Name: ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: חקור ייצור חלקיקים מוקלדים מדבקים בטיטר גבוה באמצעות גליקופרוטאינים מנגיפי שפעת H5N1 ו-H7N9. שיטה זו מאפשרת הערכת מידת ההדבקה בבטיחות במעבדת BSL-2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של הרפואה המחוזית ג'ה-ג'יאנג ומדעי הבריאות תוכנית טכנולוגיה (גרנט מספרים, 2017ky538), האנגג רפואה עירונית ומדעי הבריאות תוכנית טכנולוגיה (גרנט מספרים, OO20190070), האנגג מדע רפואי ו מפתח טכנולוגיה פרויקט (גרנט מספרים, 2014Z11) ו האנגג העירוני היישומים האוטונומית פרויקט של התפתחות חברתית מחקר מדעי (גרנט מספרים, 20191203B134).

1. יום 1: תרבית תאים וזריעת
<ol><li>לטפח כליה עובריים האדם (HEK) 293T/17 תאים ב 60 מ"מ מנות עם בינוני חיוני של דולבקה שונה (DMEM) שיושלם עם 10% סרום שור עוברי (FBS) ו 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין (DMEM בינוני מלא, DMEM) ב 37 ° c, 5% פחמן דו חמצני (CO2) 80 חממה הערה: מומלץ להתאים 293T/17 תאים מעבר נמוך.</li>
	<li>בזהירות לשטוף את התאים עם 5 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS) 1x. הערה: טיפול ידני של התאים HEK 293T/17 חייב להיות עדין מאוד, כי הם בקלות להתנתק.</li>
	<li>הסר את ה-PBS והנתק את התאים עם 1 מ ל של 0.25% טריפסין-אתילן diamine חומצה (EDTA) תמיסה. מניחים את המנה ב 37 ° c, 5% בחממה2 עבור לא יותר 5 דקות עד התאים הם הנתק.</li>
	<li>הנטרל טריפסין על ידי הוספת 5 מ ל של DCM. לפזר את התאים לתוך השעיה תא יחיד על ידי מלטף למעלה ולמטה מספר פעמים.</li>
	<li>העבר את השעיות התא לשפופרת צנטריפוגה מקוררת של 15 מ ל. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 250 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>. מאוד שאפשר השהה מחדש את הגלולה עם 6 מ ל של מדיום DCM וספור את התאים. דלל את התאים ל-1 x 106 תאים/mL עם מדיום dcm.</li>
	<li>הזרע את התאים לתוך 6 צלחת הבאר עם 1 מ ל של השעיה התא לכל טוב. לטף בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התאים באופן שווה. מודקת את הצלחת לילה (14-16 h) ב 37 ° c, 5% החממה2 .</li>
</ol>2. יום 2: ארבע-פלגימיד מתווך על ידי ליפומטר
<ol><li>בדוק את המבנה התאי והצפיפות. תחת מיקרוסקופ אור הפוך באופן אידיאלי, התאים צריכים להיות כ 85% שוטפת על הזיהום. החלף את המדיום עם 1 mL של מדיום DMEM free-סרום לכל היותר, ולאחר מכן החזר את הצלחת לתוך החממה. הערה: טיפול ידני של התאים HEK 293T/17 חייב להיות עדין מאוד, כי הם בקלות להתנתק.</li>
	<li>עבור כל טוב של תאים מתורבתים להיות מזוהמים, לדלל 8 μL של החצייה מגיב לנפח של 150 μL עם בינוני סרום מופחת (צינור 1). מערבבים בעדינות ו-מודרות למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT, כ-20 ° c). הערה: עבור כל דגימת העברה, הכן שני צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ממוספרים 1 ו-2.</li>
	<li>בצינור 2, לדלל 2.5 μg של ה-DNA פלמיד לתוך 150 μL של מדיום סרום מופחת. הערה: בתוך צינור 2, לדלל את כל ה-DNA פלאמצע כפי שמוצג בטבלה 1. וירוס בקידוד vesicular stomatitis (VSV) G גליקופרוטאין (פלמיד pLP-VSV) שימש כפקד חיובי, כי VSV מסוגל להדביק מגוון רחב של תאים. חלקיקי שליטה שליליים שחסרים מעטפת שפעת גליקורופדים (Δenv pps) נוצרו באמצעות pcDNA-מחסום-המשך ו-pcDNA-GFP.</li>
	<li>לאחר הדגירה 5 דקות, לשלב את ה-DNA מדולל עם הזיהום מדולל מגיב. מערבבים בעדינות ו-דגירה עבור 15 דקות נוספות ב-RT.</li>
	<li>הוסף את הקומפלקס DNA-ליפיד כדי המתאים היטב המכיל את התאים ומדיום ללא סרום. מערבבים בעדינות על ידי נדנוד הצלחת הלוך ושוב.</li>
	<li>לאחר הדגירה של 4 – 6 h ב 37 ° צ', 5% CO2 חממה, להסיר את המדיום, ולהחליף עם 2 מ ל dmem. מודטה עבור עוד 36 – 48 h ב 37 ° c, 5% שיתוף חממה2 . הערה: החלפה עם DMEM ללא סרום ונטול נוגדנים. בפרוטוקול זה, ניתן להשתמש בשתיים ובשתי NAs כדי להפיק שמונה סוגים של pps (המוצגת בטבלה 1).</li>
</ol>3. יום 3: שזורעי תאים רגישים
<ol><li>עבור שיטת הנגועים, זרע כל סוג של תאים רגישים ב 1 x 104 תאים לכל טוב בצלחת 96 היטב. הערה: השתמש בשני סוגים של תא יעד כדי לבצע את הטיפול הנגוע במאמר זה: קו תא אנושי מכתשיים-נגזר (A549 תאים) והתאים דין-דארבי כליות (MDCK). התאים MDCK נמצאים בשימוש נרחב במחקר שפעת יכול להיות שליטה טובה. שלב זה גמיש. כל שורות תא יעד אחרות יכולות לשמש בהתאם לדרישות המחקר.</li>
	<li>מודקת את הצלחת לילה (14-16 h) ב 37 ° c, 5% החממה2 .</li>
</ol>4. יום 4: בדיקת חלקיקים מסוג ויראלי, ושיטת הקוונפיקציה והנגועים
<ol><li>מוקלדת אוסף חלקיקים נגיפי<ol>
<li>בדוק את צבע המדיום. באופן אידיאלי, זה צריך להיות בהיר ורוד או מעט כתום. בדוק את התאים עם מיקרוסקופ הפוך ביולוגי פלורסנט תחת 440 – 460 ננומטר.</li>
		<li>ב 36 – 48 העברת הדואר, הקציר pps על ידי passaging באמצעות 0.45 יקרומטר polyvinylidene פלואוריד (pvdf) מסנן הקרום כדי לחסל את הריסות התאים.</li>
		<li>חלק את ה-pps לתוך. כמויות קטנות של נפח</li>
		<li>אחסן את ה-pps ב-80 ° c. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. עם זאת, זה לא מומלץ, כי הנגועים של pps יהיה ירידה חדה לאחר הקפאה והפשרה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כימות חלקיקים ויראליים<ol>
<li>העברה 20 μl של מטוהרים pps 1.5 mL ריבונוקלאז (rnase)-שפופרת מיקרוצנטריפוגה חינם.</li>
		<li>הוסף 1 μL של 0.24 U/mL בנזיל. מודטה ב 37 ° צ' עבור 1 h כדי למנוע זיהום דנ א ו-RNA. הערה: היעד RNA, בדרך כלל cytomegalovirus ירוס (CMV)-RNA GFP, ארוזה ב-pps והוא יכול להימנע מלהיות מושפל על ידי בנזיל nuclease.</li>
		<li>להקפיא את המדגם ב-70 ° צ' כדי לבטל את הפעלת בנזיל nuclease.</li>
		<li>הוסף 2 μL של פרוטאינאז K. מארג ב 50 ° c עבור 30 דקות כדי לעכל את חלבונים המעטפה ולשחרר את ה-CMV-GFP RNA. להשבית את הפרוטאינאז K ב 100 ° c עבור 3 דקות.</li>
		<li>לכמת את ה-pps על-ידי היפוך כמותי בזמן אמת (רביעיית)-PCR עם בדיקה אוניברסלית אחת-צעד RT-qPCR Kit, באמצעות פריימר קדימה 5 '-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3 ', פריימר הפוכה 5 '-GGGTCTCCTQGACA-3 ', ואת הגשוש 5 '-משפחה-שכונות-טאם-3 ', בזמן אמת, בשנת PCR. לנרמל את pps עבור מספר עותק RNA לפני הנגועים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שיטת הנגועים<ol>
<li>דלל כל סוג של pps במונחים של הנתונים של רביעיית ה-PCR ל-4 x 105 עותקים/mL (עמ' נורמליזציה).</li>
		<li>הוסף את טוסיל-פנילאלנין-קטון (TPCK)-טריפסין לריכוז הסופי של 40 μg/mL לתוך pps כי הנמל H7N9 HA. דגירה ב 37 ° צ' עבור 1 h כדי ליצור חלבוניות הפונקציונלי שלה HA1 ו HA2. הערה: אין צורך לטפל ב-pps שH5 עם TPCK-טריפסין, כי יש להם מספר ארגיצין ושאריות ליזין באתר המחשוף HA1-HA2. זה אתר מרובה בסיסי מחשוף יכול להיות ביקע על ידי פרוטסים סלולריים בכל מקום.</li>
		<li>ערבב pps מנורמלת עם מדיום DMA (ללא סרום) ביחס 1:1 (אמצעי אחסון/אמצעי אחסון).</li>
		<li>הביאו את הצלחת המכילה תאים רגישים לארון בטיחות.</li>
		<li>ושטוף את התאים פעם אחת עם 0.1 מ ל של PBS.</li>
		<li>הוסף 0.1 mL של התערובת pps-DMEM לבאר אחת. שלישיה במבחנים הנגועים של כל סוג של pps אל קו תא אחד פגיע (מוצג מראש באיור 2).</li>
		<li>מודטה את 96 צלחת הבאר עבור 4 – 6 h ב 37 ° צ', 5% שיתוף2 חממה.</li>
		<li>מנושף את הסופרנטנט ומחליפים ב-0.1 mL של DCM.</li>
		<li>מודטה את 96 צלחת הבאר עבור אחר 24 – 36 h ב 37 ° c, 5% שיתוף אינקובטור2 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. יום 5 או 6: איתור הנגועים
<ol><li>הביאי את צלחת ה96. לארון הביוטיחות</li>
	<li>ולשטוף את התאים 1x עם 0.2 mL של מקדם שחומם.</li>
	<li>הסר את PBS והנתק את התאים עם 0.1 mL של 0.25% טריפסין-EDTA פתרון.</li>
	<li>מניחים את המנה ב 37 ° c, 5% בחממה2 עבור 3 דקות עד התאים מנוכה. הערה: הימנע מהדגירה של יותר מ-5 דקות, מכיוון שפעולה זו תוביל להפייפת תאים.</li>
	<li>הנטרל טריפסין על ידי הוספת 0.4 mL של DCM.</li>
	<li>לפזר את התאים להשעיה תא יחיד על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים.</li>
	<li>העבר את השעיות התא לצינור מקורר מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.</li>
	<li>לקבוע את הכתב GFP-תאים חיוביים עם מיון תא מופעל פלואורסצנטית (FACS). הערה: כדי לקבוע את היחס של הכתב GFP-תאים היעד חיובי, להגדיר את השערים cytometer הגדר באמצעות דגימות בקרה (מטופל A549 תאים או בתאי MDCK), ולאחר מכן לספור את הכתב GFP-תאים חיוביים של 10,000 תאים לכל מדגם.</li>
</ol>

<ol><li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+Virology+%286th%29%22">Fields Virology (6th)</a>. , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).</li>
<li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins%3A+multiple+variations+on+a+common+theme%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li>
<li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501(2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629(2014).</li>
<li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+envelope+glycoproteins%3A+fusogens%2C+antigens%2C+and+immunogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li>
<li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li>
<li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li>
<li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li>
<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li>
<li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li>
<li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li>
<li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+%28H7N9%29+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioterrorism+%26+Biodefense%22%5BJournal%5D)">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104(2011).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825(2010).</li>
<li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles%3A+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li>
<li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li>
<li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li>
<li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70(2006).</li>
<li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+%28H5%29+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li>
<li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li>
<li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li>
<li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li>
<li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+%28SARS-CoV%29+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+%28VLPs%29+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li>
<li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254(2016).</li>
<li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010(2019).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses%3A+a+system+for+analysis+of+cell+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li>
<li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses%3A+identification+of+receptor-deficient+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li>
<li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li>
<li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies%3A+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li>
<li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819(2019).</li>
<li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+production%3A+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt%28R%29-T17%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לייצר חלקיקים מוקלדים וירוס שפעת (pp) בהגדרה BSL-2. הכתב פלבאמצע pcDNA-GFP משולבים pps והוא יכול לשמש לכמת pps על ידי FACS בתוך שיטת הנגועים. בחרנו שני סוגים של קווי תאים רגישים כי הם נמצאים בשימוש נרחב במחקר שפעת. התאים MDCK יספק שליטה טובה על המשתנה התאים האנושיים המשמשים במחקרים אלה.
פרוטוקול זה מבוסס על הרטרווירוס MLV, אשר יכול לכלול כתבת GFP ולייצר ניצנים על קרום התאית. טכניקה זו פותחה באופן נרחב לאריזת חלקיקי וירוס שפעת4,<s...

המשימה של חלקיק נגיפי היא להעביר את הגנום שלה מתא מארח נגוע לתא מארח לא נגוע, כדי להעביר אותו לתוך הציטופלסמה או הגרעין בצורה המוסמכת לשכפול1. תהליך זה מופעל בתחילה על ידי קשירה של קולטני תאים מארחים, ולאחריו פיוז'ן של וריריון וקרומים סלולריים. עבור וירוסים עטופים, כמו וירוסי שפעת, גליקורופורינים ספייק הם אחראים על כריכת קולטן ופיוז'ן1,2. מעטפה נגיפית גליקורופנס (למשל, פירוגנס, אנטיגנים), מעורבים בתכונות ואירועים חשובים רבים, כגון מחזור חיים של וירוס (איגוד והיתוך), פתוגנזה ויראלי, חיסוני, מארח תאים אפופטוזיס ו הסלולר tropism, מסלול endocytic הסלולר, כמו גם הילוכים הבינמינים והקצאה1,3,4,5,6,7. מחקר על מעטפה נגיפית גליקורופנס יסייע לנו להבין היבטים רבים של תהליך הזיהום הנגיפי. חלקיקים ויראליות מסוג פסבדו (pp), הנקראת גם פסבדו-מאמרים או פסבדו-מוצרים, ניתן ליצור דרך טכניקת הקלדה מדומה8,9,10. טכנולוגיה זו שימש לפיתוח חלקיקים מוקלדים של וירוסים רבים, כולל צהבת C11,12, צהבת B13, vesicular stomatitis וירוס (vsv)14,15, וירוס שפעת16,17,18,19. טכנולוגיה זו מבוססת על חלבון מחסום-פול של וירוסים או הרטרוירוסים אחרים.
חלקיקי חלקיקים מוקלדים ניתן להשיג באמצעות מערכת שלוש-פלמיד על ידי הפרדת מעטפה נגיפית גליקופרוטאין ביטוי פלבאריבאמצע, אריזה retroviral יעיל החסר המעטפה עטפה גן, ו כתבת נפרדת בתוך pp מפיק תאים. הרטרו וירוס מורכב על ידי חלבון מחסום שלו, והוא ניצנים מקרום התא נגוע המבטא את מעטפת וירוס חלבון1. לכן, אפשר להשיג שפעת סיכוייו גבוה pps באמצעות וירוס מחסום חלבון לייצר ניצנים על קרום הסלולר המבטא שפעת HA ו-NA. במחקרים הקודמים שלנו, יש/NAs בכל השילובים היו פונקציונליים מסוגל לבצע את הפונקציות המתאימות שלהם במחזור החיים הנגיפי16,17,18,20,21. Pps אלה משמשים כדי לחקור מאפיינים ביולוגיים שפעת, כולל hemagglutination פעילות עצבית, מחייב הקולטן הפאיזם, והנגועים. בגלל HA ו-NA הם שניהם משטח חשוב חלבונים פונקציונליים במחזור החיים הנגיפי, לא תואם יש NAs נגזר זנים שונים של שפעת יכול בחלקו להפגין הקצאה מחדש ביניהם. כאן, אנו מייצרים שמונה סוגים של pps שפעת על ידי שילוב 2 יש ושתי NAs (נגזר המתח HPAI H5N1 ואת הכתם H7N9), באמצעות מערכת שלושה פלמיד הקלדה מדומה. אלה שמונה סוגים של pps כוללים שני pps מקורית, H5N1pp, H7N9pp; שני pps לא תואמים, (H5 + N9) pp, (H7 + N1) עמ'; ו 4 pps רק מחסה גליקופרוטאין יחיד (HA או NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. מחקרים על וירוס שפעת, כגון H5N1 ו H7N9, מוגבלים על ידי דרישות אבטחה טיחות. כל המחקרים של זנים וירוס שפעת הבר צריך להתבצע ברמה אבטחה טיחות 3 (bsl-3) המעבדה. ניתן להשתמש בטכנולוגיית חלקיקים מסוג ויראלי לאריזת וירוס מלאכותי בקביעת רמת בטיחות 2 (BSL-2). לכן, pps מייצגים כלי בטוח ושימושי כדי ללמוד את תהליכי וירוס שפעת בהתאם לשני הגליקורופנים העיקריים שלה: hemagגלוטין (HA) ו נוירואמינידדאז (NA).
פרוטוקול זה מתאר את הדור של ה-pps האלה עם אסטרטגיית שלוש-פלאמטר (מוצג מראש באיור 1), כיצד לכמת pps וזיהוי הנגועים. הייצור pp כולל שלושה סוגים של פלמידים (איור 1). הגן מחסום-פול , אשר מקודד את החלבון מחסום וירוס-פול, שוכפל מערכת אריזה רטרווירוס והוכנס לתוך pcdna 3.1 פלאמיד ונקרא pcdna-מחסום-פול. חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP) גן, אשר מקודד חלבון פלורסנט ירוק, שוכפל מ pTRE-EGFP וקטור, הוכנס לתוך pcDNA 3.1 פלאמיד, וקרא pcDNA-GFP. במהלך השכפול, התווסף אות אריזה (ענבל) באמצעות צבע. הגנים HA ו-NA שוכללו לתוך פלאמבאמצע pVRC, בשם pVRC-HA ו pVRC-NA, בהתאמה. הפלסטיות האחרון מקודד את חלבון ההיתוך והוא יכול להיות מוחלף עם חלבון פיוז'ן אחר של ריבית. פלטפורמת ההקלדה המדומה שלנו כוללת שני ביטויים גליקופרוטאין: pVRC-HA ו-pVRC-NA. זה יכול לפשט את המחקר על הסדר מחדש בין זנים וירוסים שונים בהגדרה BSL-2.

<table><tbody><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Millipore</td><td>70664</td><td>הפחתת צמיגות יעילה והסרה של חומצות גרעין מתמיסות חלבון</td></tr><tr><td>Microplates Clear Flat Bottom Polystyrene TC (96-well)</td> <td>Corning</td><td>3599</td><td>מטופל לחיבור תאים אופטימלי מעוקר על ידי קרינת גמא ומאושר nonpyrogenic קודים אלפאנומריים בודדים לזיהוי באר</td></tr><tr><td>צלחות באר מרובות שקופות שטופלו ב-TC (6 בארות)</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>קודים אלפאנומריים בודדים לזיהוי בארות מטופל לחיבור תאים אופטימלי מעוקר על ידי הקרנת גמא</td></tr><tr><td>המדיום החיוני השונה של Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>מדיום בסיסי בשימוש נרחב לתמיכה בצמיחה של תאי יונקים רבים ושונים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Excell</td><td>FND500</td><td>נסיוב בקר עוברי שיכול להציע ערך מצוין לתרבית תאים בסיסית, מחקר מיוחד ובדיקות ספציפיות</td></tr><tr><td>מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS)</td><td>בקמן קולטר</td><td>ציטופלקס</td><td></td></tr><tr><td>אדנוקרצינומה מכתשית אנושית A549 תאי</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>כליה עוברית אנושית (HEK) HEK-293T/17 תאים</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>מגיב טרנספקציה רב-תכליתי שהוכח כמעביר ביעילות את המגוון הרחב ביותר של קווי תאים דבקים ומתלים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ביולוגי פלואורסצנטי הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>BX51-32P01-FLB3</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>CKX31-12PHP</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000 מגיב טרנספקציה</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>זיהוי qPCR מהיר, רגיש ומדויק מבוסס בדיקה וכימות של מטרות RNA מטרה.</td></tr><tr><td>ערכת בדיקה אוניברסלית של Luna חד-שלבי RT-qPCR</td><td>NEB</td><td>E3006L</td><td>תעמוד בעד 14,000 RCF RNase-/DNase ללא</td></tr><tr><td>תאי כליה כלבים לא פירוגניים של Madin-Darby (MDCK)</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MaxyClear Snaplock צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>33 מ"מ,</td></tr><tr><td>יחידת מסנן מזרק Millex-HV מעוקרת גמא, 0.45 ומיקרו; m, PVDF</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>מדיום חיוני מינימלי משופר (MEM) המאפשר הפחתה של תוספי סרום בקר עוברי ב-50% לפחות ללא שינוי בקצב צמיחת התאים או במורפולוגיה. מדיום Opti-MEM I מומלץ גם לשימוש עם ריאגנטים להעברת שומנים קטיוניים, כגון ריאגנט ליפופקטמין.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת</td><td>בינוני Gibco</td><td>11058021</td><td>האנטיביוטיקה פניצילין וסטרפטומיצין משמשות למניעת זיהום חיידקי של תרביות תאים בשל פעולתן המשולבת היעילה נגד חיידקים גרם חיוביים וגרם שליליים.</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>RCF מקסימלי הוא 12,500 xg טווח טמפרטורות מ-80 ו-deg; C עד 120 ו-deg; C RNase-/DNase-free </td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה PP סטריליים (15 מ"ל)</td><td>קורנינג</td><td>430791</td><td>פרוטאז סרין יציב ותגובתי מאוד</td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>Beyotime</td><td>ST532</td><td>מטופל לחיבור תאים אופטימלי מעוקר על ידי קרינת גמא וצלחת תרבית מוסמכת שאינה פירוגנית</td></tr><tr><td>שטופלה ב-TC (60 מ"מ)</td><td>קורנינג</td><td>430166</td><td>טריפסין מלבלב בקר TPCK מטופל, למעשה נטול מלח, אבקה ליופילית, &ge; 10,000 יחידות BAEE/מ"ג חלבון</td></tr><tr><td>TPCK-טריפסין</td><td>סיגמא</td><td>T1426</td><td>נוסחה נוזלית זו של טריפסין מכילה EDTA ופנול אדום. Gibco Trypsin-EDTA מיוצר מאבקת טריפסין, תערובת מוקרנת של פרוטאזות שמקורן בלבלב חזיר. בשל חוזק העיכול שלו, טריפסין נמצא בשימוש נרחב לדיסוציאציה של תאים, מעבר שגרתי של תרביות תאים ודיסוציאציה ראשונית של רקמות. ריכוז הטריפסין הנדרש לדיסוציאציה משתנה בהתאם לסוג התא ולדרישות הניסוי.</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מh5n1 פתוגניים מאוד h7n9 וירוסים העופות

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

השידור הישיר מדי פעם של שפעת העופות פתוגניים מאוד וירוס H5N1 (HPAI H5N1) ו H7N9 לבני אדם הקשה שלהם הם בעיות חמורות בריאות הציבור ולהציע את האפשרות של מגיפה. עם זאת, ההבנה המולקולרית שלנו של הנגיף היא בסיסית, ויש צורך ללמוד את המאפיינים הביולוגיים של חלבונים המעטפה שלה כמטרות טיפוליות ולפתח אסטרטגיות כדי לשלוט בזיהום. פיתחנו חלקיק ויראלי מוצק שהוקלדו חלקיקים (pp) פלטפורמת ללמוד וירוס שפעת העופות, כולל ניתוח פונקציונלי של hemagglutinin (HA) ו-נוירואמינידאז (NA) מעטפות מאפיינים, המאפיינים של ובתאום מראש של ונאס, קולטנים, הטרופיאמים, נטרול נוגדנים, אבחון, הנגועים, למטרות פיתוח התרופה ועיצוב החיסון. כאן, אנו מתארים הליך ניסיוני כדי ליצור pps עם מעטפה גליקורופטנס (HA, NA) משתי שפעת זנים (HAPI H5N1 ו 2013 H7N9 העופות). הדור שלהם מבוסס על היכולת של וירוסים מסוימים, כגון וירוס לוקמיה murine (MLV), לשלב גליקורופנים מעטפה לתוך pp. בנוסף, אנו גם פירוט כיצד pps אלה הם כימות עם RT-qPCR, ואת זיהוי הנגועים של pps וירוס לא תואם בהתאם למקור של יש ו-NAs. מערכת זו היא גמישה מאוד וישימה וניתן להשתמש בה כדי ליצור pps ויראלי עם גליקורופנים מעטפות שניתן לשלב בכל סוג אחר של וירוס עטוף. כך, פלטפורמת חלקיקים ויראלית זו ניתן להשתמש כדי ללמוד וירוסים פראי בחקירות מחקר רבות.

בהתאם לנוהל הכללי המתואר לעיל, יצרנו 10 סוגים של pps שילוב של שתי קבוצות יש/NAs או VSV-G גליקופרוטאין או ללא מעטפה גליקורופנס (המוצג בטבלה 1). . שבעה מהם מדבקים ה-pps כי הנמל לא מעטפה גליקופרוטאין או רק הנמל NA לא הראה את הנגועים כאן. הליך הפקת שפעת עמ' מוצג באיור 1. מיקרוגרפים אלקטרונים של העברת pps (למשל, H5N1pp) מוצגים באיור 3. התוצאות של הנגועים שאומרות על pps אלה מוצגות באיור 4. הנגועים של שבעת הסוגים של pps הו...

פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסיוני כדי לייצר מעטפת מדבקת ויראלי מידבקת (עמ') עם גליקורופנים מעטפות משתי שפעת זנים וכיצד לקבוע את הנגועים. פרוטוקול זה מאוד להתאמה כדי לפתח pps של כל סוג אחר של וירוסים עטוף עם מעטפה שונה גליקורופנס.

ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

טכניקה זו של ייצור PP ויראלי שפעת וקביעת זיהומיות שלה יכול לפשט את המחקר של וירוס שפעת בעיר BSL-2. נרמלנו את PPS עבור זיהומים המבוססים על נתוני qRT-PCR של PPS. שני פלסמיד ביטוי גליקופרוטאין מקודדים, אשר יכול לפשט את המחקר על שיוך וירוס.יום אחד לאחר זריעת התא, בדוק את מורפולוגיה התא וצפיפות תחת מיקרוסקופ אור הפוך. באופן אידיאלי התא צריך להיות כ 85%confluent ב transfection. החלף את המדיום עם מיליליטר אחד של DMEM ללא סרום לגם, והחזר את הצלחת לאנקובטור.כדי שכל באר של תאים תחולף, לדלל שמונה microliters של reagent transfection לנפח של 150 microliters עם מדיום סרום מופחת. מערבבים את הפתרון בעדינות ולתת לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. בינתיים, לדלל 2.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לתוך 158 microliters של מדיום סרום מופחת.לאחר הדגירה של חמש דקות, מערבבים את הדנ"א המדולל עם רגנט טרנספיקציה מדולל, מערבבים בעדינות את הפתרון ומשאירים אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מוסיפים את קומפלקס השומנים DNA ל בארות המתאימות עם התאים במדיום ללא סרום. ואז מערבבים את הצלחת בעדינות על ידי נדנדה קדימה ואחורה.דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע עד שש שעות. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום ולהחליף אותו עם שני מיליליטר של DMEM לגם. ואז לה הדגירה אותו לעוד 36 עד 48 שעות.זרע כל סוג של תא רגיש ב 10, 000 תאים ל הבאר וצלחת 96 גם. ואז להשאיר את הצלחת במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים חממת פחמן דו חמצני. ביום השלישי לאחר transfection, לבדוק את הצבע של המדיום אשר צריך להאיר ורוד או כתום מעט ולבחון את התאים עם מיקרוסקופ ביולוגי פלורסנט הפוך תחת 440 כדי 460 אורך גל ננומטר.ב 38 עד 48 שעות לאחר transfection, לקצור את החלקיקים פסאודוטריד או PPS על ידי עובר אותם דרך 0.45 מיקרומטר פוליווינילידין פלואוריד מסנן פלואוריד כדי לחסל פסולת התא, ולאחר מכן לחלק אותם אליקים נפח קטן ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לכמת את PPS, להעביר 30 microliters של חלקיקים נגיפיים מטוהרים לצינור 1.5 microliter RNase חינם ולהוסיף מיקרוליטר אחד של נקלאז Benzonase. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לחסל כל זיהום DNA ו- RNA.לאחר הדגירה, להקפיא את המדגם למינוס 70 מעלות צלזיוס כדי פעיל את הגרעין ולהוסיף שני microliters של Proteinase K.Incubate את התערובת במשך 30 דקות כדי לעכל את חלבוני המעטפה ולשחרר את CMV-GFP RNA. ואז לא פעיל פרוטאינאז K ב 100 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לכמת את PPS עם תמלול הפוך כמותי RTPCR באמצעות בדיקה אוניברסלית צעד אחד RT-qPCR קיט פריימרים ובדיקות שצוין בכתב היד טקסט.לנרמל את PPS לארבע פעמים 10 עד עותקי RNA החמישי למיליליטר. לאחר מכן להוסיף TPCK-טריפסין לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר לתוך PPS כי הנמלים H7N9 hemagglutinin. הדגירה PPS ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי ליצור את תת היחידות הפונקציונליות HA1 ו HA2.מערבבים את PPS מנורמל עם מדיום DMEM ביחס אחד לאחד, ואז להביא את הצלחת המכילה תאים רגישים לארון biosafety. שאפו את העל-טבעי ושטפו את התאים פעם אחת עם 100 מיקרוליטרים של PBS מחומם מראש. הוסף 100 מיקרוליטרים של תערובת PPS-DMEM לתוך כל באר, שידל את בדיקות ההינקות של כל סוג של PPS לקו תא רגיש אחד.דגירה הצלחת במשך ארבע עד שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן שאפו את העל-טבעי והחליפו אותו ב-100 מיקרוליטרים של DCM, הדגירה את הצלחת למשך 24 עד 36 שעות נוספות לפני זיהוי הזיהום. התוצאות שלנו הן PPS נחשבים עכשיו זיהומיות לאנשים.אז נהלי שמירה הכרחיים מומלץ לקחת כגון לבישת מסכה וביצוע בדיקות דביקות ב ארון biosafety. פרוטוקול זה יוצר כדי ליצור 10 סוגים של חלקיקים מדומה או PPS עם שני המגלוטין מקובצים ונוירמינידאז וירוס stomatitis כלי דם G גליקופרוטאין או לא מעטפת גליקופרוטאינים. PPS דימוי עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ואת ההדביקות שלהם הוערכו בשני קווי תאים, A549 ו MDCK.בקבוצת PPS המכילה H5, ההידביקות של H5N1, H5 plus N9 ו- H5 הייתה כ- 90%18% ו- 10% עבור קו התא A549 ו- 40%5% ו- 5% עבור MDCK, בהתאמה. בקבוצת PPS המכילה H7, ההידביקות של H7N9, H7 plus N1 ו- H7 הייתה כ- 10%7% ו- 1%עבור קו התא A549 ו- 8%4%ו- 1%עבור MDCK, בהתאמה. ההדלקה של וירוס stomatitis כלי דם G גליקופרוטאין PP היה כ 21% עבור A549 ו 16% עבור תאי MDCK.בעוד מעטפת הדלתא גליקופרוטאינים PP לא הראה שום להדביק. זה קריטי לזכור כי יצרנית PP HEK-293T/17 תאים מהווים את הבסיס של הליך זה. אז הצמיחה האופטימלית מלמדת אותנו שתאי HEK-293T/17 הם החשובים ביותר.בעקבות הליך זה או בדיקה אחרת כגון L2 פתוח הבדיקה התוחמת ניתן לבצע. ההתדגם הזה כמעט יכול לפטור את המוזרויות הביולוגיות של העדפת הקולטן והתבנית תחשוף את הטרופוליזם של PPS. מאז שהם לקחו את הגליקופרוטאינים מנגיף שפעת משובטים לשניים פלוס מקסימום.HA וחלבוני NA ניתן ללמוד בנפרד ולכן אנו reassortment ביניהם. ניתן לחקור את המוטנטים ואת ההשפעות הבוגרות.

production-high-titer-infectious-influenza-pseudotyped-particles-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את היווצרותם של חלקיקים דמויי נגיף שפעת (VLPs) במערכת יונקים. לאחר שהם מבטאים שלושה וקטורי ביטוי אאוקריוטים – המקודדים חלבונים מבניים נגיפיים שונים – בתאים מארחים מתאימים של יונקים, החלבונים הנגיפיים המבוטאים מתאספים בעצמם ל-VLPs על קרום הפלזמה המארח ומשחררים באמצעות ניצנים מפני השטח של התא.

טכניקה ליצירת חלקיקים דמויי נגיף שפעת באמצעות מערכת יונקים

הסרטון מציג שיטה ליצירת נגיפי שפעת רקומביננטיים מותאמים לקור. היא כרוכה בהדבקת תאים אנושיים בפלסמידים דו-כיווניים, ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה נמוכה יותר כדי להניב נגיפים המתאימים לייצור חיסונים, המאופיינים בשכפול מופחת בתנאים חמים יותר.

יצירת נגיפי שפעת חיים מוחלשים רקומביננטיים לחיסונים

כאן אנו מתארים את דרך להביע את פני השטח אנטיגנים וירוס שפעת בצורה נכונה מקופלים ופונקציונליים הנגזרים מנגיף H7N9 הרומן הסיני בתאי חרקים. הטכניקה יכולה להיות מותאמת להביע ectodomains של כל משטח חלבונים נגיפיים או סלולריים.

ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

יש חוסר ידע כללי על אופן פעולת החיסונים. כאן אנו מציעים שימוש משולב בגנטיקה הפוכה ועכברים כימריים של מח עצם כדי לקבל תובנה לגבי התגובות החיסוניות המוקדמות של המארח לחיסונים עם דגש מיוחד על תאים דנדריטיים וחסינות תאי T.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינתזה חלקיקים דמויי וירוס באמצעות baculovirus או או מערכות ביטוי יונקים, וטיהור ultracentrifugation. גישה להתאמה אישית זה משמשת לזיהוי אנטיגנים נגיפיים כמטרות חיסון בצורה בטוחה וגמישה.

ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון

אנו מתארים שיטה שבאמצעותה אנו מזהים שאריות קריטי הנדרש עבור האיגוד של נוגדנים חד-שבטיים אנושית או מאתר שמכוונות את hemagglutinin נגיפי שפעת A וירוסים. הפרוטוקול ניתן להתאים glycoproteins משטח אחר וירוס, נוגדנים נטרול המתאימים שלהם.

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר חלקיקים pseudotyped באווירה BSL-2 שילוב החלבון ספייק של וירוסים פתוגני במזרח התיכון תסמונת נשימתית, מעוררת סארס. החלקיקים pseudotyped מכילים גנים כתב לוציפראז המאפשר כימות של וירוס הערך לתוך התאים מארח היעד.

הפקה של חלקיקים Pseudotyped ללמוד מעוררת פתוגני באווירה אבטחה ברמה 2

כאן אנו מתארים פרוטוקול לאריזת פסאודו-וירוס ולמדידת פעילות נטרול נוגדנים.

הכנת נגיפי שפעת העופות H5 מסוג פסאודו עם שיטת העברת סידן פוספט ומדידת פעילות נטרול נוגדנים

הפרוטוקול מתאר גישה תפוקה גבוהה לקביעת מבנים של חלבונים בממברנה באמצעות אלקטרונים cryo-3D טומוגרפיה ועיבוד תמונה. זה מכסה את הפרטים של הכנת הדגימה, איסוף נתונים, עיבוד נתונים לפרשנות, מסכם עם ייצור של היעד מייצג את הגישה, HIV-1 גליקופרוטאין מעטפה. נהלים אלה חישובית מעוצבים באופן המאפשר לחוקרים וסטודנטים כדי לעבוד מרחוק לתרום עיבוד וניתוח של נתונים מבניים.

קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ו ממוצעים אוטומטי תת tomogram

שיטה לשמר, לזהות רצף הרנ"א מפני וירוסים שפעת העופות היה תוקף המורחבת באמצעות דגימות צואה טבעיים ציפורים. טכניקה זו מסירה את הצורך של שמירה על שרשרת מגניב וטיפול וירוסים זיהומיות ניתן ליישם תוכנית ההתקנה של תפוקה גבוהה 96-היטב.

מעקבים שפעת העופות FTA עם כרטיסי: שיטות שדה, biosafety, וסוגיות התחבורה נפתר

חקור ייצור חלקיקים מוקלדים מדבקים בטיטר גבוה באמצעות גליקופרוטאינים מנגיפי שפעת H5N1 ו-H7N9. שיטה זו מאפשרת הערכת מידת ההדבקה בבטיחות במעבדת BSL-2.

ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות

גלה סרטונים נוספים