אפיון Exon דילוג יעילות בדגימות החולה DMD בניסויים קליניים של אנטיסנס אוליגונוקליאוטידים
7 במאי 2020
כאן, אנו מציגים את האפיון המולקולרי של ביטוי דיסטרופין 38 באמצעות רצף סנגר, RT-PCR, וכתמים מערביים בניסוי הקליני.
פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה מתוקנת להכנת וטיפול ברקמת השריר בהגדרות פרה-קליניות ובניסויים קליניים, החשובה להשגת תוצאות אמינות בתחום ה-DMD. הטכניקות רלוונטיות עבור exon דילוג על נסיונות עבור DMD. והיתרון העיקרי הוא כי, הם מבוססים היטב לשחזור אם מתבצע באופן קולקטיבי.
טכניקות אלה מתמקדות בעיקר דילוג exon ב DMD, אבל עם שינוי של פריימרים, אותן טכניקות ניתן ליישם על מחלות אחרות שטופלו עם טיפולים splicing. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להשיג אקסון דילוג יעילות הן RNA וחלבון. כדי להכין מדגם לניתוח, ראשית לערבב כמויות שוות של מסטיק tragacanth ומים עד החניכיים הופך רך ודביק.
טוענים תערובת זו לתוך 25 מזרקים מיליליטר ולוותר 0.5 עד סנטימטר אחד של מסטיק על דיסקי פקק בודדים. סמן את הדיסקים בצד הנגדי והצב מיכל איזופנטאן בחנקן נוזלי עד שחלק מהנוזל קופא. מניחים כל דגימה לתוך מסטיק tragacanth על הדיסקים עם ציר אורך של כל שריר בניצב לפקק.
מניחים מסטיק סביב לתחתית של כל שריר כדי לעזור להחזיק את השריר במקום, ולהשתמש פינצטה להקפיא את הדגימות isopentane קר. מזיזים את הדגימות ברציפות למשך דקה אחת או עד להקפאה מוחלטת לפני הנחתן באופן זמני על קרח יבש. לאחר מכן, מניחים את הדגימות בבקבוקוני זכוכית לאחסון של 80 מעלות צלזיוס.
כדי לקטע את רקמת השריר הקפואה לניתוח, הגדר קריוסטט לטמפרטורת עבודה של 25 מעלות צלזיוס, ולהעלות את בלוק השריר על המחזיק. לקצץ את בלוק הרקמה עד חלקים שטוחים מושגים. לקבלת PCR תעתיק הפוך וניתוח כתם מערבי, לקבל 10 פרוסות מיקרומטר עבה.
לניתוח אימונוהיסטוכימי, השג שש עד שמונה פרוסות בעובי מיקרומטר, ולכתמת המטוקסילין ואאוסין, השג פרוסות בעובי 10 עד 12 מיקרומטר. לאחר הרכישה שלהם, למקם את החלקים פרוסים בשני צינורות מיליליטר. אחסן את הדגימות עבור PCR ורוקט מערבי ב 80 מעלות צלזיוס.
כאן, מערכת אלקטרופורזה שבב, תמונות ג'ל של תגובות PCR תעתיק הפוך, ואת תוצאות רצף של הלהקה דילוג משני חולים לפני ואחרי הטיפול עם oligonucleotide antisense בניסוי שלב הסלמה מנה אחת מוצגים. שני המטופלים מטפחים מחיקות. כצפוי, לפני הטיפול, שני המטופלים לא הראו דילוג ורק להקה שלא דילגה יכולה להיות חזותית.
לאחר 12 שבועות של טיפול, רצועה תחתונה ברורה דילגה היה חזותי עבור המטופל השני, עם זאת, זה עדיין היה קשה לזהות כל מוצר דילוג עבור המטופל הראשון. תוצאות רצף הראו שרשור של exons 47 ו 54 עבור החולה השני, ו exons, 44 ו 54 עבור החולה הראשון. כדי לחשב את אחוז הדילוגים, הריכוז הטוחן של הרצועה שדילגת עליה חולק על-ידי הרצועות שהמערכת דילגה עליהן והתהפך.
כצפוי, לא זוהתה להקת דיסטרופין על ידי כתם מערבי לפני הטיפול. לאחר הטיפול זוהתה רצועה מהחולה השני עם משקל מולקולרי נמוך יותר בהשוואה לזה שנצפה בשליטה הבריאה. החולה הראשון, לעומת זאת, לא הראה רמות ניתנות לגילוי של דיסטרופין לאחר הטיפול.
זה קריטי כדי לטפל ברקמת השריר כראוי, ולה מניח כל דגימה על מסטיק tragacanth באופן עקבי. ניתן לנתח את מקטעי הרקמה במספר דרכים שונות, כולל PCR מלאכותי, PCR דיגיטלי, כתם מערבי, אימונוהיסטוכימיה, ועם סוגים שונים של omics. טכניקות אלה ניתן להאיץ, הפיתוח, exon נוסף דילוג תרופות מיקוד exons שונים, והוא יכול להיות מיושם על הפיתוח של ויראלי מבוסס ושוב בעריכה עבור DMD.
סקירה כללית
מחקר זה מציג מתודולוגיה סטנדרטית להכנה ולטיפול ברקמת שריר בניסויים קליניים הקשורים לדיסטרופיה שרירית מסוג דושן (DMD). הדגש הוא על טכניקות של דילוג על אקסונים (exon skipping), החיוניות לפיתוח טיפולים יעילים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- ניסויים קליניים
רקע
- דיסטרופיה שרירית מדושן (DMD) היא מחלה חמורה של ניוון שרירים.
- דילוג על אקסונים (Exon skipping) הוא גישה טיפולית מבטיחה עבור DMD.
- טיפול אמין ברקמות חיוני לקבלת תוצאות ניסיוניות מדויקות.
- שיטות סטנדרטיות יכולות לשפר את השחזוריות במחקר.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול מהימן להכנת רקמת שריר.
- סיוע בניסויי דילוג על אקסונים (exon skipping) עבור DMD.
- אספקת מסגרת עבודה שניתן ליישם על מחלות אחרות המטופלות בטיפולים מבוססי שחבור (splicing).
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת רקמת שריר באמצעות גומי טרגקנת ואיזופנטאן.
- הקפאה וחיתוך של דגימות שריר לצורך אנליזה.
- Reverse transcriptase PCR ו-Western blotting לזיהוי ביטוי של dystrophin.
- ריצוף לצורך ניתוח יעילות של דילוג אקסונים (exon skipping).
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של פסים מדלגים (skipped bands) בחולים שטופלו.
- זיהוי של dystrophin בחולה אחד לאחר הטיפול.
- שונות בתגובה לטיפול בקרב החולים.
- הדגשת החשיבות של טיפול עקבי ברקמות להשגת תוצאות מדויקות.
מסקנות
- שיטות סטנדרטיות הן קריטיות לקידום טיפולים ב-DMD.
- דילוג על אקסונים (Exon skipping) מראה פוטנציאל אך דורש אופטימיזציה נוספת.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על שיטות אלו עבור יישומים רחבים יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה קובע תהליך עבודה סטנדרטי להערכת יעילות דילוג על אקסון (exon skipping) בדגימות של חולי DMD, ובכך הוא תומך ישירות בתיקוף המטרה בפיתוח אוליגו-נוקלאוטידים אנטי-סנס (antisense oligonucleotide). על ידי מתן אפשרות למדידה כמותית של השחזור המולקולרי, הוא מספק הפחתת סיכונים מכניסטית עבור טיפולים המבוססים על דילוג על אקסון 53, כגון viltolarsen. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי במעבר מהשלב הפרה-קליני לשלב הקליני על ידי קישור בין תוצאות ביוכימיות למנגנון הטיפולי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של דילוג אקסונים המתווך על ידי אוליגוניוקלאוטידים אנטי-סנס כהיפותזה טיפולית בדגימות המופקות ממטופלים.
- ערך תפעולי: מספק שיטות ניתנות לשחזור של ריצוף סנגר (Sanger sequencing), RT-PCR ו-Western blot לאישור פעילות מולקולרית במטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר יחסי רצועות של דילוג-לסך-הכל כמותיים לצורך הערכת תגובה למינון ביעילות דילוג אקסונים.
- ערך תפעולי: מתקינן את פרוטוקולי הכנת הרקמות והחיתוך כדי להבטיח את הדיוק והשחזור של הבדיקה במערכי דגימות פרה-קליניים וקליניים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בניתוח מערכות רלוונטיות למחלה על ידי אפיון שחזור הדיסטרופין בביופסיות שריר של מטופלים בפועל.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות מדדים מולקולריים עקביים במערכות מודל שונות.
שילוב בקו תהליך ובזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל (lead identification), ומספקת אישור מולקולרי למנגנון לפני בדיקת יעילות תפקודית.
- ביולוגיה של גילוי: מאשר תיקון של שחבור אקסונים (exon splicing) במטרה בתוך דגימות של חולים, ובכך תומך בתיקוף ההשערה עבור אוליגוניוקלאוטידים אנטי-סנס (antisense oligonucleotides).
- סריקה: מספקת אחוזי דילוג על אקסונים (exon skipping) כמותיים באמצעות דימוי ג'ל וריצוף, מה שמאפשר השוואה בין תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת כימות של פסים מדולגים המבוסס על ריכוז מולרי לצורך ניתוח השוואתי בין מינונים וחולים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין דילוג מולקולרי על אקסונים לבין זיהוי חלבון הדיסטרופין (dystrophin), ובכך מגשר בין המנגנון ברמת ה-RNA לתוצאה ברמת החלבון.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת מסגרת ניתנת לשימוש חוזר לטיפול וניתוח רקמות, הישמימה עבור מטרות אקסונים וטיפולי שחבור מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: הפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות ויזואליזציה ישירה של דילוג אקסונים (exon skipping) ושחזור דיסטרופין ברקמה אנושית.
- ערך תפעולי: הטמעה סטנדרטית במיסטיק טראגקנת' (tragacanth gum) וחיתוך קריוסטטי מבטיחים עקביות של הדגימות ומפחיתים שונות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת ראיות מולקולריות למעורבות המטרה (target engagement) לפני הגעה לנקודות קצה תפקודיות.
- השפעה על פורטפוליו המוצרים: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (antisense oligonucleotides) בהתבסס על יעילות דילוג האקסונים בגנוטיפים רלוונטיים של חולים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של ביולוגיה מולקולרית, כולל RT-PCR, Western blotting וריצוף סנגר (Sanger sequencing).
- תלוי בציוד קריוסטט לחיתוך רקמות ובחנקן נוזלי/איזופנטאן להקפאה מהירה.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לטיפול ברקמות כדי לשמור על שלמות הדגימות בין אתרים או נקודות זמן שונות.
- חייב לקחת בחשבון שונות במוטציות ספציפיות למטופל בעת תכנון פריימרים לזיהוי דילוג אקסונים (exon skipping).
- מוגבל בשל האופי החצי-כמותי של שיטות מבוססות ג'ל ללא תיקוף באמצעות PCR דיגיטלי או אלקטרופורזה קפילרית.
