ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרנסיס מיגס נתמך על ידי מלגת שסופקו על-ידי רשת בריאות הנשימה של קוויבק והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), תוכנית הכשרה לריאות של המכון הימי, מסעדת FRSQ ו-"משלוח של המוני המוני". . הפוסטדואלס, אוניברסיטת מונטריאול עבודה זו נתמכת על ידי כיסא הגוסליס-למררה במחקר קליני והמוסדות הקנדים לחקר הבריאות [במגב-79544].

כל ההליכים בעלי החיים נערכו על פי ההנחיות של המועצה הקנדית על טיפול בעלי חיים ואושרו על ידי ועדת הטיפול המוסדי בעלי חיים של מרכז המחקר של מרכז אשפוז באוניברסיטת מונטריאול (CRCHUM).
1. עיצוב והדור של התגובה הפלבמיד לבטא את גן העניין (הארה)
<ol><li>השתמש וקטור inducible טטרציקלין-off, כגון pTRE-הדוק.</li>
	<li>לנתח את הרצף של ה-הארה והאתר הכפול (MCS) של הווקטור כדי לזהות את אתרי ההגבלה ב-MCS שאינם נמצאים בפנים בתוך הגוי.</li>
	<li>בידוד תאים האפיתל הראשי מכתשיים מ זכר הג-דאולי עכברוש הריאות כמתואר בעבר19,20.</li>
	<li>לטהר את ה-RNA הכולל מתאי האפיתל מכתשיים על ידי חילוץ RNA בשיטה סטנדרטית, כגון מיצוי פנול/כלורופורם או שימוש בעמודות ספין מבוססות-RNA של סיליקה.</li>
	<li>הפוך-תעתור את mRNA ל-DNA משלים (cDNA) באמצעות oligo (dT) ו באיכות גבוהה היפוך הטרנסקריפטאז.</li>
	<li>השתמש באמינות גבוהה Taq פולימראז ו חפיפה סטנדרטית טכניקות PCR כדי לאגף את הגוי עם שני אתרים שנבחרו זיהוי אנזימים הגבלה באמצעות התחל מעוצב.<ol>
<li>יש את התחל הקדמי להכיל את קוזק הקונצנזוס ריבוכמה באתר מחייב21 כדי לשפר את רמות הביטוי כדי ללמוד ביטוי חלבון במקביל עם יציבות mrna. יש לכלול בקידוד רצף את האפיופ של ה-V5 במעלה הזרם של הגוי כדי להבחין בביטוי של הגוי המנוכר מביטוי האנדוגניים (שולחן 1).</li>
		<li>. לאחר העצירה הנגדית</li>
	</ol>
</li>
	<li>מוטנטים יכולים להיווצר על ידי מחיקה סדרתית לחקור את ההשפעות של 3 אזורים UTR שונים על היציבות של mRNA של הגוי באמצעות להפוך את קידוד התחל באתר פוליאדלציה בהדרגה מוחקת את 3 ' הקצה של הגוי 3 ' UTR (איור 6). לחילופין, ניתן להשתמש במוטגנזה בבימויו של PCR כדי למקד אזור מסוים של עניין ב-3 ' UTR22.</li>
	<li>לעכל את הווקטור inducible ואת התוספת עם אנזימי הגבלה שנבחרו בעבר בטמפרטורת הדגירה המתאימה עבור 1 h, ואחריו טיפול עם פוספספטאז במהלך התגובה וקטורית עבור 30 דקות כדי למנוע הכנסה עצמית.</li>
	<li>הפרד את הווקטור מתעכל ומקטעי הוספה על ידי אלקטרופורזה ב 1-1.5% agarose ג'ל (ריכוז בהתאם לגודל של הכנס).</li>
	<li>באמצעות להב ואור UV, לאסוף את שברי ה-DNA המכיל את ההכנסה הרצויה וקטור להיות ligated. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
	<li>לטהר את מקטעים שנאספו ג'ל agarose באמצעות ערכת הטיהור PCR המבוססת על סיליקה ולמדוד את הריכוז על ידי ספקטרופוטומטר ב 260 nm.</li>
	<li>Ligate הגוי ואת וקטור inducible עם T4 DNA לליגאז באמצעות וקטור: להוסיף יחס טוחנת של 1:3 כדי להגדיל את ההסתברות של הארכה. דגירה את התגובה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 3 h.</li>
	<li>הפוך את התגובה הנגדית לתוך E. coli המוסמכת (DH5α).<ol>
<li>הוסף 1-10 ng של וקטור גן לצינור המכיל 100 μL של תאים המוסמכים. דגירה את התאים על הקרח 30 דקות ולאחר מכן חום בהלם תאים ב 42 ° c עבור 45 s. מניחים את השפופרת על הקרח עבור 2 דקות ולהוסיף 900 μL של מדיום RT ליברות. דגירה את התאים עבור 1 h ב 37 ° צ' עם טלטול ב 225 סל ד.</li>
		<li>התפשטות 100 μL של התגובה על צלחת ליברות אגר עם אנטיביוטי מתאים (למשל, 100 μg/mL אמפיצילין עבור וקטור pTRE-הדוק) כדי לבחור את החיידקים שעברו טרנספורמציה. מודקת את הצלחת הלילה ב 37 ° c.</li>
		<li>בחר מושבות בודדות באמצעות לולאת חיסון או 20 μL טיפ ו-דגירה לילה ב 5 mL LB בינונית המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה ב 37 ° c עם טלטול. חיידקים שהפך יכול להיות מאוחסן מניות גליצרול ב-80 ° c ביחס של 400:600 של LB בינונית כדי גליצרול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחלץ את ה-DNA פלמיד באמצעות מבוססי סיליקה בעמודות באמצע ולמדוד את הריכוז על ידי ספקטרופוטומטר ב 260 nm. אשר את החדרת הגוי על ידי ניתוח הגבלה והתמצאות והיעדר מוטציות שעשויות להיות מוכוונות במהלך RT-PCR ברצף.</li>
</ol>2. התמרה של העירוי של התגובה המבטאת את גן העניין (הארה) לתאי אפיתל מכתשיים ראשוניים
<ol><li>לבודד סוג II מכתשיים תאים אפיתל מריאות חולדה.</li>
	<li>הזרע את התאים בצפיפות של 1 x 106 תאים/cm2 ב 100 mm מנות פטרי עם מדיום מינימום חיוני מינימלי (להשלים לזכור). להשלים מחברים הוא מקרן בתוספת עם 10% fbs, 0.08 mg/L tobramycin, septra (3 μg/ml ילדים ו -17 μg/ml סולפאמתוקסאזול), 0.2% נחקו3, 0.01 M hepes (pH = 7.3), ו 2 מ"מ L-גלוטמין. מתרבות התאים 24 שעות ב 37 ° c ב 5% CO2 בחממה לחות.</li>
	<li>ביום למחרת, מקום 500 μL של הגברת המלאה ללא אנטיביוטיקה בכל באר של 12 היטב צלחת חדש ולחמם את הצלחת ב 37 ° c עבור 30 דקות. במהלך שלב זה, חשוב להשתמש סרום העוברי העובר ללא מזהם טטרציקווים או עם רמה נמוכה מדי כדי להפריע התעשייה.</li>
	<li>להכין צינורות 1.5 mL המכיל את הפלס1 עם inducible גוי (הגוי באמצע) ואת וקטור הרגולציה (g., pTet-Off) על ידי הוספת 1 μg של ה-פלבין הגוי ו 1 μg של וקטור הרגולציה לכל טוב ב RT. עבור ניסויים בהבעה עם חלבונים כריכת RNA (RBP), 1 μg של וקטור קונסטיטוטיבי (g., pcDNA3) המבטא את RBP של עניין נוסף לתמהיל DNA (איור 7).</li>
	<li>מנושף את המדיום ושטוף בעדינות את התאים עם ה-PBS (ללא סידן ומגנזיום) שחומם ב37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הוסף 5 מ ל של 0.05% טריפסין מראש ב 37 ° c ו מודדת את התאים עד התאים מנותקים (2-4 דקות). לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 10 מ ל ללא אנטיביוטיקה מלאה.</li>
	<li>לאסוף את ההשעיה התא בצינור 50 mL, לשטוף את צלחת פטרי עם 4 מ ל של בינוני כדי לאסוף כמה שיותר תאים הנותרים ככל האפשר, ולאחר מכן צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 300 x g עבור 5 דקות.</li>
	<li>והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של PBS. הרוזן וחשב את מספר התאים באמצעות הומוציטומטר.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות בעדינות ומכה את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה במאגר מחדש בריכוז של 4 x 107 תאים/mL. הוסף את התאים מצינור 1.5 mL מוכן בשלב 2.4 בריכוז של 400,000 תאים לכל טוב ובעדינות לערבב אותם על ידי ליטוף למעלה ולמטה.</li>
	<li>מניחים את הצינור במכשיר האלקטרופורציה וממלאים אותו ב3.5 mL של מאגר אלקטרוליטי.</li>
	<li>הכניסו טיפ מצופה זהב לתוך פיפטה על ידי לחיצה מלאה על הבוכנה. בעדינות לערבב את התוכן של שפופרת 1.5 mL ולטפל בזהירות את התאים עם הפיפטה. היזהרו למנוע בועות אוויר להזין את הקצה, כמו זה יגרום הובלה חשמלית במהלך אלקטרופורציה ולגרום לירידה ביעילות הזיהום.</li>
	<li>הכנס את הפיפטה לתחנת החשמל עד שיהיה צליל לחיצה.</li>
	<li>בחר את פרוטוקול אלקטרופורציה המתאים לתאי האפיתל מכתשיים, המתאים מתח הדופק של 1,450 V ו 2 פולסים עם רוחב של 20 ms, ולחץ על התחל על מסך המגע.</li>
	<li>מיד לאחר החצייה, להסיר את הפיפטה ולהעביר את התאים היטב מילא בעבר עם הגברת המלאה ללא אנטיביוטיקה כי כבר מראש עד 37 ° c.</li>
	<li>חזור על שלבים 2.11-2.14 עבור הדגימות הנותרות.</li>
	<li>טלטל בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני השטח היטב. מודיית את התאים ב 37 ° c ב 5% CO2 בתוך החממה לחות. לאחר יומיים, החלף את המדיום בעזרת הגברת המלאה באנטיביוטיקה.</li>
	<li>אשר את הצלחת התרגום על ידי התבוננות בביטוי של eGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית או על ידי זרימה cy, לנסות באמצעות וקטור שליטה (איור 1). הערה: שלב זה הוא אופציונלי ודורש צעד נוסף של העברה באמצעות פלסטלינה שונה המבטא eGFP, כגון pcDNA3-EGFP.</li>
</ol>3. אינדוקציה של השעתוק של הגוי
הערה: ניתן לטפל בתאים מראש עם הטיפולים הרצויים לפני השראתי כדי להעריך את השפעתם על יציבות mRNA (איור 5).
<ol><li>להכין מניות דוקסיציקלין פתרון של 1 מ"ג/mL במים מוכי. אחסן את פתרון המניה ב-20 ° c מוגן מפני אור. דוקסיציקלין, הנגזרת טטרציקלין, משמש במקום טטרציקלין כי יש לו יותר מחצית חיים (2x) מאשר טטרציקלין. יתרהמזאת,יש צורך בריכוז נמוך יותר של דוקסיציקלין לצורך הפעלה מלאה של המבצע ט' . הערה: דוקסיציקלין יכול להשפיע על ביטוי mRNA של האנדודוגני. כדי לוודא זאת, יש לבדוק את השפעת הטיפול באמצעות דוקסיציקלין על תאים מכתשיים כדי לאשר את היעדר השינויים בביטוי הגוי (איור 2).</li>
	<li>הכינו פתרון חדש מבית 1 μg/mL בשנת ה72 המלאה של הקרן וחמם אותו ל 37 ° c.</li>
	<li>החלף את המדיום עם 1 מ ל של זיכרון מלא המכיל 1 מיקרומטר μg/mL כדי לעכב את התמלול של הגוי.</li>
	<li>דגירה מספר בארות ב 37 ° c ב 5% CO2 עבור כמויות שונות של זמן מ 15 דקות-6 h כדי להעריך את mrna מחצית החיים של הגוי.</li>
	<li>בסוף הטיפול, לשטוף את התאים עם הקרח קר PBS ו lyse אותם עם ערכת החילוץ כלורופורם מסחרית פנול-הכלורופורם-RNA על ידי הוספת 500 μL של מאגר לכל טוב וטלטול את הצלחת כדי המגון את התאים.</li>
	<li>בודד את ה-RNA לפי פרוטוקול היצרן. לקבוע את התשואה RNA וטוהר על ידי ספקטרופוטומטר ב 230, 260, ו 280 nm. דגימות RNA עם 260:230 ו 260:280 יחסי של 1.8 ו 2.0, בהתאמה, נחשבים טהורים. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
</ol>4. קביעת יציבות mRNA של הגוי
<ol><li>לטפל 1 μg של RNA כולל עם RNAse-חינם DNAse I (כיתה הגברה) כדי להסיר כל סימן של DNA פלמיד שיכול להפריע הגברה הבאים DNA.<ol>
<li>בצינור 0.2 mL PCR, לשלב 1 μg של הכולל RNA, 1 μL של 10x DNase מאגר התגובה, 1 μL של DNAse I (1 U/μL), ו RNAse-מים ללא תשלום כדי להשיג נפח כולל של 10 μL.</li>
		<li>מודקון את התגובה ב RT עבור 20 דקות.</li>
		<li>ביטול הפקודה DNAse אני על ידי הוספת 1 μL של 25 mM EDTA ל 10 μL התגובה ערבוב ו דגירה את התגובה ב 70 ° c עבור 10 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>הפוך-תעתור את ה-RNA הכולל של DNA לתוך cDNA באמצעות מסחרית זמינה cDNA ערכת סינתזה עם תערובת של oligo (dT) ו התחל הספר אקראי כדי לשפר את הפוך את היעילות תמלול.<ol>
<li>בקצרה, להוסיף 4 μL של מיקס התגובה 5x, 1 μL של היפוך הטרנססקריפט, ו 4 μL של RNAse-מים ללא תשלום 11 μL של ה-DNA הכולל לערבב RNA כדי להשיג נפח התגובה הכולל של 20 μL. לערבב את התגובה היטב על ידי ליטוף אותו למעלה ולמטה</li>
		<li>מודסת את התגובה עבור 5 דקות ב 25 ° c, ואחריו 20 דקות ב 46 ° c, ולאחר מכן להשבית את התגובה על ידי דגירה אותו ב 95 ° c עבור 1 דקות. כל תגובה תניב 50 ng/μL של מוצר cDNA.</li>
		<li>לדלל את התגובה cDNA לריכוז של 5 ng/μL על ידי הוספת 180 μL של מים ביולוגיים מולקולריים ברמה 20 μL התגובה ערבוב. אחסן את מוצרי cDNA ב-80 ° צ' או להמשיך מיד לבצע PCR כמותי בזמן אמת (qPCR). הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
	</ol></li>
	<li>העיצוב הקדמי והפוך qPCR ספציפיים לגוי.<ol>
<li>בשל הביטוי האנדוגני של הגוי בתאים, התחל צריך להיות מתוכנן כדי להגביר את 100-150 bp האמפר של האפיפי של V5 בשילוב עם הגוי (שולחן 1).</li>
		<li>יש להשתמש בצבעי יסוד גנים בעלי התייחסות פנימית גם כפקדי נורמליזציה. בדרך כלל, גנים משק הבית, כגון בטא actin ו-היפוקסאתה פוספוליבואז 1 גנים, משמשים התייחסות גנים. עם זאת, לא ניתן להשתמש באלה עם מערכת אינדוקציה זו עקב וריאציה של יעילות הזיהום. במקום זאת, הביטוי של התעתיק tTA-Ad מוערך לצורך נורמליזציה, משום שהביטוי שלו הוא קונסטיטוטיבי בתאים עקב הפעילות של מקדם cytomegalovirus ירוס. כל שינוי בביטוי שנמדד על ידי qPCR יהיה נציג היעילות של התרגום (התחל: קדימה 5 '-מנות TGA CGA הסוכנות GGA AAC TC 3 ' והפוך 5 '-AGT GGG תאת גת המאלף TGA CC-3; 129 bp amplicon) ויאפשר נורמליזציה של הביטוי של שיבוטים מנוכר (איור 3).</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו כל תגובת qPCR ב טרילקאט באמצעות מיקס מאסטר בצבע ירוק SYBR.<ol>
<li>לדלל את 5 ng/μL cDNA מיקס לריכוז של 1.25 ng/μL באמצעות מים ביולוגיים מולקולריים ברמה.</li>
		<li>לשלב 5 μL של שילוב מאסטר בצבע ירוק SYBR (2x), 0.1 μL של מים מולקולריים בביולוגיה מולקולרית, 0.45 μL של 7.5 μM הקדמי, 0.45 μL של 7.5 הפוכה לאחור, ו 4 μL של 1.25 ng/μL cDNA כדי לקבל נפח התגובה הכולל של 10 μL. Mix היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה ב 96 הצלחת היטב PCR. השתמש בסרט דבק אופטי כדי לוודא שמכסה הלוחית חתום וכלה במניעת זיהום והתאיידות.</li>
		<li>לסובב את מיקס התגובה בקצרה על ידי צנטריפוגה ולמקם את הצלחת ב-qPCR תרמוטרטרנר.</li>
	</ol></li>
	<li>הגבר את ה-V5-מתויג הגברה ו-tTA-Ad באמצעות התנאים הבאים של qPCR: 95 ° c במשך 10 דקות כצעד דנטורציה, ואחריו 40 מחזורים של 95 ° צ' עבור 10 s, 58 ° c עבור 15 s, ו 72 ° c עבור 20 s. עקומת ההיתוך ברזולוציה גבוהה חייב להיווצר לאחר מחזורי הגברה מבוצעים כדי להעריך את טמפרטורת ההיתוך הספציפית של הגברה הרצוי כדי להבטיח את העדר של רעש אמפליקון פסגות.<ol>
<li>כלול שולטת שלילית עבור רביעיית ה-PCR על-ידי ביצוע qPCR עם RNA כתבנית ללא היפוך הטרנסקריפטאז לשמש כפקד על זיהום דנ א פוטנציאלי הפלסטיק ו-qPCR ללא cDNA הוסיף לערבב qPCR כדי להבטיח את העדר בולטות או זהמים.</li>
		<li>הריכוז האופטימלי cDNA, פריימר יעילות, וריכוז חייב להיות ממוטב על פי הגוי על ידי שיטת עיקול סטנדרטי. לשם כך, בצע דילול סדרתי באמצעות cDNA מתאים לא מטופל (תרבותי ללא דוקסיציקלין). העקומה הסטנדרטית נוצרת על-ידי התוויית ערכי Cq כנגד היומן של גורם הדילול Cq, ויעילות ההגברה (E) מחושבת בהתאם לשיפוע של העקומה הסטנדרטית באמצעות הנוסחה הבאה: E = 10-1/שיפוע הערה: יעילות הגברה צריכה להיות כ 0.9 עד 1.05. אחרת, יש לעיצוב מחדש של התחל.</li>
	</ol></li>
	<li>נתח את נתוני ה-qPCR באמצעות שיטת Cq השוואתית על-ידי נרמול ערכי הביטויים של הגוי לביטוי של tTA-Ad כדי להשיג את רמות הביטוי היחסיות של הגוי ולדווח על ביטויו כאחוז מהביטוי mRNA של הגוי בתאים מאותה חיה בנקודת ההתחלה (t = 0) (איור 4).</li>
	<li>מחצית החיים נקבע מתוך קבוע הקצב (K) של עקומת השפלה של הגוי mRNA באמצעות המשוואה הבאה: t1/2 = בתוך 2/K.</li>
</ol>

<ol><li>Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+profiling+of+mRNA+turnover+reveals+gene-specific+and+system-wide+regulation+of+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).</li>
<li>Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The transcription stress response.</a> Cell Cycle. 6 (18), 2252-2257 (2007).</li>
<li>Ross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">mRNA stability in mammalian cells.</a> Microbiological Reviews. 59 (3), 423-450 (1995).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).</li>
<li>Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+response+element+can+mediate+induction+of+c-fos+by+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).</li>
<li>Harkin, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+GADD45+and+JNK%2FSAPK-dependent+apoptosis+following+inducible+expression+of+BRCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1.</a> Cell. 97 (5), 575-586 (1999).</li>
<li>Formisano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+isoforms+of+the+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger%2C+NCX1+and+NCX3%2C+constitute+novel+additional+targets+for+the+prosurvival+action+of+Akt%2Fprotein+kinase+B+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway.</a> Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).</li>
<li>Yin, D. X., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL-2+expression+delays+drug-induced+apoptosis+but+does+not+increase+clonogenic+survival+after+drug+treatment+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells.</a> Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).</li>
<li>Johnstone, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+leukemia+protein+ELL%3A+evidence+for+a+role+in+the+regulation+of+cell+growth+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).</li>
<li>Olotu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+inhibits+purinergic+signaling+and+promotes+purinergic+receptor+P2Y2+internalization+in+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).</li>
<li>Goldmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alveolar+epithelial+cells+type+II+are+capable+of+TGFbeta-dependent+epithelial-mesenchymal-transition+and+collagen-synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 138(2018).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ghrelin+ameliorates+the+human+alveolar+epithelial+A549+cell+apoptosis+induced+by+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emodin+suppresses+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+alveolar+epithelial+cells+through+Notch+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).</li>
<li>Cooper, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Culture+of+the+A549+Cancer+Cell+Line+Promotes+Multilamellar+Body+Formation+and+Differentiation+towards+an+Alveolar+Type+II+Pneumocyte+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype.</a> PLoS One. 11 (10), e0164438(2016).</li>
<li>Hirakata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culture+systems+with+respiratory+epithelial+cells+for+evaluation+of+bacterial+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Tohoku+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness.</a> Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+functions+of+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regulatory functions of 3'UTRs.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 288 (2), 291-295 (2001).</li>
<li>Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lengthening+of+3%27UTR+increases+with+morphological+complexity+in+animal+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution.</a> Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).</li>
<li>Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+epithelial+sodium+channels+to+alveolar+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease.</a> Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).</li>
<li>Boncoeur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+epithelial+sodium+channel+activity+by+lipopolysaccharide+in+alveolar+type+II+cells%3A+involvement+of+purinergic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+alveolar+epithelial+Type+I+and+Type+II+cells+from+rat+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).</li>
<li>Kozak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+least+six+nucleotides+preceding+the+AUG+initiator+codon+enhance+translation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells.</a> Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).</li>
<li>Ke, S. H., Madison, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-directed+mutagenesis+by+single-tube+%27megaprimer%27+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.</a> Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGossen%2C+M+%22Tetracyclines+in+Biology%2C+Chemistry+and+Medicine%22">Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine</a>. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).</li>
<li>Migneault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-Transcriptional+Modulation+of+aENaC+mRNA+in+Alveolar+Epithelial+Cells%3A+Involvement+of+its+3%27+Untranslated+Region%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).</li>
<li>Migneault, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Modulation+de+la+stabilit%C3%A9+de+l%27ARNm+alphaENaC+dans+les+cellules+%C3%A9pith%C3%A9liales+alv%C3%A9olaires%3A+d%C3%A9termination+du+r%C3%B4le+des+s%C3%A9quences+3%27+non+traduites%22">Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites</a>. , Université de Montréal. (2015).</li>
<li>Grzesik, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+to+primary+alveolar+epithelial+cells+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).</li>
<li>Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+doxycycline-induced+cytotoxicity+on+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells.</a> Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).</li>
<li>Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+impairs+neutrophil+migration+to+the+airspaces+of+the+lung+in+mice+exposed+to+intratracheal+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation-London%22%5BJournal%5D)">Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide.</a> Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31(2012).</li>
<li>Hovel, H., Frieling, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+doxycycline%2C+mezlocillin+and+clotrimazole+in+cell+culture+media+as+contamination+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Biological+Standardization%22%5BJournal%5D)">The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis.</a> Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).</li>
<li>Houseley, J., Tollervey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+pathways+of+RNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The many pathways of RNA degradation.</a> Cell. 136 (4), 763-776 (2009).</li>
<li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+determination+of+RNA+stability+reveals+hundreds+of+short-lived+noncoding+transcripts+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals.</a> Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

שיעור הגידול הנמוך של מכתשי תאים אפיתל בתרבות העיקרית כבר מגבלה רצינית לשימוש מערכת ט-Off כדי להעריך את יציבות mRNA בתאים אלה. עם זאת, מגבלה זו היתה להתגבר על ידי הפיפטה אלקטרופורציה, המאפשר 25-30% יעילות הזיהום (איור 1 ואיור 3)26.
המדידה של התעתיק היא בסיסית להבנת האפנון של mRNA נתון והשפעתה על הומאוסטזיס וחילוף החומרים של התאים. וריאציה בביוזמינותה של הגוי עשויה לשנות את יעילות התרגום ויש להם השפעה ישירה על ה...

מספר טכניקות פותחו כדי לקבוע את מחצית החיים של mRNAs. טכניקת ריקבון הדופק מרדף, אשר משתמשת mRNAs, מאפשר הערכה סימולטני של בריכה גדולה של mRNAs עם הפרעה תאית מינימלית. עם זאת, גישה זו אינה מאפשרת הערכה ישירה של מחצית החיים של תעתיק גן יחיד ולא ניתן ליישם כדי ללמוד את אפנון הפוסטסקריפט של מערכת הגירוי הבאה של mRNA עם גורמי גדילה, ROS, מדאיג, או דלקת1.
השימוש במעכבי תעתיק, כגון אקטינומיצין D ו-α-אמטין, היא שיטה פשוטה יחסית למדידת קינטיקה של השפלה mRNA לאורך זמן. אחד היתרונות העיקריים של גישה זו על זה של טכניקות קודמות, (כלומר, דופק-מרדף) מסתמך על היכולת להעריך במישרין את מחצית החיים של תעתיק נתון ולהשוות איך טיפולים שונים יכול להשפיע על הקינטיקה השפלה שלה. עם זאת, ההשפעה המשמעותית משמעותית של מעכבי התעתיק על הפיזיולוגיה של התא מייצגת חיסרון משמעותי של הגישה2. אכן, עיכוב של התא כולו ההמרה עם תרופות אלה יש תופעת לוואי שלילית של perturbing את הסינתזה של אלמנטים מרכזיים המעורבים ביציבות mRNA, כגון microRNAs (miRNAs), כמו גם את הביטוי וסינתזה של חלבונים כריכת RNA, אשר חשובים עבור השפלה ויציבות mRNA. ההפרעות החמורות של תמלול הגנים על-ידי תרופות אלו עלולות לשנות את עקומות ההשפלה של התעתיקים.
מערכת אינדוקציה היזם מייצג גישה שלישית כדי למדוד את מחצית החיים של mRNA ספציפי. שיטה זו מודדת את ההשפלה של mRNA ספציפי באופן דומה לשיטות המשתמשות במעכבי תעתיק. שני סוגים של מערכות אינדוקציה משמשים לעתים קרובות: סרום המושרה c-fos אמרגן3 ואת מערכת inducible Off4. עם מערכת c-fos, השימוש מעכבי שעתוק כי יכול להיות רעיל לתא אין צורך. עם זאת, שיטה זו מחייבת סנכרון של מחזור התא, המונע את הערכת היציבות בפועל של תעתיק במהלך השלב הפנימי5. לעומת זאת, מערכת ט-Off מאפשרת ביטוי חזק של גן העניין (הארה) תחת השליטה של מקדם מוסדר טטרציקלין מוסדרים. מערכת זו מחייבת נוכחות של שני רכיבים שחייבים להיות מזוהמים בתא כדי להיות פונקציונלי. באמצע הפלסטיק הראשון (pTet-Off) מבטא את החלבון הרגולטורי tTA-עו"ד, מקדם שעתוק סינתטי היברידית מורכב של prokaryotic מדיכוי TetR (מ Es, האננכיה coli) התמזגו שלושה תחומים ההפעלה הפעלה של חלבון ויראלי HSV VP16. הגוי משוכפל לתוך pTRE-צר באמצע תחת שליטה של מיזם סינתטי (Pהדוק), הכולל את הרצף המינימלי של cytomegalovirus (cmv) יזם התמזגו שבעה חוזר של רצף המפעיל teto. תמלול של הגן במורד של Pהדוק תלוי באינטראקציה של tetr עם tetr. בנוכחותו של טטרציקלין או הנגזרת שלה, דוקסיציקלין, מאבדת מחדש את הזיקה שלה למפעיל Tetr, המוביל להפסקת שעתוק4. המאפיינים של מערכת ט-Off להפוך אותו למודל אידיאלי למחקר של ביטוי mrna ספציפי בתאי איקריוטית תוך הימנעות השפעות pleiotropic פוטנציאלי משני העדר רצפים prokaryotic הרגולציה בתא איקריוטית6. בדרך כלל, שורות התאים היציבים כפליים (hek 293, הלה וPC12) משמשות עם מערכת זו כדי לשלב עותקים של הרגולטור והתגובה של פלמידים עבור גישה נוחה לביטוי גנטי בשליטה7,8,9.
מספר דגמים של תאים אפיתל מכתשיים בתרבות שימשו כדי ללמוד את הביולוגיה התאית והמולקולרית של האפיתל מכתיום. במשך שנים, החוקרים מנוצל באופן נרחב בתאים אנושיים או מכרסמים הראשי10,11 , כמו גם קווים מונצח תאים כגון A549 אנושי או עכברוש rle-6tn תאים12,13. למרות שהם בדרך כלל פחות מתרבים וקשה יותר לתרבות לבין transfect, מכתשיים תאי האפיתל בתרבות הראשית להישאר בתקן הזהב למחקר של תפקוד ותפקוד של האפיתל מכתשי בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. אכן, שורות תא מונדמות כגון תאים A549 לא מציגים את המאפיינים המורכבים ופנוטיפים של תאים ראשוניים, ואילו מכתשיים תאי אפיתל בתרבות העיקרית לאחר מכן את המאפיינים העיקריים של האפיתל מכתשי, במיוחד את היכולת ליצור מחסום מקוטב והדוק14,15. למרבה הצער, תאים אלה עמידים מאוד טכניקות החצייה המקובלת, כגון אלה ניצול ליפוזומים, מה שהופך את השימוש של היזם המושרה מערכת כגון ט-Off מאוד קשה.
אפנון הפוסטסקריפט של mRNAs היא אחת השיטות האפקטיביות ביותר למודוללי במהירות את ביטוי הגנים של תעתיק16. אזור ה-mRNA 3 ' בלתי מתורגם ' (3 ' UTR) ממלא תפקיד חשוב במנגנון זה. זה הוכח כי, בניגוד ל 5 ' UTR, יש קורלציה אקספוננציאלית בין אורך של 3 ' UTR ואת המורכבות הסלולר ו מורפולוגית של אורגניזם. מתאם זה מרמז כי 3 ' UTR, כמו אזורי קידוד mRNA, כבר נתון בחירה טבעית כדי לאפשר אפנון מורכב יותר ויותר של הפוסטסקריפט במהלך האבולוציה17. 3 ' UTR מכיל מספר אתרים מחייבים עבור חלבונים ו miRNAs המשפיעים על היציבות והתרגום של התעתיק.
בעבודה הנוכחית, פיתחנו כלי כדי לחקור את התפקיד של תחומים שמרו במידה רבה ב-3 ' UTR של הגוי על שליטה של התעתיק. התמקדנו בערוץ נתרן האפיתל, יחידת יחידת (αENaC), אשר ממלאת תפקיד מפתח בבית מכתשי הפיזיולוגיה האפיתל18. מכתשיים תאים אפיתל בתרבות הראשית היו בהצלחה משני הצדדים עם שני המרכיבים של מערכת ט-Off, אשר מאפשר ללמוד את התפקיד של 3 ' UTR ביציבות mRNA עם מערכת כי המינימלי משפיע הפיזיולוגיה של התא ואת חילוף החומרים בהשוואה לשימוש של מעכבי שעתוק עם פרוטוקולים אחרים. אסטרטגיית שיבוט פותחה כדי להבדיל את הביטוי של הגוי מתוך הגן האנדוסוגגני באמצעות אפירופה בלתי מפותח (V5). התגובה והפלמידים של התקנות הועברו לאחר מכן לתוך מכתשיים תאי האפיתל באמצעות טכניקת פיפורציה חשמלית. לאחר מכן, הביטוי של התעתיק נמדד על-ידי דגירה של התאים עם דוקסיציקלין במרווחי זמן שונים. מחצית החיים של התמליל הוערך על-ידי RT-qPCR עם שיטת Cq ששונתה באמצעות מוצר העברה של טה-אד mRNA לנורמליזציה. באמצעות הפרוטוקול שלנו, אנו מציעים דרך נוחה ללימוד האפנון הפוסט-ממדי של תעתיק בתנאים שונים והגדרת המעורבות של האזורים הבלתי מתורגמים ביתר פירוט.

<table><tbody><tr><td>אקטינומיצין D</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>קו בהירהמציטומטר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם - כיתה ביולוגיה מולקולרית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>ClaI</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>ציקלוהקסמיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DM IL LED מיקרוסקופ הפוך עם ניגודיות פאזה</td><td></td> Leica-DNase <td></td><td></td></tr><tr><td>I, דרגת הגברה</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין היקלאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (D-PBS), ללא סידן ומגנזיום</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>אתנול - בדרגת ביולוגיה מולקולרית</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td><td>Eppendorf</td><td>1220G76</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7.3</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026420</td><td></td></tr><tr><td>ערכת סינתזת cDNA iScript</td><td>מעבדות Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול - ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>מרק סיגמא-אולדריץ'</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>LB (לנוקס)</td><td>מרק סיגמא-אולדריץ'</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>LB עם אגר (לנוקס)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכרידים מ- Pseudomonas aeruginosa10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9143</td><td></td></tr><tr><td>MEM, אבקה</td><td>Gibco</td><td>61100103</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו אמפר אופטי 96 באר צלחת תגובה</td><td>מיושמת ביוסיסטמות N8010560</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרואמפ סרט דבק אופטי</td><td>יישומי ביוסיסטמים 4360954</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארונות בטיחות ביולוגיים MSC-Advantage Class II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51025413</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה Mupid-exU</td><td>Takara Bio</td><td>AD140</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>מערכת העברת ניאון 10 ומיקרו; L Kit</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>ניאון Transfection System Starter Pack</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>One Shot OmniMAX 2 T1RCמוכשר מבחינה כימיתE. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C854003</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 וקטור</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>PlatinumTaqDNA פולימראז נאמנות גבוהה</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off וקטור מתקדם</td><td>Takara Bio</td><td>631070</td><td></td></tr><tr><td>pTRE וקטור הדוק</td><td>Takara Bio</td><td>631059</td><td></td></tr><tr><td>תאי אפיתל מכתשית מטוהרים</td> n.a.n.a.QIAEX <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>II ערכת מיצוי ג'ל</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN פלסמיד מקסי ערכת</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep ספין Miniprep ערכת</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 ו-7 Flex בזמן אמת תוכנת מערכת PCR</td><td>יישומית ביו-מערכות יישומיות</td><td>n.a.QuantStudio</td><td></td></tr> <tr><td>6 Flex מערכת PCR בזמן אמת, 96 בארות</td><td>יישומי יישומי ביו-סיסטמס</td> מהיר <td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>חולדה רקומביננטית TNF-אלפא חלבון</td><td>R& המגבר; D Systems</td><td>510-RT-010</td><td></td></tr><tr><td>Septra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2487</td><td></td></tr><tr><td>שרימפס אלקליין פוספטאז (rSAP)</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced אוניברסלי SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tet System מאושר FBS</td><td>Takara Bio</td><td>631367</td><td></td></tr><tr><td>Tobramycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>מים, ביולוגיה מולקולרית בדרגת</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-EL</td><td></td></tr></tbody></table>

יעיל טראנסקריפט מבוקרת פלמיד ביטוי מערכת לחקירת היציבות של התעתיקים mrna בתוך הראשי מכתשי אפיתל תאים

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

לימוד הרגולציה הפוסט-טראומטית הוא יסוד להבנת האפנון של שליח מסוים RNA (mRNA) והשפעתה על הומאוסטזיס התאים וחילוף החומרים. ואכן, תנודות הביטוי בתעתיק יכולות לשנות את יעילות התרגום ולבסוף את הפעילות התאית של תעתיק. כמה גישות ניסיוני פותחו כדי לחקור את מחצית החיים של mRNA למרות חלק מהשיטות הללו יש מגבלות המונעות את המחקר הנכון של אפנון הפוסטסקריפט. מערכת השראה היזם יכול לבטא גן של עניין תחת השליטה של מיזם סינתטי מוסדר טטרציקלין. שיטה זו מאפשרת שערוך מחצית חיים של mRNA נתון תחת כל מצב ניסיוני ללא מטריד הומאוסטזיס התא. חיסרון משמעותי אחד של שיטה זו הוא הצורך בתאי העברה, אשר מגביל את השימוש בטכניקה זו בתאים ראשוניים מבודדים העמידים מאוד בפני טכניקות העברה קונבנציונליות. מכתשיים תאים אפיתל בתרבות הראשית שימשו בהרחבה כדי ללמוד את הביולוגיה התאית והמולקולרית של האפיתל מכתיום. המאפיינים הייחודיים והפנוטיפים של תאי הכתשיים הראשוניים הופכים אותו לחיוני לחקר מודולרופהפוסט של גנים המעניינים בתאים אלה. לכן, המטרה שלנו הייתה לפתח כלי הרומן כדי לחקור את מודולונות הפוסט של mRNAs של עניין בתאי האפיתל מכתשיים בתרבות הראשית. עיצבנו פרוטוקול מהיר ויעיל של הזיהום החולף כדי להכניס מערכת הבעה מבוקרת בשיטת פלססקריפט לתאי האפיתל הראשוניים. אסטרטגיית שיבוט זו, המשתמשת באפירופה ויראלית כדי לתייג את המבנה, מאפשרת את האפליה הקלה של בניית הביטוי מתוך זה של mRNAs האנדוגניים. באמצעות מחזור ΔΔ שונה (Cq) שיטה, ביטוי התמליל יכול להיות כימות במרווחי זמן שונים כדי למדוד את מחצית החיים שלו. הנתונים שלנו להפגין את היעילות של הגישה הרומן הזה בחקר הרגולציה הפוסט בתנאים שונים פתופסולוגית בתאי האפיתל הראשי מכתשיים.

פרוטוקול זה נעשה שימוש בהצלחה כדי ליצור מערכת הבעה מבוקרת מבחינה מבצעית באמצעות פלסטלינה כדי להעריך את החשיבות של חלקים שונים של αENaC 3 ' UTR באפנון של יציבות תעתיק בתאי האפיתל הראשי מכתשיים.
הצעד הראשון ביישום של מערכת זו היה ליצור טכניקת העברה מהירה, קלה ויעילה עבור מכתשיים תאי אפיתל בתרבות הראשית, שקשה לשנות את המצב. כפי שמוצג באיור 1, טכניקת הפיפטה אלקטרופורציה המותרת לקצב התייעלות של 25-30%, כ...

כאן, אנו מציגים כלי שניתן להשתמש בו כדי ללמוד את אפנון posttranscript של תעתיק בתאי אפיתל הראשי מכתשיים באמצעות מערכת ביטוי inducible בשילוב טכניקה אלקטרופורציה פיפטה.

יעיל טראנסקריפט מבוקרת פלמיד ביטוי מערכת לחקירת היציבות של התעתיקים mRNA בתוך הראשי מכתשי אפיתל תאים

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

אז המודל שלנו מאפשר מחקר של אפנון שלאחר שעתוק של תעתיק מסוים בתאי אפיתל מכתשי בתרבות הראשונית ואת התנאים הפיזיולוגיים והפתופיזיולוגיים שלהם. אז ההידור חולף של תאי אפיתל מכתשי ראשי יש השפעה מינימלית על פיזיולוגיה של התא ומטבוליזם, אשר מהווה יתרון ברור על פני פרוטוקולים קלאסיים באמצעות מעכבי שעתוק. עבור הדור של פלסמיד תגובה המבטא גן של עניין, רצף של הגן, ואתרי שיבוט מרובים של וקטור בלתי ניתן לעיכול יש לנתח כדי לזהות את רצפי הזיהוי באתרי שיבוט מרובים כי אינם נוכחים באופן פנימי בגן.באמצעות פולימראז taq נאמנות גבוהה וטכניקות PCR חפיפה סטנדרטיות, לאגף את הגן של עניין עם שני אתרי זיהוי אנזים הגבלה נבחרים באמצעות פריימרים מעצב. רצף בקידוד אפיטופ ה- V5 במעלה הזרם של גן העניין חייב להיכלל כדי להבחין בין הביטוי של הגן המומר לבין ביטוי אנדוגני. מוטנטים יכולים להיווצר על ידי מחיקה רציפה כדי לחקור את ההשפעות של שלושה אזורים שונים שאינם תרגום על היציבות של mRNA של הגן באמצעות פריימרים הפוכים קידוד אתר polyadenylation כי בהדרגה מוחק את הקצה העיקרי של האזור לא מתורגם.בסופו של דבר, הכנסת הגן של עניין יכול להיות מאושר על ידי ניתוח הגבלה. האוריינטציה הגנטית והיעדר מוטציות שעלולות להיות מוצגות במהלך rtPCR ניתן לאשר על ידי רצף. עבור transfection של סוג ריאה עכברוש ראשי שני תאי אפיתל מכתשית, לזרוע את התאים ב 1 פעמים 10 לתאים השישי לס"מ מרובע ב 100 מילימטר צלחות פטרי בנוכחות מדיום חיוני מינימלי מלא.תרבות במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני עם לחות. למחרת, להוסיף 500 microliters של מדיום שלם ללא אנטיביוטיקה לכל באר של צלחת חדשה 12 גם לחמם מראש את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה הזו, הוסיפו מיקרוגרם אחד של פלסמיד התגובה ומיקרוגרם אחד של וקטור רגולטורי לצינור אחד של 1.5 מיליליטר ל באר.לשטוף את תאי האפיתל מכתב עם 10 מיליליטר ל הבאר של 37 מעלות צלזיוס PBS ללא סידן או מגנזיום ולטפל בתאים עם חמישה מיליליטר ל הבאר של 37 מעלות צלזיוס 0.05% טריפסין במשך שתיים עד ארבע דקות באינקובטור תרבות התא. כאשר התאים התנתקו, לנטרל את טריפסין עם 10 מיליליטר לתוך באר של מדיום שלם ללא אנטיביוטיקה ולאסוף את התאים לתוך צינור חדש 50 מיליליטר. לשטוף את המנה עם ארבעה מיליליטר של מדיום טרי כדי לאסוף את כל התאים הנותרים ולשסות את התאים על ידי צנטריפוגה.תן שוב את גלולת במיליליטר אחד של PBS לספירה וצנטריפוגה של התאים שוב. תוסיפו את גלולת הכדור בצפיפות של ארבע כפול 10 לתאים השביעיים למיליליטר של מאגר ההתמשלות מחדש ותוסיפו ארבע כפול 10 לתאים החמישיים לכל צינור של פלסמיד וקטור עם ערבוב עדין. מניחים צינור אחד בהתקן האלקטרופוזיה וממלאים את הצינור ב-3.5 מיליליטר של חיץ אלקטרוליטי.יש לדכא לחלוטין את הבוכנה כדי להכניס קצה אלקטרודה מצופה זהב לתוך פיפטה ולערבב בעדינות את תכולת הצינור. בזהירות שאפו את התאים עם פיפטה והכניסו את הפיפט לתחנת האלקטרופולציה עד שנשמע צליל נקישה. בחר את פרוטוקול האלקטרופורציה המתאים עבור תאי אפיתל מכתב ולחץ על התחל במסך המגע.מיד לאחר transfection, להסיר את פיפטה ולהעביר את התאים לתוך באר אחת של צלחת 12 היטב מחומם מראש. כאשר כל התאים כבר electroporated וציפה, מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא, החלפת supernatant בכל באר עם מדיום שלם עם אנטיביוטיקה לאחר יומיים. ההצלחה של transfection יכול להיות מאושר על ידי הביטוי של EGFP כפי שנצפה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי או ציטומטריה זרימה באמצעות וקטור בקרה.כדי לעכב את שעתוק של הגן של עניין, 72 שעות לאחר transfection להחליף את supernatant עם מיליליטר אחד לכל באר של מדיום שלם בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של adoxycycline מוכן טרי. כדי להעריך את זמן מחצית החיים mRNA של הגן של עניין, להחזיר את הצלחת אינקובטור תרבות התא מ 15 דקות עד שש שעות. שטיפת באר אחת עם מיליליטר אחד של קרח קר PBS לפני lysing התאים עם 500 microliters של חיץ תזה מערכת מיצוי RNA פנול כלורופורם זמין מסחרית ורעידות עדינות בכל נקודת זמן ניסיונית.לאחר מכן, לבודד את RNA על פי הוראות קיט ולקבוע את התשואה RNA וטוהר על ידי ספקטרופוטומטריה ב 230, 260, ו 280 ננומטר. כדי לקבוע את היציבות של RNA מבודד, ראשית לטפל מיקרוגרם אחד של RNA הכולל מכל מדגם עם RNase חינם DNase אחד כדי להסיר את כל עקבות DNA פלסמיד. השתמש בערכת סינתזת cDNA זמינה מסחרית עם תערובת של אוליגו dT פריימרים משושה אקראי כדי לשפר את יעילות שעתוק הפוך כדי להפוך לתמלל את ה- RNA הכולל מדולדל DNA לתוך cDNA על פי הוראות היצרן.הוסף 180 microliters של ביולוגיה מולקולרית כיתה מים 20 microliters של תערובת התגובה לדלל את תגובת cDNA בריכוז של חמישה ננוגרם למיקרוליטר מיד לדלל את תערובת cDNA עם ביולוגיה מולקולרית מולקולרית טרייה כיתה מים כדי להגיע 1.25 ננוגרם לריכוז microliter. שלב חמישה מיקרוליטרים של תערובת מאסטר צבע ירוק סייבר עם 0.1 מיקרוליטר של מים כיתה ביולוגיה מולקולרית, 0.45 microliters של פריימר 7.5 מיקרומולרי קדימה, 0.45 microliters של 7.5 מיקרומולרים הפוך פריימר, וארבעה microliters של 1.25 ננוגרם למיקרוליטר של cDNA כדי לקבל תגובה כוללת של 10 מיקרוליטרים. מקם את הדגימות בתרמוציקלר qPCR והעצים את גן תג ה- V5 של עניין ו- tetrocycline transactivator מראש אמפליקונים באמצעות תנאי qPCR כפי שצוין וליצור עקומת התכה ברזולוציה גבוהה כדי להעריך את טמפרטורות ההיתוך הספציפיות של האמפליקונים הרצויים ולהבטיח היעדר פסגות אמפליקון רעש.טכניקת אלקטרופוזיה זו מאפשרת קצב יעילות של 25 עד 30%transfection כפי שנצפה על ידי היחסים של תאי EGFP שזוהו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה. הטיפול בתאי אפיתל מכתב עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של דוקסיציקלין אין השפעה משמעותית על הביטוי של אלפא ENaC mRNA אנדוגני בכל נקודת זמן במהלך תקופת הטיפול. באמצעות מערכת ביטוי פלסמיד מבוקרת שעתוק כפי שהודגם, אות V5 אלפא ENaC יכול להיות מנורמל על פי הטרציקלין transactivator אות מתקדם כדי לקבוע את היעילות של transfection באמצעות שיטת מחזור כימות דלתא כפולה.זמן מחצית החיים של אלפא ENaC mRNA הוא עד שבע פעמים קצר יותר בנוכחות טטרציקלין מחוץ למערכת מאשר בנוכחות actinomycin D, המאשר כי actinomycin D מוביל לייצוב mRNA אלפא ENaC חפץ. כמו כן, cyclohexamide וגידול נמק גורם אלפא טיפול ירד באופן משמעותי את היציבות של התמליל בעוד lipopolysaccharides לא. שינויים משמעותיים באפנן של יציבות MRNA אלפא ENaC V5 יכול להיות המושרה בהתאם לאזורים שנמחקו וכללו של שלושת האזורים לא תרגום הממשלה.בנוסף, ביטוי יתר של חלבונים קשירה RNA ספציפי מקטין את היציבות של 5-אלפא ENaC mRNA לעומת transfection עם pcDNA ריק שלוש פלסמיד. כלי זה יהיה שימושי עבור שאילתת תובנות חדשניות לתוך הרגולציה שלאחר שעתוק של גנים מרכזיים המעורבים לתוך הפונקציה של אפיתל מכתשי ואת התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים שלהם.

efficient-transcriptionally-controlled-plasmid-expression-system-for

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

RNA פולימראז II קינטיקה תעתיק נמדדים על גנים ספציפיים בתאים חיים. mRNAs עיבד מן הגן של עניין מתויגים fluorescently באמצעות שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) ב קינטיקה vivo של התארכות תעתיק מתקבלים.

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

סרטון זה מתאר את השיטה של ויסות ביטוי גנים בתאים בתרבית על ידי טרנספקציה עם פלסמיד המכיל גן מעניין ופלסמיד רגולטורי. הביטוי של פלסמיד זה יכול להיות נשלט על ידי טטרציקלין או אנלוגים סינתטיים שלה, מה שהופך את המערכת הזאת מודל שימושי ללמוד ביטוי גנים מוסדר.

Inducible Tet-Off Regulatable System: שיטה במבחנה לווסת ביטוי גנים בתאים בתרבית באמצעות מערכת טטרציקלין-אוף

עכברים מהונדסים או וקטורים נגיפיים היו בשימוש כדי להגדיל את ביטוי חלבון בתוך הריאה. עם זאת, הטכניקות האלה הן זמן רב, מאתגרים מבחינה טכנית ויש השפעות מחוץ היעד שיכול לבלבל את התוצאות. פרוטוקול transfection שלנו משתמש בחלבון מגיב transfection מבוסס שומנים וmicrosprayer ultrafine כדי לספק חלבון פעיל באופן אחיד לתאי ריאה.

Transfection החלבון של ריאות מאוס

כאן אנו מתארים בדיקת גן מדווח מבוססת תאים ככלי רב ערך לסינון ספריות כימיות עבור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה פוסט-שעתוק המופעלים באמצעות 3' UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

קשה להמיר תאי אפיתל ראשוניים של הסימפונות האנושיים. פרוטוקול זה מתאר את ייצור הלנטי-וירוסים וריכוזם, כמו גם את תנאי התרבית האופטימליים הדרושים להשגת טרנסדוקציות יעילות ביותר בתאים אלה לאורך התמיינות לאפיתל פסאודוסטטי.

אופטימלית Lentivirus ייצור תרבית תאי תנאים הכרחיים בהצלחת transduce האדם הראשי תאי אפיתל סימפונות

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

מקרופאגים, במיוחד מקרופאגים ראשוניים, מאתגרים transfect כפי שהם מתמחים בזיהוי מולקולות של מוצא לא עצמי. אנו מתארים פרוטוקול המאפשר העברה יעילה מאוד של מקרופאגים הראשי עם mRNA שנוצר מתבניות DNA כגון פלמידים.

העברה יעילה במיוחד של מקרופאגים ראשוניים עם מחוץ לגופית

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

מוצגת כאן שיטה ניתנת לשחזור, משתלמת וחזקה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל סימפונות ראשוניים עבור ביו-בנקאות לטווח ארוך ויצירת תאי אפיתל ממוינים על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל.

בידוד תאי אפיתל של הסימפונות מרקמת ריאה שנכרתה לצורך ביו-בנקאות והקמת תרביות ממשק אוויר-נוזל ממוינות היטב

פרוטוקול זה מציג שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לבידוד תאי אפיתל אלוואולריים מסוג II (AECII) חיוניים מריאות עכבריות יילודים, צעירות או בוגרות (נגועים או לא נגועים). גישה זו מאפשרת מחקרים מולקולריים ו/או פונקציונליים במורד התהליך של AECII לזהות את תפקידם במהלך דלקת וזיהום בריאותיים.

בידוד תאי אפיתל אלוואולריים מסוג II מריאות עכבריות יילודים, צעירים ובוגרים המתאימים לסביבות ניסוי זיהומי

חקור מודולציה פוסט-תרנקריפטומית של תעתיקים בתאי אפיתל ריאתיים ראשוניים באמצעות מערכת ביטוי מבוקרת וטכניקת אלקטרופורציה בפיפטה. שיטה זו מאפשרת שיבוש מינימלי בפיזיולוגיה התאית ומסייעת בחקר יציבות mRNA ורגולציה גנית בריאות.

יעיל טראנסקריפט מבוקרת פלמיד ביטוי מערכת לחקירת היציבות של התעתיקים mRNA בתוך הראשי מכתשי אפיתל תאים

גלה סרטונים נוספים