לשיטה הבאה. הערה: כמות העירוי של הדנ א הפלסטי עשויה להיות תלויה בעוצר החצייה שבשימוש. המיקום האופטימלי של מפוצל לוציפראז התמזגו חלבון היעד חייב להיקבע מראש. במקרה זה, HBx התמזגו lgbit ב C-הטרמינוס של HBx (HBx-lgbit) ו DDB1 התמזגו smbit ב-הטרמינוס של DDB1 (smbit-DDB1) סיפק את התוצאות הטובות ביותר (כלומר, אותות ללוציפראז המבריקים ביותר). תהליך זה דווח בעבר בפירוט7.<ol>
<li>לדלל 1 μg של HBx-LgBit ביטוי ה-DNA פלאמיד 1 μg של SmBit-DDB1 ביטוי ה-DNA פלמיד (טבלת חומרים) ב-dna עיבוי מאגר (טבלת חומרים) לנפח הכולל של 300 μl.</li>
		<li>הוסף 16 μL של פתרון שיפור (טבלת חומרים) ולערבב על ידי vortexing עבור 1 s.</li>
		<li>מודקון את המדגם בטמפרטורת החדר עבור 3 דקות.</li>
		<li>הוסף 60 μL של העברת מגיב (טבלת חומרים) למדגם ולערבב על ידי vortexing עבור 10 s.</li>
		<li>מודקון את המדגם בטמפרטורת החדר עבור 8 דקות.</li>
		<li>במהלך הדגירה, מטפי את המדיום התרבותי ממנה (מוכן בשלב 1.2), ומכבסת תאים עם 5 מ ל של תמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS). הוצא את PBS על ידי שאיפה והוסף 7 מ ל של DMEM.</li>
		<li>הוסיפו 3 מ ג של DMEM לצינור המכיל את מכלולי החצייה. מערבבים באמצעות ליטוף ומוסיפים את מכלולי ההעברה אל התא בצלחת 10 ס מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה את התאים ב 37 ° c בחממה תחת 5% CO2 עבור 10 h.</li>
	<li>Reseed את התאים לתוך צלחת לבן 96 לוחית בגודל 5 x 104 תאים/גם ב 50 μl של בינוני/טוב בהתאם לשיטה הבאה.<ol>
<li>הסר את המדיום של תרבות התא שהושקע ושטוף תאים עם 5 מ ל של PBS.</li>
		<li>הסר את ה-PBS על ידי השאיפה, להוסיף 1 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA, ו מודחלת ב 37 ° c עבור 5 דקות לנתק תאים.</li>
		<li>הוסף 4 מ ל של DMEM ופזר את המדיום על ידי ליטוף מעל פני השטח של שכבת התא מספר פעמים. . העבר את ההשעיה של התא לשפופרת</li>
		<li>בתאי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>. והשהה מחדש את הגלולה ב-100 מ ל של PBS</li>
		<li>צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהיפטר supernatant.</li>
		<li>לדלל את הגלולה תא עם התרבות התא באגירה בינונית (טבלה של חומרים) שיושלם עם 10% fbs לצפיפות הזריעה של 1.0 x 106 תאים/mL.</li>
		<li>פיפטה 50 μL של תא הבולם לתוך כל באר של 96 צלחת הבאר ולהחזיר את התאים לחממה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התאים הדגירה ב 37 ° c תחת 5% CO2 עבור 10 h.</li>
</ol>2. הקרנה מורכבת
<ol><li>במהלך הדגירה, לדלל את תרכובות ההקרנה (טבלת חומרים) ו ממס (diמתיל סולפוקסיד [dmso]) בריכוז 13.5 x. לדוגמה, אם המניה היא 10 מ"מ והריכוז ההקרנה הוא 10 μM, להוסיף 1 μL של פתרון מניות כדי 73.1 μL של התרבות התא באגירה בינונית.</li>
	<li>הוסף 12.5 μL של המצע זורח (טבלה של חומרים) על כל טוב ומארג עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: כפקדים שליליים, הבארות בשני קצות הצלחת (כלומר, עמודות 1 ו-12) לא אמורות להכיל מצע לא זורח.</li>
	<li>למדוד את האור הבסיסי באמצעות לומימטר (טבלת חומרים).</li>
	<li>מיד לאחר המדידה הראשונית, להוסיף 5 μL של תרכובות ושליטה DMSO מדולל בשלב 2.1 לכל הבאר. הערה: הריכוז הסופי יהיה 10 μm.</li>
	<li>מדידת ערכי האור כל 30 דקות עבור 2 h. הערה: הצלחת להיות מודקת בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לחשב את אפקטי העכבות על-ידי השוואה עם טיפול DMSO בקרה לאחר נורמליזציה לאותות בסיסיים. הערה: הקרנתכל תרכובת בכפולה או בטרילקאט עלולה להפחית את הווריאציה.</li>
</ol>

<ol><li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hepatitis+B+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li>
<li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+pathogenesis%3A+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li>
<li>Slagle, B. L., Bouchard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+X+and+regulation+of+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402(2016).</li>
<li>Murphy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+Virus+X+Protein+Promotes+Degradation+of+SMC5%2F6+to+Enhance+HBV+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication.</a> Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).</li>
<li>Decorsière, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+X+protein+identifies+the+Smc5%2F6+complex+as+a+host+restriction+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor.</a> Nature. 531, 386-389 (2016).</li>
<li>Niu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smc5%2F6+complex+restricts+HBV+when+localized+to+ND10+without+inducing+an+innate+immune+response+and+is+counteracted+by+the+HBV+X+protein+shortly+after+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection.</a> PLoS One. 12, e0169648(2017).</li>
<li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HBV+Transcription+From+cccDNA+With+Nitazoxanide+by+Targeting+the+HBx-DDB1+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).</li>
<li>Eggers, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection%3A+Methods+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Proteomics.+2014%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection: Methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648(2014).</li>
<li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robotic+Platform+for+Quantitative+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).</li>
<li>Skwarczynska, M., Ottmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions as drug targets.</a> Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).</li>
<li>de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-host+interactomics%3A+New+insights+and+opportunities+for+antiviral+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery.</a> Genome Medicine. 6, 115(2014).</li>
<li>Prasad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-Host+Interactions%3A+New+Insights+and+Advances+in+Drug+Development+Against+Viral+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens.</a> Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

פיתחנו שיטת הקרנה נוחה באמצעות מפוצל לוציפראז למצוא מעכבי HBx-DDB1 קשירה. הדינמיקה אינטראקציה ניתן לזהות בזמן אמת בתאי החיים ללא צורך בפירוק תאים. עיכוב של HBx-DDB1 אינטראקציה מוביל שחזור של Smc5/6, אשר גורמת לדיכוי של תמלול ויראלי, ביטוי חלבון, ו cccDNA ייצור7. זה מנגנון הרומן של פעולה אנטי ויראליות יכול להתגבר על מחדלים של טיפולים HBV הנוכחי.
למרות שמספר שיטות זמינות לחקירת אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתאי החיים, בחינת האינטראקציות הללו נותרות קשות10...

צהבת B וירוס (HBV) זיהום הוא בריאות הציבור העיקרי הדאגה ברחבי העולם, עם הערכות שנתיות של 240,000,000 אנשים באופן כרוני נגוע HBV ו 90,000 מקרי מוות עקב סיבוכים מן הזיהום, כולל שחמת וקרצינומה hepatocellular (HCC)1. למרות שהסוכנים הטיפוליים הנוכחיים אנטי-HBV, הנוקלאואים (t) ide, מעכבים מספיק שעתוק ויראלי, הם לרוב משיגים את חיסול החלבונים הנגידיים, שהיא המטרה הקלינית ארוכת הטווח. ההשפעה הירודה שלהם על חיסול חלבון נגיפי נובע היעדר השפעה ישירה על תמלול ויראלי מ epiזומביים ויראלי סגור DNA מעגלי (cccDNA) מיני כרומוזומי בגרעין hepatocyte2.
תמלול HBV מופעל ע י חלבון התקינה HBV X (HBx)3. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפה כי HBx מוחלק תחזוקה מבנית של כרומוזומים 5/6 (Smc5/6), גורם הגבלה מארח כי חוסם hbv תמלול מ cccdna, באמצעות חטיפת DDB1-CUL4-ROC1 E3 אוביקוויב ליגאז קומפלקס4,5,6. לכן, צעד מכריע בקידום תמלול ויראלי מ-cccDNA נחשב לאינטראקציה HBx-DDB1. תרכובות מסוגלות לעכב את הכריכה בין HBx ו-DDB1 עשוי לחסום תמלול ויראלי, ואכן nitazoxanide זוהה כמדכא של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות מערכת הקרנה שפותחה במעבדה שלנו7.
כאן, אנו מציגים את מערכת ההקרנה הנוחה שלנו משמש לזיהוי מעכבי של HBx-DDB1 אינטראקציה, אשר משתמשת מפוצל לוציפראאז שיטה משלימה7,8. פיצול יחידות משנה מפוצל ל HBx ו DDB1, ואת האינטראקציה HBx-DDB1 מביא את תת היחידות לתוך קרוב ליצור אנזים פונקציונלי שמייצר אות זורח בהיר. כאשר האינטראקציה בין תת היחידות היא הפיכה, מערכת זו יכולה לזהות במהירות HBx-DDB1 חלבונים (איור 1). באמצעות מערכת זו, ספריית מתחם גדול ניתן להקרנה בקלות, אשר עשוי לגרום לגילוי של תרכובות הרומן מסוגל לעכב ביעילות את HBx-DDB1 אינטראקציה.

<table><tbody><tr><td>מיקרו-צלחת תרבית תאים, 96 בארות, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3176</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה אפקטן</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>כולל מאגר עיבוי DNA, תמיסת משפר ומגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Nichirei</td><td></td><td></td>175012</tr><tr><td>GloMax 96 מיקרופלייט לומינומטר</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>HBx&ndash; LgBit מבטא DNA פלסמיד</td><td>המעבדה</td><td></td> שלנו <td>זמינה על פי בקשה</td></tr><tr><td>HEK293T תאים</td><td>אוסף תרבית מסוג אמריקאי</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI מערכות התחלה</td><td>Promega</td><td>N2015</td><td>כולל Nano-Glo Live Cell Reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>מתואר כ"מדיום תרבית תאים חוצץ" בכתב היד</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>ספריית תרופות שאושרה על ידי ה-FDA V2 גרסה 1.0</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-2841</td><td>התרכובות ששימשו כאן היו כדלקמן: מקינול, מרקפטופורין הידרט, מסנה, מסטרנול, מטפרוטרנול המיסולפט, מטארמינול ביטרטרט, מטקסלון, מתכולין כלוריד, מתאזולמיד, מתנאמין היפוראט, מתוקרבמול, מטוטרקסט, מתוקסלן, מתסקופולמין ברומיד, מתסוקסימיד, מתיקלוטיאזיד, מתיל אמינולוולינט ומידוט; HCl, מתילרגונובין מלאט, מטולזון, מטירפון, מקסילטין ומידוט; HCl, micafungin, miconazole, midodrine&middot; HCl, מיגליטול, מילנאציפרן ומידוט; HCl, מירטזאפין, מיטוטן, מוקסיפריל ומידוט; HCl, מומטזון פורואט, מופירוקין, נדולול, נפצילין ומידוט; Na, naftifine&middot; HCl, נרטריפטן&middot; HCl, נטמיצין, נביבולול ומידוט; HCl, נלרבין, נפפנק, נביראפין, ניאצין, ניקוטין, נילוטיניב, נילוטמיד, ניטאזוקסאניד, ניטיסינון, ניטרופוראנטואין, ניזטידין, נורטריפטילין ומידוט; HCl, אולסלזין ומידוט; Na, אורליסטט, אוקספרופרוזין, אוקסטריפילין, אוקסיבוטינין כלוריד, אוקסי-טטרציקלין&מידוט; HCl, פליפרידון, פלונוסטרון ומידוט; HCl, paromomycin sulfate, pazopanib&middot; הידרוכלוריד, פמטרקסד דיסודיום, פמירולסט האשלגן, פניצילמין, פניצילין G אשלגן, פנטמידין איזתיונאט, פנטוסטטין, פרינדופריל ארבומין, פרמתרין, פרפנאזין, פנלזין סולפט, פנילפרין, פיטונדיון, פימקרולימוס, פיטבסטטין סידן, ופודופילוקס</td></tr><tr><td>SmBit&ndash; DDB1 מבטא DNA פלסמיד</td><td>המעבדה</td><td></td> שלנו <td>זמינה על פי בקשה</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי מעכבי של האינטראקציה hbx-ddb1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת המערכת

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

יש צורך דחוף סוכנים טיפוליים חדשניים עבור צהבת B וירוס (HBV) זיהום. למרות שהנוקלאונוס הזמינים כרגע (t) מעכבים שכפול ויראלי, אין להם השפעה ישירה על הביטוי של חלבונים ויראליות ששועתק מתוך דנ א ויראלי סגור DNA עגול (cccDNA). כמו לטעון אנטיגן ויראלי גבוהה עשוי לשחק תפקיד זה כרונית ו-HBV הקשורים קרצינובגנזה, המטרה של הטיפול HBV היא לבער חלבונים ויראלי. החלבון HBV התקינה X (HBx) נקשר ל-DNA מארח נזק מחייב חלבון 1 (DDB1) חלבון כדי לבזות תחזוקה מבנית של כרומוזומים 5/6 (Smc5/6), וכתוצאה מכך הפעלת תמלול ויראלי מ cccDNA. כאן, באמצעות מפוצל לוציפראז מערכת שיטת הטיפול, אנו מציגים מערכת מקיפה הקרנת מתחם כדי לזהות מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1. הפרוטוקול שלנו מאפשר זיהוי קל של הדינמיקה ההדדית בזמן אמת בתוך תאים חיים. טכניקה זו עשויה להפוך להיות מפתח מרכזי כדי לגלות סוכנים טיפוליים חדשניים לטיפול בזיהום HBV.

תוצאות הנציג בעקבות השימוש בפרוטוקול זה מוצגות באיור 2א, ב. היחס בין האות לרקע היה גדול מ-80 ו-Z פקטור9 (מדד האיכות של הזהב להקרנה בתפוקה גבוהה) היה גדול מ-0.5, והצביע על כך שמערכת שיטה זו הייתה מקובלת עבור הקרנת תפוקה גבוהה. עם הסף שנקבע ל-&gt; 40% עיכוב לעומת הפקד (DMSO בלבד), זיהינו nitazoxanide בתור סם מועמד7. באמצעות מערכת זו, סמים מועמדים טובים יותר ניתן למצוא על ידי הקרנת ספריות אחרות, גד...

כאן, אנו מציגים שיטה להקרנה אנטי צהבת B סוכנים ויראליים לעכב את האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת שיטת. מערכת זו מאפשרת זיהוי קל של אינטראקציות חלבון-חלבון והיא מתאימה לזיהוי מעכבי של אינטראקציות כאלה.

זיהוי מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת המערכת

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

האינטראקציה HBX-DDB1 הוא צעד מכריע לקידום שעתוק HPV מ cccDNA, כך פרוטוקול זה עשוי להיות נכס מפתח לגלות סוכנים טיפוליים חדשניים עבור תרופה פונקציונלית HPV. ההליך שלנו הוא פשוט ודורש זמן קצר בלבד כדי לסנן. את האינטראקציה שאני מערבב ניתן לזהות בזמן אמת מבלי לדרוש תות תא.יתר על כן, איכות ההקרנה משביעת רצון עם ציון גבוה Z פריים. עיכוב האינטראקציה HBX-DDB1 מוביל לשחזור של Smc5/6, מה שמוביל לדיכוי של שעתוק HPV, ביטוי חלבון וייצור cccDNA. מנגנון חדשני זה של פעולה אנטי ויראלית עשוי להתגבר על הלימות של טיפולים HPV הנוכחי.אינטראקציות חלבון-חלבון הן סוג חשוב של מטרות סמים. החומצה המבוססת על פיצול לוציפראז המתוארת כאן, אשר מתמקדת באינטראקציות בין חלבונים ויראליים וחלבוני HASS, עשויה לספק אסטרטגיה חדשה לפיתוח תרופות למחלות זיהומיות אחרות. למרות שהפרוטוקול שלנו פשוט וקל להבנה, ייתכן שיהיה קשה לשחזר כמה צעדים ללא ההדגמה החזותית.לכן, ההדגמה החזותית תהיה לעזר רב כדי להבין את הפרוטוקול שלנו. התחל על ידי זריעת חמש פעמים 10 לתאי HEK293T 5 לתוך צלחת 100 מילימטר עם 10 מיליליטר של DMEM, ודגירה אותם לילה ב 37 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרת, לדלל מיקרוגרם אחד כל אחד HBx-LgBit ו SmBit-DDB1 המביעים פלסמידים DNA ומאגר עיבוי DNA עבור נפח כולל של 300 microliters.מוסיפים 16 מיקרוליטרים של פתרון משפר, ומערבבים את הצינורות על ידי מערבולת לשנייה אחת. דגירה המדגם בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להוסיף 60 microliters של רגנט transfection. מערבולת הצינור במשך 10 שניות, ודגירה את המדגם לעוד שמונה דקות.בינתיים, שאפו את המדיום מהצלחת עם התאים ושטפו אותם בחמישה מיליליטר של PVS. שאפו את ה-PVS והוסיפו שבעה מיליליטר של DMEM. מוסיפים שלושה מיליליטר של DMEM לצינור עם קומפלקסים transfection, פיפטה למעלה ולמטה לערבב, ולהוסיף את התערובת לתאים.לאחר מכן, הדגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני במשך 10 שעות. לאחר הדגירה, להסיר את מדיום התרבות בילה, ולשטוף את התאים עם חמישה מיליליטר של PVS. הסר את PVS במיליליטר אחד של 0.25%trypsin EDTA, ולהדגר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק אותם.לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של DMEM, ולפזר את המדיום על ידי צינורות אותו על פני השטח של שכבת התא מספר פעמים, ולהעביר את ההשעיה לצינור. צנטריפוגה התאים ב 500 פעמים G במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשליך את supernatant, ולהשעות מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של PVS. חזור על האטריפוגה והשליך את העל-טבעי.לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא עם מדיום תרבות תאים במאגר בתוספת 10%FBS לצפיפות זריעה של מיליון תאים למיליליטר. פיפטה 50 מיקרוליטרים של ההשעיה התא לתוך כל באר של צלחת 96 באר, ולהחזיר את התאים לאנקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות. בעוד התאים דגירה, לדלל את תרכובות ההקרנה ממס ל 13.5 X ריכוז.מוסיפים 12.5 מיקרוליטרים של מצע זוהר לכל באר, ומטגרים את הצלחת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. למדוד את הזוהר הבסיסי עם לומינומטר, ולהוסיף חמישה microliters של תרכובות DMSO מבוקר לכל גם מיד לאחר. למדוד זוהר כל 30 דקות במשך שעתיים, ולאחר מכן לחשב את ההשפעות המעכבות של תרכובות בהשוואה לטיפול DMSO.אותות זוהר בסיסיים נמדדו ויחס האות לרקע חושב להיות גדול מ- 80. ה-Z prime היה גדול מ-0.5, מה שמצביע על כך שמערכת הבדיקות הזו מקובלת על סינון תפוקה גבוהה. על ידי הגדרת הסף ליותר מ 40% עיכוב לעומת השליטה DMSO בלבד, nitazoxanide זוהה תרופה מועמד.זיהינו בעבר nitazoxanide כמעכב של האינטראקציה HBX-DDB1 על ידי הקרנת ספריית תרכובת בקנה מידה קטן תגובתי בשיטה זו. באמצעות nitazoxanide, אנו מאשרים כי עיכוב של האינטראקציה HBX-DDB1, כי הפחתה של שעתוק ויראלי, ואת רמות המוצר ויראלי הבאים. החלק האופטימלי של לוציפראז מפוצל התמזגו חלבון היעד חייב להיקבע מראש.במקרה זה, HPX התמזגה לסיביות גדולות במסוף C של HPX ו- DDB1 מותכת לסיביות קטנות בסוף הסיום של DDB1 סיפקה את התוצאות הטובות ביותר.

identifying-inhibitors-hbx-ddb1-interaction-using-split-luciferase

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מיקרו RNA (miRNAs) הם הרגולטורים החשובים של ביטוי גנים הוכחו לשחק תפקיד תהליכים ביולוגיים רבים. כדי להבין טוב יותר מירנה-UTR אינטראקציות, יצרנו אוסף גנום רחב של 3 כתבים UTR בלוציפראז יחד עם הגן בלוציפראז הרומן מגיב assay, מערכת LightSwitch.

זיהוי מטרות של רנ&quot;א האדם עם מערכת Assay בלוציפראז LightSwitch באמצעות 3&#39;UTR-הכתב בונה microRNA מחקים בתאים חסיד

סרטון זה מדגים את בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון. בבדיקה זו, החלבונים המעניינים מתויגים למקטעים קטנים וגדולים של האנזים לוציפראז. כאשר החלבונים מתקשרים, המקטעים הגדולים והקטנים משתלבים ליצירת קומפלקס אנזימים פעיל, אשר בנוכחות מצע מסוים, משחרר זוהר בהיר שניתן למדוד.

בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

חלבונים מתקשרים זה עם זה ואינטראקציות אלה קובעות במידה רבה את תפקודיהם. ניתן לזהות שותפים לאינטראקציה עם חלבונים בתפוקה גבוהה in vivo באמצעות בדיקת כושר שמרים המבוססת על בדיקת השלמת שבר חלבון דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור פיצול-BioID, שיטת שברי-קומפלמנטציה מבוסס על טכניקת קרבה-תיוג BioID. מופעל על האינטראקציה של שני חלבונים נתונה, היא מאפשרת ניתוח פרוטאומיקס של חלבונים תלויי-ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית. השיטה היא פשוטה, חסכונית ודורש רק ציוד מעבדה סטנדרטיים.

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

כאן אנו מציגים ביוסנסור מבוססי לוציפראז לכמת את פעילות קינאז מדכאי גדולים (באמת)-קינאז המרכזית בההיפופוטם איתות. ביוסנסור הזה יש יישומים שונים ומגוונים במחקר בסיסי והתרגום שמטרתה לחקור היפו מסלול הרגולטורים במבחנה וב -vivo.

ניטור היפו איתות לשביל פעילות באמצעות ביוסנסור משתיק קול (באמת) מבוסס-לוציפראז הגידול גדול

אנו מציגים שיטה לניתוח את 4-הידרוקסי-טמוקסיפן-תלוי הקולטן אלפא ליגנד מחייב תחום dimerization פעילות האסטרוגן שימוש בתרבית של שני-היברידית וזמינותו.

זיהוי ליגנד מחייב תחום פעילות Dimerization אלפא קולטן אסטרוגן באמצעות וזמינותו שני-היברידית יונקים

במאמר זה, הצגנו מערכת של שיטות מעשיות ושימושיות לאפיון מוטציות הקשורות למחלות של משפחת חיל-החוץ, הכוללים בתוך שיטת ההפעלה המבחנה, שיתוף הפעולה של החיל המלכותי הבריטי, ובחינה משלימה של פיצול לוציפראז.

אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידת אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים שיאפשר למשתמש להעריך הפרעה הנגרמת על ידי סמים של דינמיקה מורכבת eIF4F בפורמטי סינון.

ניטור הרכבת eIF4F על-ידי מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים

הקמנו בדיקת הרכבה מחדש של לוציפראז מפוצל כדי לפקח על המגעים האנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים. באמצעות בדיקה זו, אנו מתארים פרוטוקול למדידה כמותית של רמת הצימודים הבין-אברונים הללו בתאי HEK293T, בתנאי של טיפול כימי.

בדיקת הרכבה מחדש של Split-Luciferase למדידת מגעים אנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים

חקור שיטת סקר לזיהוי מעכבי האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות מערכת פיצול לוציפראז. השיטה מאפשרת גילוי בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-חלבון ללא פירוק תאים, ומסייעת בפיתוח סוכני טיפול חדשים נגד נגיף הפטיטיס B.

זיהוי מעכבי של האינטראקציה HBx-DDB1 באמצעות פיצול לוציפראז מערכת המערכת

גלה סרטונים נוספים