Name: הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: למד הכנת כרומוזומים מיוטיים בזברה דניו רריו באמצעות פרוטוקול פיזור גרעיני. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת כרומוזומים בשלב פרופאזה I, עם מאות גרעינים מפוזרים היטב בכל שקופית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים טרנט ניומן ומאסדה שריפי על הערות על כתב היד ו נגוין על סיוע לייעל את השיטות למריחה ולצביעת כרומוזומים מן הדגים מייציטים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM079115 הוענק S.M.B.

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).</li>
<li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination%2C+Pairing%2C+and+Synapsis+of+Homologs+during+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).</li>
<li>Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+is+a+hub+where+meiotic+double-strand+breaks%2C+synapsis%2C+and+stable+homolog+juxtaposition+are+coordinated+in+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio.</a> PLoS Genetics. 15, e1007730(2019).</li>
<li>Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+distribution+pattern+and+synapsis+initiation+during+spermatogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).</li>
<li>Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+progression+of+recombination+in+human+males%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Temporal progression of recombination in human males.</a> Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).</li>
<li>Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+studies+of+human+meiosis%3A+sex-specific+differences+in+recombination+originate+at%2C+or+prior+to%2C+establishment+of+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks.</a> PLoS One. 8, e85075(2013).</li>
<li>Pratto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+initiation+maps+of+individual+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recombination initiation maps of individual human genomes.</a> Science. 346, 1256442(2014).</li>
<li>Brown, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+synapsis+proceeds+from+a+limited+number+of+subtelomeric+sites+in+the+human+male%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male.</a> American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).</li>
<li>Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+aneuploidy+in+zebrafish+with+mutations+in+the+mitotic+checkpoint+gene+mps1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1.</a> Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).</li>
<li>Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cytogenetic+characterization+of+zebrafish+meiotic+prophase+I+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants.</a> Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).</li>
<li>Sansam, C. L., Pezza, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connecting+by+breaking+and+repairing%3A+mechanisms+of+DNA+strand+exchange+in+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+Journal%22%5BJournal%5D)">Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination.</a> Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).</li>
<li>Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mlh1+Deficiency+in+Zebrafish+Results+in+Male+Sterility+and+Aneuploid+as+Well+as+Triploid+Progeny+in+Females%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females.</a> Genetics. 175, 1561-1569 (2007).</li>
<li>Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Meiotic+Chromosome+Spreads+from+Mouse+Spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e55378(2017).</li>
<li>Moens, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+chiasmata+and+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: chiasmata and interference.</a> Genome. 49, 205-208 (2006).</li>
<li>Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+chromosome+synapsis+and+recombination+in+male+guppies%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies.</a> Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).</li>
<li>Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+and+DAPI+staining+of+the+synaptonemal+complex+of+the+Nile+tilapia+%28Oreochromis+niloticus%29+allow+orientation+of+the+unpaired+region+of+bivalent+1+observed+during+early+pachytene%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene.</a> Chromosome Research. 17 (6), 773(2009).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן אנו מתארים שיטות כדי לחקור את המיקום של טלומרים ו כרומוזום הקשורים חלבונים בפני שטח גרעיני כפולות מבודד spermatocytes מתוך האשכים דג זברה. אנו מצפים כי שיטות אלה יחולו על ניתוח של ספרציטים במינים אחרים של teleost עם הסתגלות לגודל של בדיקת.
בעוד רק כמה נוגדנים הועלו כדי להשתמש בחלבונים meiotic הדגים, יש לנו הצלחה באמצעות נוגדנים הבאים העלה האדם (ח) או העכבר (m) חלבונים. המעבדה שלנו העלה נוגדנים Sycp1 חלבון דג זברה (zfSycp1) בעוף ששימש כסמן אמין עבור synaptonemal קומפלקס (SC), עם זאת, חלבון ...

רבייה מינית ההכנסות באמצעות שילוב של שני מגיים פלואידי, כל אחד סוחב חצי כרומוזום משלים של תא סומאטיק. Meiosis היא חלוקת תאים מיוחדים המייצרת את גמטות מגיים דרך סיבוב אחד של שכפול DNA ושני סיבובים רצופים של הפרדה כרומוזום. ב-prophase I, כרומוזומים הומוולוגי (הומוולוג) חייבים לעבור זיווג, שילוב מחדש וsynapsis, האחרון שמאופיין בהיווצרות הקומפלקס הsynaptonemal המורכב משני צירי הומולוג הגושרים על ידי החוט הרוחבי, Sycp1 (איור 1A, B). אי כראוי לבצע תהליכים אלה יכול להוביל לייצור של מגיים aneuploid, אשר הם הגורם המוביל של הפלות בבני אדם1. הידע שלנו על הקואורדינציה בין זיווג, שילוב מחדש וsynapsis הונחה על ידי מחקרים במגוון רחב של אורגניזמים, כגון שמרים,כגון העכבר, ודרוסופילה, בין השאר2. בעוד התהליך הכללי של שיוך כרומוזום הומוולוגי ואחריו הפרדה היא שמירה היטב, התלות שלה על שילוב מחדש ו synapsis ואת סדר האירועים האלה משתנה.
Meiotic הפסקה כפולה (dsb) היווצרות, אשר יוזם שילוב הומוולוגי, מתרחשת ליד טלומרים באשכולות הזר במהלך לפטוטנא ו synapsis תפתח זמן קצר לאחר3,4. תצורה זו של היווצרות dsb ו synapsis חניכה היא גם מאפיין של המיוזיס גברי בבני אדם, אבל לא בעכבר5,6,7,8, מציע כי דג זברה יכול לשמש כמודל הזרע האנושי. ישנם גם מספר יתרונות מעשיים של הלומדים מיוזיס. שני הזכרים והנקבות עוברים במהלך הבגרות, הגונדות שלהם נגישים בקלות, ומאות צאצאים מופקים מצלב אחד. בנוסף, העוברים שקופים ולפתח חיצונית, אשר מקלה על גילוי מוקדם של סטיות בהתפתחות העובריים בשל מגיים aneuploid3,9. החסרונות של השימוש דג זברה הם כי הם איטיים להגיע בגרות מינית (~ 60 ימים) ואת כמות החומר הדרוש עבור כפולות משטח גרעיני יש לאסוף מ-~ 10-20 בעלי חיים למבוגרים, בהתאם לגודלם.
ההכנות התפשטות כרומוזום מיוטית הם כלי חיוני עבור לימוד דינמיקה כרומוזום בכל האורגניזמים המודל, מאז חתימות מפתח של דינמיקה כרומוזום meiotic יכול להיות נחקר. ב zebrafish, היבטים מרכזיים של ההתקדמות של התוכנית meiotic והארגון הגרעיני כבר גזור דרך בודק כפולות משטח גרעיני, המכונה כאן כמו כרומוזום מתפשט, עם נוגדנים לזיהוי אימונוofor, חלבונים ו/או חומצות גרעין על ידי דגים3,4,9,10,11,12. ואכן, ניתן לשמור על ההתאמה המקוטלת של טלומרים באשכולות בפרחים בהכנה לכפולה (איור 1C). לאחרונה, השתמשנו בכרומוזום הספרציט spermatocyte מתפשט יחד עם שיטות זיהוי של הקרינה הפלואורסצנטית ומיקרוסקופ סופר ברזולוציה כדי להבהיר את ההתקדמות המפורטת של הדינמיקה של ההומופיש, שיוך כרומוזום הומוולוגי, לוקליזציה של כפול סטרנד, ו synapsis ב מעברים meiotic מפתח3. כאן אנו מציגים שיטות כדי להכין כרומוזום כפולות מן הזרע של האשכים דג זברה ולאחר מכן כתם אותם עם חומצות הגרעין של הפלורסנט פפטיד (הרשות הפלסטינית) בדיקות חוזרות ונשנות רצפי ו מimmunofluorescence זיהוי של חלבונים הקשורים בכרומוזום.

<table><tbody><tr><td>צינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>מספר מותגים מסחריים זמינים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל מתלה צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>מספר מותגים מסחריים זמינים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% פורמלדהיד, ללא מתנול</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל</td><td>מספר מותגים מסחריים זמינים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 מ"מ כיסויי זכוכית</td><td>קורנינג</td><td>2980-245</td><td></td></tr><tr><td>24 x 60 מ"מ כיסויי זכוכית VWR</td><td>International</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"ל</td><td></td> תיק חיטוי <td>ThermoFisher Scientific</td> 363696 <td></td></tr><tr><td>מספר</td><td>מותגים מסחריים זמינים</td><td></td><td>המשמשים לייצור כיסויי פלסטיק.</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td>הכינו תמיסת מלאי של 100 מ"ג/מ"ל במים מזוקקים סטריליים.</td></tr><tr><td>מסננת תאים, 100 ומיקרו; m</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CF405M עיזים נגד עוף IgY (H+L), ביוטיום נספג מאוד</td><td></td><td>203775-500uL</td><td>השתמש ב-1:1000</td></tr><tr><td>עוף anti-zfSycp1</td><td>נוצר על ידי מעבדת ברג'ס</td><td>N/A</td><td>שימוש ב-1:100</td></tr><tr><td>קולגנאז מ-Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת קופלין</td><td>מספר מותגים מסחריים זמינים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I, דרגה II מלבלב בקר</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>MT10014CV</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 5</td><td>Forceps Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>שניים נדרשים לניתוח האשכים.</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes, 5 מ"ל</td><td>VWR International</td><td>89429-308</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד עוף IgY (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11039</td><td>השתמש ב-1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן משני IgY (H+L) נגד עוף עיזים, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11042</td><td>השתמש ב-1:1000</td></tr><tr><td>עז נגד hDMC1</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-8973</td><td>לא עובד בידיים שלנו</td></tr><tr><td>עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>השתמש ב-1:1000</td></tr><tr><td>עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11012</td><td>השתמש ב-1:1000</td></tr><tr><td>סרום</td> <td>עיזיםסיגמא-אולדריץ'</td><td>G9023-10 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>תא לחות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-112-3683</td><td></td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה</td><td>VWR International</td><td>230401V (דגם 5420)</td><td></td></tr><tr><td>שייקר חממה</td><td>ניו ברונסוויק דגם מדעי</td><td>קלאסי C25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>פישר Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimerbly-Clark Professional</td><td>34155</td><td>משמש לתא הלחות</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td> מספר <td>מותגים מסחריים זמינים</td><td></td><td>כל מיקרוסקופ סטנדרטי המסוגל להגדלה של ~1.65X לפחות.</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נגד אוגרSCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>לא עובד בידיים שלנו</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-hMLH1</td><td>BD Biosciences</td><td>550838</td><td>לא עובד בידיים שלנו</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-hRPA</td><td>סיגמא-אלריך</td><td>MABE285</td> לא <td>עובד בידיים שלנו</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &middot; 7 H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Photo-Flo 200</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>74257</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות העברת פלסטיק</td><td>מספר מותגים מסחריים זמינים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PNA TelC-Alexa647</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1013</td><td>הכן לפי היצרן s הוראות.</td></tr><tr><td>PNA TelC-Cy3</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>הכן לפי הוראות היצרן.</td></tr><tr><td>ProLong יהלום Antifade</td><td>Mountant ThermoFisher Scientific</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>ProLong יהלום Antifade Mountant עם DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36971</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-hRPA</td><td>Bethyl</td><td>A300-244A</td><td>שימוש ב 1:300</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-hSCP3</td><td>Abcam</td><td>ab150292</td><td>השתמש ב 1:200</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-hRad51</td><td>GeneTex</td><td>GTX100469</td><td>שימוש ב-1:300</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>מספריים סופר-חתוכים, זווית 30& מעלות, 10 ס"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-822-353</td><td>יכול גם להשתמש בכל זוג מספריים קטנים.</td></tr><tr><td>ערכת סילגארד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9897184</td><td>הכן לפי הוראות היצרן.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>יש לדלל במים מזוקקים סטריליים כדי ליצור פתרון עבודה של 20%. יש לאחסן בטמפרטורת החדר. טריטון X-100 יוצר משקע כאשר הוא מדולל במים; משקעים מתמוססים בן לילה.</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>וורת'ינגטון ביוכימי</td><td>LS003708</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין מחלבון ביצת עוף</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td>יש לדלל במים מזוקקים סטריליים כדי ליצור תמיסת עבודה של 20%. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>Vannas מספריים קפיציים - 4 מ"מ (מספריים מיקרו</td>)<td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis הוא תהליך הסלולר המפתח הנדרש כדי ליצור מגיים פלואידי עבור רבייה מינית. אורגניזמים מודל היו אינסטרומנטלי הבנת האירועים כרומוזום כי מתרחשים במהלך proiotic, כולל הזיווג, synapsis, ושילוב מחדש אירועים המבטיחים הפרדה כרומוזום נכון. בזמן שהעכבר היה מודל חשוב להבנת המנגנונים המולקולריים הנמצאים בבסיס תהליכים אלה, לא כל האירועים המיוטיים במערכת זו הינם מקבילה למיוזיס אנושי. לאחרונה הדגמנו את הפוטנציאל המרגש של דג הזיברפיש כמודל של זרע-בראשית אנושי. כאן אנו מתארים, בפרוטרוט, שיטות שלנו להמחיש כרומוזומים מיוטיים וחלבונים הקשורים ההכנות כרומוזום התפשטות. ההכנות הללו יש את היתרון של מתן ברזולוציה גבוהה ניתוח של מבנים כרומוזום. ראשית, אנו מתארים את ההליך לבתר את האשכים של מבוגרים zebrafish, ואחריו הדיסוציאציה תא, הליזה, והפצת הכרומוזומים. לאחר מכן, אנו מתארים את ההליך לגילוי הלוקליזציה של חלבונים כרומוזום meiotic, על ידי זיהוי אימונוofor, ו חומצות גרעין רצפים, על ידי היברידיזציה באתרו (דג). טכניקות אלה מהווים ערכה שימושית של כלים לניתוח ציטולוגי של אדריכלות כרומטין מיוטית במערכת הדגים. חוקרים בקהילה דג זברה צריך להיות מסוגל במהירות לשלוט בטכניקות אלה ולשלב אותם לניתוח הסטנדרטי שלהם של תפקוד הרבייה.

יש לנו מתווה שיטה כדי להכין ולהמחיש הדמיה של ההכנות התפשטות הזרע. כאשר מבוצעת בצורה נכונה, ההליך שלנו מניב היטב, גרעינים לא חופפים. כדי לשחזר את הגרעינים האלה, חשוב לקבל את הכמות המתאימה של חומר ההתחלה (כלומר, האשכים), לטפל באשכים למשך זמן מספיק בטריפסין ומספר הולם של טיפול DNase I. ממרחים אלה יכולים להיות מוכתם עבור טלומרים וחלבונים meiotic ללמוד התקדמות meiotic במהלך prophase I. איור 1 מתאר דוגמאות של ההכנות התפשטות מוכתם תכונות כרומוזום בשלבים שונים של pro...

כפולות משטח גרעיני הם כלי הכרחי עבור לימוד אירועי כרומוזום במהלך meiosis. כאן אנו מדגימים שיטה כדי להכין ולדמיין כרומוזומים מיוטיים במהלך prophase הייתי מתוך הדגים הספרציטים.

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

זברפיש מתגלה כמודל בעלי חוליות מצוין לחקר אירועי הכרומוזום של מיוזיס כולל זיווג כרומוזום הומולוגי, סינפסיה וקומבציה. פרוטוקול הפצת פני השטח הגרעיניים הזה איפשר לנו לדמיין תכונות מפתח של ארכיטקטורת כרומוזום מיוטית באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציית-על. החוקרים יכולים לצפות למאות גרעינים מפוזרים היטב לכל שקופית עם פחות פסולת מאשר פרוטוקולים אחרים של התפשטות זברה.החלק המאתגר ביותר מבחינה טכנית של הליך זה הוא ניתוח של האשכים zebrafish כפי שהוא בסמיכות לעור והוא מחובר גם לאיברים אחרים. הדמיה של הליך הניתוח תאפשר לחוקרים לדעת למה לצפות כשהם רואים את הקנאד מוטבע ברקמת החיה. לאחר המתת דם של דגי זברה זכרים, ערפו את ראשו של דג אחד בכל פעם במספריים קטנים ולאחר מכן השתמשו במספריים זעירים כדי לחתוך לאורך קו האמצע הגחוני כדי לחשוף את חלל הגוף.מניחים את הדגים בצלחת פטרי מצופה סיליקון ומכסים על ידי בריכה רדודה של 1X PBS. תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 1.65, לנתח את האשכים באמצעות מדפים. הסר ככל שומן הרקמה שמסביב מן האשכים ככל האפשר.הקנאד ייראה שקוף תחת אור היקף הניתוח בעוד השומן שמסביב עשוי להיות מראה מעט כהה יותר. כמות מסוימת של שומן ניתן להשאיר על gonad מבלי לעכב את ההליך. מוסיפים כל אשך נותח ישירות לתוך צינור חמישה מיליליטר עם שני מיליליטר של DMEM ולשמור על קרח.כדי לנטרל את תאי האשכים, להוסיף 200 micro

preparation-of-meiotic-chromosome-spreads-from-zebrafish-spermatocytes

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

זוהי שיטה להפקת דיפלואידי gynogenetic עוברי דג הזברה (אשר עוברים רק תרומה גנטית מגיע מהאם) על ידי חסימת חלוקת meiotic מחרה מחזיק אחריה מיד לאחר ההפריה עם זרע אור אולטרה סגול מומת. עוברים EP אינם הומוזיגוטים במלואה עקב רקומבינציה במהלך החלוקה meiotic הראשון, אולם הם הומוזיגוטים בכלל לוקוסים שלא היה מופרד centromere שלהם על ידי רקומבינציה.

ביצוע דיפלואידי דג הזברה Gynogenetic על ידי לחץ מוקדמת

פרוטוקול מתואר להכנת התפשטות כרומוזומים מיטוטיים איכותיים בשיטת ייבוש אוויר מהירה המתאימה לזיהוי FISH של בדיקות DNA בודדות וגבוהות.

כרומוזום מהיר האוויר יבש השמטת הכנת שיטה מתאימה לדגים בצמחים

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

פרוטוקול שונה עבור מניפולציה ploidy משתמשת הלם החום להשפיע על דוכן אחד-מחזור ב cytokinesis בעובר המוקדם. פרוטוקול זה מודגם דג הזברה אבל עשוי לחול על מינים אחרים.

מניפולציה ploidy של עוברי דג הזברה עם חום 2 הלם טיפול

מיוזה הוא תהליך התפתחותי שבו נוצרות גמטות דרך סבב אחד של שכפול ה-DNA, שני סיבובים רצופים של כרומוזום סגרגציה. מיוזה יונקים יכולים להיבדק על ידי ניצול טכניקה כדי להכין ממרחים כרומוזום meiotic. . הנה, נדגים שיטה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.

הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes

המטרה העיקרית של מחקר זה היה להתאים את המחט שקוע ויטריפיקציה (ניב) הליך כדי cryopreserve כל דג זברה האשכים. בנוסף, נבדקה את הדיר של שיטת חמישה זנים שונים דג זברה.

הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לבודד תאי חיידקים מיוטיים ופוסט-מיוטיים חיים מערכי עכבר בוגרים. באמצעות ציטוקסיות נמוכה, צבע מחייב DNA סגול-נרגש ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, ניתן לבודד אוכלוסיות תאי זרע מועשרים מאוד עבור יישומים רבים במורד הזרם.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להפרדת תאים זקיקיים וביצית בזקיקים השחלות זברה, אשר יקל על חקירות של התפתחות השחלות ב זברה.

הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

למד הכנת כרומוזומים מיוטיים בזברה דניו רריו באמצעות פרוטוקול פיזור גרעיני. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת כרומוזומים בשלב פרופאזה I, עם מאות גרעינים מפוזרים היטב בכל שקופית.

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

גלה סרטונים נוספים