8,329 Views
•
08:10 min
•
January 15, 2020
DOI:
טכניקה זו של ייצור PP ויראלי שפעת וקביעת זיהומיות שלה יכול לפשט את המחקר של וירוס שפעת בעיר BSL-2. נרמלנו את PPS עבור זיהומים המבוססים על נתוני qRT-PCR של PPS. שני פלסמיד ביטוי גליקופרוטאין מקודדים, אשר יכול לפשט את המחקר על שיוך וירוס.
יום אחד לאחר זריעת התא, בדוק את מורפולוגיה התא וצפיפות תחת מיקרוסקופ אור הפוך. באופן אידיאלי התא צריך להיות כ 85%confluent ב transfection. החלף את המדיום עם מיליליטר אחד של DMEM ללא סרום לגם, והחזר את הצלחת לאנקובטור.
כדי שכל באר של תאים תחולף, לדלל שמונה microliters של reagent transfection לנפח של 150 microliters עם מדיום סרום מופחת. מערבבים את הפתרון בעדינות ולתת לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. בינתיים, לדלל 2.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לתוך 158 microliters של מדיום סרום מופחת.
לאחר הדגירה של חמש דקות, מערבבים את הדנ”א המדולל עם רגנט טרנספיקציה מדולל, מערבבים בעדינות את הפתרון ומשאירים אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מוסיפים את קומפלקס השומנים DNA ל בארות המתאימות עם התאים במדיום ללא סרום. ואז מערבבים את הצלחת בעדינות על ידי נדנדה קדימה ואחורה.
דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע עד שש שעות. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום ולהחליף אותו עם שני מיליליטר של DMEM לגם. ואז לה הדגירה אותו לעוד 36 עד 48 שעות.
זרע כל סוג של תא רגיש ב 10, 000 תאים ל הבאר וצלחת 96 גם. ואז להשאיר את הצלחת במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים חממת פחמן דו חמצני. ביום השלישי לאחר transfection, לבדוק את הצבע של המדיום אשר צריך להאיר ורוד או כתום מעט ולבחון את התאים עם מיקרוסקופ ביולוגי פלורסנט הפוך תחת 440 כדי 460 אורך גל ננומטר.
ב 38 עד 48 שעות לאחר transfection, לקצור את החלקיקים פסאודוטריד או PPS על ידי עובר אותם דרך 0.45 מיקרומטר פוליווינילידין פלואוריד מסנן פלואוריד כדי לחסל פסולת התא, ולאחר מכן לחלק אותם אליקים נפח קטן ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לכמת את PPS, להעביר 30 microliters של חלקיקים נגיפיים מטוהרים לצינור 1.5 microliter RNase חינם ולהוסיף מיקרוליטר אחד של נקלאז Benzonase. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לחסל כל זיהום DNA ו- RNA.
לאחר הדגירה, להקפיא את המדגם למינוס 70 מעלות צלזיוס כדי פעיל את הגרעין ולהוסיף שני microliters של Proteinase K.Incubate את התערובת במשך 30 דקות כדי לעכל את חלבוני המעטפה ולשחרר את CMV-GFP RNA. ואז לא פעיל פרוטאינאז K ב 100 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לכמת את PPS עם תמלול הפוך כמותי RTPCR באמצעות בדיקה אוניברסלית צעד אחד RT-qPCR קיט פריימרים ובדיקות שצוין בכתב היד טקסט.
לנרמל את PPS לארבע פעמים 10 עד עותקי RNA החמישי למיליליטר. לאחר מכן להוסיף TPCK-טריפסין לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר לתוך PPS כי הנמלים H7N9 hemagglutinin. הדגירה PPS ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי ליצור את תת היחידות הפונקציונליות HA1 ו HA2.
מערבבים את PPS מנורמל עם מדיום DMEM ביחס אחד לאחד, ואז להביא את הצלחת המכילה תאים רגישים לארון biosafety. שאפו את העל-טבעי ושטפו את התאים פעם אחת עם 100 מיקרוליטרים של PBS מחומם מראש. הוסף 100 מיקרוליטרים של תערובת PPS-DMEM לתוך כל באר, שידל את בדיקות ההינקות של כל סוג של PPS לקו תא רגיש אחד.
דגירה הצלחת במשך ארבע עד שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן שאפו את העל-טבעי והחליפו אותו ב-100 מיקרוליטרים של DCM, הדגירה את הצלחת למשך 24 עד 36 שעות נוספות לפני זיהוי הזיהום. התוצאות שלנו הן PPS נחשבים עכשיו זיהומיות לאנשים.
אז נהלי שמירה הכרחיים מומלץ לקחת כגון לבישת מסכה וביצוע בדיקות דביקות ב ארון biosafety. פרוטוקול זה יוצר כדי ליצור 10 סוגים של חלקיקים מדומה או PPS עם שני המגלוטין מקובצים ונוירמינידאז וירוס stomatitis כלי דם G גליקופרוטאין או לא מעטפת גליקופרוטאינים. PPS דימוי עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ואת ההדביקות שלהם הוערכו בשני קווי תאים, A549 ו MDCK.
בקבוצת PPS המכילה H5, ההידביקות של H5N1, H5 plus N9 ו- H5 הייתה כ- 90%18% ו- 10% עבור קו התא A549 ו- 40%5% ו- 5% עבור MDCK, בהתאמה. בקבוצת PPS המכילה H7, ההידביקות של H7N9, H7 plus N1 ו- H7 הייתה כ- 10%7% ו- 1%עבור קו התא A549 ו- 8%4%ו- 1%עבור MDCK, בהתאמה. ההדלקה של וירוס stomatitis כלי דם G גליקופרוטאין PP היה כ 21% עבור A549 ו 16% עבור תאי MDCK.
בעוד מעטפת הדלתא גליקופרוטאינים PP לא הראה שום להדביק. זה קריטי לזכור כי יצרנית PP HEK-293T/17 תאים מהווים את הבסיס של הליך זה. אז הצמיחה האופטימלית מלמדת אותנו שתאי HEK-293T/17 הם החשובים ביותר.
בעקבות הליך זה או בדיקה אחרת כגון L2 פתוח הבדיקה התוחמת ניתן לבצע. ההתדגם הזה כמעט יכול לפטור את המוזרויות הביולוגיות של העדפת הקולטן והתבנית תחשוף את הטרופוליזם של PPS. מאז שהם לקחו את הגליקופרוטאינים מנגיף שפעת משובטים לשניים פלוס מקסימום.
HA וחלבוני NA ניתן ללמוד בנפרד ולכן אנו reassortment ביניהם. ניתן לחקור את המוטנטים ואת ההשפעות הבוגרות.
פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסיוני כדי לייצר מעטפת מדבקת ויראלי מידבקת (עמ') עם גליקורופנים מעטפות משתי שפעת זנים וכיצד לקבוע את הנגועים. פרוטוקול זה מאוד להתאמה כדי לפתח pps של כל סוג אחר של וירוסים עטוף עם מעטפה שונה גליקורופנס.
07:29
Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging
Related Videos
41572 Views
12:09
Avian Influenza Surveillance with FTA Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved
Related Videos
19325 Views
11:08
Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles
Related Videos
35398 Views
12:00
Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species
Related Videos
11224 Views
12:18
Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System
Related Videos
24201 Views
08:40
Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting
Related Videos
59045 Views
07:15
Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity
Related Videos
2302 Views
06:17
Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination
Related Videos
21972 Views
01:59
A Technique for the Generation of Influenza Virus-Like Particles via a Mammalian System
Related Videos
217 Views
01:28
Generating Recombinant Live-Attenuated Influenza Viruses for Vaccines
Related Videos
145 Views
Read Article
Cite this Article
Zhang, F., Wang, Y., Shang, X., Wang, S., Xiao, R., Zhou, H., Cai, L. Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses. J. Vis. Exp. (155), e60663, doi:10.3791/60663 (2020).
Copy