Name: אפיון Exon דילוג יעילות בדגימות החולה DMD בניסויים קליניים של אנטיסנס אוליגונוקליאוטידים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: למדו פרוטוקול סטנדרטי להכנת רקמת שריר עבור ניסויים קליניים ב-DMD באמצעות טכניקות דילוג אקסונים. שיטות אלו מאפשרות זיהוי דיסטרופין וניתוח יעילות הטיפול בחולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לד"ר טקאשי סאיטו, ד"ר טצויה נאגאטה, מר סאטושי מסודה, וד"ר ארי טקשיטה לדיון מדעי.

<ol><li>Bushby, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Duchenne+muscular+dystrophy%2C+part+2%3A+implementation+of+multidisciplinary+care%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 2: implementation of multidisciplinary care.</a> Lancet Neurology. 9 (2), 177-189 (2010).</li>
<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H. Jr, Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin%3A+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51 (6), 919-928 (1987).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-based+path+to+newborn+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).</li>
<li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+21+years+experience+in+Wales+%28UK%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li>
<li>Greenberg, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+studies+in+newborn+males+with+Duchenne+muscular+dystrophy+detected+by+neonatal+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Gene studies in newborn males with Duchenne muscular dystrophy detected by neonatal screening.</a> Lancet. 2 (8608), 425-427 (1988).</li>
<li>Forrest, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+studies+of+gene+deletions+that+cause+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies.</a> Genomics. 2 (2), 109-114 (1988).</li>
<li>Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+explanation+for+the+phenotypic+differences+between+patients+bearing+partial+deletions+of+the+DMD+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus.</a> Genomics. 2 (1), 90-95 (1988).</li>
<li>Flanigan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+spectrum+of+DMD+mutations+in+dystrophinopathy+patients%3A+application+of+modern+diagnostic+techniques+to+a+large+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Mutational spectrum of DMD mutations in dystrophinopathy patients: application of modern diagnostic techniques to a large cohort.</a> Human Mutation. 30 (12), 1657-1666 (2009).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-frame+dystrophin+following+exon+51-skipping+improves+muscle+pathology+and+function+in+the+exon+52-deficient+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">In-frame dystrophin following exon 51-skipping improves muscle pathology and function in the exon 52-deficient mdx mouse.</a> Molecular Therapy. 18 (11), 1995-2005 (2010).</li>
<li>Lu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amounts+of+dystrophin+produced+by+skipping+the+mutated+exon+in+the+mdx+dystrophic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse.</a> Nature Medicine. 9 (8), 1009-1014 (2003).</li>
<li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+systemic+morpholino+exon-skipping+in+Duchenne+dystrophy+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs.</a> Annals of Neurology. 65 (6), 667-676 (2009).</li>
<li>Kesselheim, A. S., Avorn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approving+a+Problematic+Muscular+Dystrophy+Drug%3A+Implications+for+FDA+Policy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Approving a Problematic Muscular Dystrophy Drug: Implications for FDA Policy.</a> Journal of the American Medical Association. 316 (22), 2357-2358 (2016).</li>
<li>Mendell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eteplirsen+for+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Eteplirsen for the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Annals of Neurology. 74 (5), 637-647 (2013).</li>
<li>Komaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+the+antisense+oligonucleotide+NS-065%2FNCNP-01+for+skipping+of+exon+53+in+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).</li>
<li>Verheul, R. C., van Deutekom, J. C., Datson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Droplet+PCR+for+the+Absolute+Quantification+of+Exon+Skipping+Induced+by+Antisense+Oligonucleotides+in+%28Pre-%29Clinical+Development+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital Droplet PCR for the Absolute Quantification of Exon Skipping Induced by Antisense Oligonucleotides in (Pre-)Clinical Development for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> PLoS One. 11 (9), e0162467(2016).</li>
<li>Takizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Duchenne+muscular+dystrophy+in+MYOD1-converted+urine-derived+cells+treated+with+3-deazaneplanocin+A+hydrochloride%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3807(2019).</li>
</ol>

אף לא אחד .

ניסויים קליניים של DMD יצרו גם הצלחות וכישלונות בשנים האחרונות. הן RT-PCR והן כתמים מערביים הם טכניקות נפוצות כדי להעריך את יעילות דילוג שנוצר על ידי exon-דילוג תרכובות הניתנות לחולים. עם זאת, RT-PCR דווח להעריך יתר על המידה את יעילות דילוג לעומת PCRדיגיטלי 15. למרות שזה בגלל מספר סיבות, זה נגרם בעיקר על ידי ההגדלה יעילה יותר של שברים קטנים מדלג במהלך מחזורי PCR. נראה כי RT-PCR בשימוש בניסוי קליני זה גם יצר יעילות דילוג גבוהה יותר בהשוואה לביטוי החלבון המוערך על ידי כתמים מערביים. על פי ה-FDA, זוהי דרך אמינה יותר לכמת שיקום דיסטרופין12. לפיכך, יש לנקוט זהירות בעת פענוח תוצאות דילוג RT-PCR; עם זאת, עדיין ניתן להשוות את הדגימות. דוגמאות המציגות יעילות דילוג גבוהות יותר בהתבסס על תוצאות RT-PCR בדרך כלל מופקעות רמות גבוהות יותר של ביטוי חלבון בניתוחי כתם מערבי.
מאז כל החולים בניסויים קליניים DMD אין את אותו דפוס מחיקה, זה יכול להיות קשה לעצב פריימרים ובדיקות כי הם ספציפיים במידה מספקת כדי לבצע דיגיטלי או qPCR על כל הדגימות. לפיכך, RT-PCR היא עדיין אלטרנטיבה טובה להערכה ראשונה של יעילות דילוג. לפני הניסוי הקליני של NS-065/NCNP-01 החל, זה היה מייגע להעריך דילוג יעילות עבור כל מטופל במבחנה מאז או שריר או ביופסיה בעור היה חובה כדי ליצור myoblasts ספציפי למטופל. עם זאת, פרסמנו לאחרונה טכניקה חדשנית כדי ליצור MYOD1 ספציפי למטופל מומר, נגזר שתן תאים (UDCs) כמו מודל תא שריר DMDרומן 16. לפיכך, רק שתן שנאסף מהמטופל נדרש כדי ליצור את myoblasts, ואין צורך בהליך פולשני. אנו מאמינים כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לסנן AONs שונים בתאים ספציפיים למטופל. יתר על כן, פריימרים שונים ובדיקות ניתן לבדוק לפני המטופל מתחיל כל ניסוי קליני. זה יכול להקל על השימוש qPCR או PCR דיגיטלי עבור exon דילוג מדידה בניסויים קליניים DMD בעתיד.
לביצוע ניתוח כתם מערבי בניסוי קליני זה, נעשה שימוש בנוגדן יחיד נגד דיסטרופין, ורק בקרה בריאה אחת שימשה ודגימת התייחסות. לפיכך, הספציפיות של הנוגדן לא אומתה כראוי. זה, יחד עם העובדה כי הנוגדן מכיר רק את התחום C-מסוף של דיסטרופין, היא מגבלה של הפרוטוקול. בקרות בריאות יותר ונוגדנים מכוונים נגד תחומים שונים של מולקולת דיסטרופין מומלצים בעתיד.
כאן, סיכם את הפרוטוקולים ששימשו בניסוי הראשון של החוקרים ביוזמת החוקר, הראשון בבני אדם של NS-065/NCNP-01. NS-065/NCNP-01 עשוי להיות ישים ל-10.1% מהחולים עם DMD.

ניוון שרירים Duchenne (DMD) היא מחלת שריר ניוונית הגורמת לאובדן הדרגתי של מסת שריר, כשל נשימתי, קרדיומיופתיה, וזה מוביללמוות בטרם עת 1. המחלה נגרמת על ידי חוסר דיסטרופין חלבון שריר מבני גדול2. מוטציות בגן DMD על כרומוזום X הם רצסיביים, והמחלה משפיעה 1 ב 3500-5000 זכרים שזהם נולד 3,,4,,5. המוטציות הן לעתים קרובות מחיקות גדולות באזור נקודה חמה בין exons 44 ו 55 שמובילים למסגרת קריאה מעוותת וקודונים עצירה מוקדמת, גרימת ריקבון בתיווך שטויות וחוסר כמעט מוחלט של חלבון דיסטרופין6,,7,8. ניתן לתקן את מסגרת הקריאה באמצעות אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (AONs) הגורם לאקסון דילוג ושחזור של מסגרת הקריאה, שחזור חלקי של ביטוי דיסטרופין ועיכוב התקדמותהמחלה 9,10,11. morpholino AON eteplirsen, אשר אושרה לאחרונה על ידי סוכנות התרופות הפדרלית (FDA), גורם דילוג של exon 51 והוא יכול לשחזר את מסגרת הקריאה בחולים עם exon 52מחיקות 12,13. עם זאת, exon 53 דילוג משחזר את מסגרת הקריאה עבור חולים עם exon 52 מחיקות, וזה יכול לטפל פוטנציאלית כ 10% של חולי DMD14. NS-065/NCNP-01 morpholino התרופה NS-065/NCNP-01 כבר הראה לגרום exon 53 דילוג בתאים אנושיים, ולאחרונה נתנו NS-065/NCNP-01 לחולים DMD בשלב 1 פתוח תווית מינון הסלמה ניסוי קליני (להלן, המכונה "המחקר") (רשום כUMIN: 000010964 ו ClinicalTrials.gov: NCT02081625)14. המחקר הראה עלייה תלויה במינון של exon 53 דילוג בהתבסס על RT-PCR ורמות חלבון דיסטרופין המבוסס על כתמים מערביים, ולא תופעות לוואי חמורות או נושריםנצפו 14.
בכל הניסויים הקליניים, הניתוח של התוצאות הוא בעל חשיבות עליונה. עבור ניסויים קליניים DMD, דיון הוא עדיין מתמשך לגבי השיטה הטובה ביותר כדי להראות יתרון טיפול. לבדיקות קליניות כגון בדיקת הליכה של 6 דקות יש חסרונות מסוימים. אפיון מולקולרי של ביטוי הדיסטרופין יכול להתבצע באמצעות מספר שיטות, כגון RT-PCR, qPCR, דיגיטלי-PCR, כתמים מערביים, וimmunohistoistoistry. עם זאת, היקף שיקום ביטוי החלבון הנדרש כדי להקנות תועלת קלינית נותר לא ברור. במאמר שיטות זה, אנו מתארים בפירוט את RT-PCR ושיטות ההתנפחות המערביות המשמשות לקביעת רמות האקסון ורמות החלבון, בהתאמה, בניסוי שלב 1 של AON דילוג על התרופה NS-065/NCNP-0114.

<table><tbody><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Takara</td><td>3407A</td><td>תמיסת סמן עבור</td></tr><tr><td>תמיסת חיץ MultiNA 1mol/l-Tris-HCl (pH 7.6)</td> <td>Nacalai</td><td>35436-01</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>Nacalai</td><td>21418-42</td><td></td></tr><tr><td>2-מתילבוטן (איזופנטן)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>15-2220</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול</td><td>פלקון</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>6 פעמים; מאגר טעינה</td><td>Takara</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Agarose ME</td><td>Iwai כימי</td><td>50013R</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer</td><td>Applied Biosystems</td><td>A41046</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין פתרון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>Nacalai</td><td>05808-61</td><td></td></tr><tr><td>צלחות Centri-Sep 96 בארות</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td>4367819</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>רוש</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Blocking Reagent</td><td>GE healthcare</td><td>RPN418</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Blotting Detection Reagent</td><td>GE healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>GeneTools</td><td>2922498000</td><td></td></tr><tr><td>Experion תחנת אלקטרופורזה אוטומטית</td><td>Bio-Rad</td><td>7007010</td><td>מערכת אלקטרופורזה של Microchip</td></tr><tr><td>ערכת ניתוח Experion DNA 1K ל-10 שבבים</td><td>Bio-Rad</td><td>7007107JA</td><td></td></tr><tr><td>Experion תחול תחנת</td><td>ביו-ראד</td><td>7007030</td><td></td></tr><tr><td>Experion Vortex Station II</td><td>Bio-Rad</td><td>7007043</td><td></td></tr><tr><td>עבה במיוחד כתם נייר מסנן</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>EzBlot</td><td>Atto</td><td>AE-1460</td><td></td></tr><tr><td>ג'לRed חומצת גרעין ג'ל כתם</td><td>ביוטיום</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון זכוכית</td><td>Iwaki</td><td>1880 SV20</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>נקלאי</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>היסטופין כתם פשוט MAX PO</td><td>Nichirei</td><td>424151</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת העברת אימובילון-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH304F0</td><td></td></tr><tr><td>ITS תוסף מדיה נוזלית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp סרט דבק שקוף</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td>4306311</td><td></td></tr><tr><td>MultiNA</td><td>SHIMADZU</td><td>MCE-202</td><td>מערכת אלקטרופורזה של מיקרו-שבב B</td></tr><tr><td>Multiplate 96-Well PCR לוחות</td><td>Bio-Rad</td><td>mlp9601</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis ספקטרופוטומטר עם Wi-Fi</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NovocastraTM נוגדן חד שבטי לעכבר ליופיליזציה דיסטרופין (C-terminus)</td> <td>Leica biosystems</td><td>NCL-DYS2</td><td></td></tr><tr><td>NovocastraTM נוגדן חד שבטי עכבר ליופיליזציה ספקטרין</td><td>Leica biosystems</td><td>NCL-SPEC1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 3-8% Tris-Acetate ג'ל חלבון</td><td>Invitrogen</td><td>EA03785BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE נוגד חמצון</td><td>Invitrogen</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS מדגם מאגר</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE מדגם הפחתת חומר</td><td>Invitrogen</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-אצטט SDS מאגר ריצה</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>אוריול פלואורסצנטי ג'ל כתם</td><td>Bio-Rad</td><td>1610496</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין מיוצבת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Physcotron שימושי מיקרו-הומוגנייזר</td><td>MICROTEC</td><td>NS-310E3</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>זיהום פוליברן / מגיב טרנספקציה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת צביעת פרופידיום יודיד</td><td>BD Pharmingen</td><td>556463</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN OneStep ערכת RT-PCR</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy רקמות סיביות מיני ערכת</td><td>Qiagen</td><td>74704</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Nacalai</td><td>31606-75</td><td></td></tr><tr><td>מכונת העברה חצי יבשה</td><td>Bio Craft</td><td>41-1293</td><td></td></tr><tr><td>SYBR זהב חומצת גרעין ג'ל כתם</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td>עבור MultiNA</td></tr><tr><td>TAE Buffer</td><td>Nacalai</td><td>35430-61</td><td></td></tr><tr><td>Tragacanth Gum</td><td>Wako</td><td>200-02245</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA Buffer</td><td>Nippon Gene</td><td>316-90025</td><td>עבור MultiNA</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Nacalai</td><td>35907-15</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV ג'ל ומערכת ניקוי PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון exon דילוג יעילות בדגימות החולה dmd בניסויים קליניים של אנטיסנס אוליגונוקליאוטידים

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

ניוון שרירים דושן (DMD) היא מחלת שריר ניוונית הגורמים לאובדן הדרגתי של מסת שריר, המוביל למוות בטרם עת. המוטציות גורמות לעתים קרובות למסגרת קריאה מעוותת ולפגן בקוביות עצירה מוקדמות, וכתוצאה מכך חוסר כמעט מוחלט בחלבון דיסטרופין. ניתן לתקן את מסגרת הקריאה באמצעות אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (AONs) הגורם לאקסון דילוג. morpholino AON viltolarsen (שם קוד: NS-065/NCNP-01) הוצג כדי לגרום exon 53 דילוג, שחזור מסגרת הקריאה עבור חולים עם exon 52 מחיקות. לאחרונה נתנו NS-065/NCNP-01 דרך וירדות לחולים DMD ב חוקר ביוזמת חוקר, ניסוי ראשון בבני אדם של NS-065/NCNP-01. במאמר שיטות זה, אנו מציגים את האפיון המולקולרי של ביטוי דיסטרופין באמצעות רצף סנגר, RT-PCR, וכתמים מערביים בניסוי הקליני. האפיון של ביטוי דיסטרופין היה בסיסי במחקר להצגת היעילות מאז לא בוצעו בדיקות תוצאה פונקציונלית.

כדי להשתמש ב- RT-PCR כדי לזהות דילוג על exon, פריימרים משני צדי האקסון שידלגו עליהם תוכננו והוערכו כדי להניב להקות ספציפיות בלבד (ראה איור 2 עבור דיאגרמה סכמטית של דילוג אקסון ומיקום פריימר). פריימרים צריך ליצור מוצרים שניתן להבחין בקלות לפי גודל על מערכת MCE או אלקטרופורזה ג'ל agarose נורמלי אם MCE אינו זמין. איור 3מראה מערכת MCE תמונות ג'ל של תגובות RT-PCR ואת תוצאות ה רצף של הלהקה דילג מחולים NS-03 ו NS-07 לפני ואחרי טיפול עם NS-065/NCNP-01 בניסוי שלב 1 של הסלמה במינון. מחיקות נמל NS-03 ו-NS-07 המשתרעות על פני 45-52 ו-48-52, בהתאמה. NS-03 קיבל 5 מ"ג/ק"ג ו-NS-07 20 מ"ג/ק"ג של NS-065/NCNP-01 שבועי במשך 12 שבועות. כצפוי לפני הטיפול, שני החולים לא הראו דילוגים, ורק להקה שלא דילגה עליה ניתן היה לדמיין. לאחר 12 שבועות של טיפול, להקה נמוכה מדלג ברור היה לדמיין עבור NS-07. עם זאת, זה עדיין היה קשה לזהות כל מוצר מדלג עבור חולה NS-03. תוצאות ההתלתה הראו שרשור של exons 47 ו-54 עבור NS-07, כמו גם exons 44 ו-54 עבור NS-03. על פי הרצף, אלה יכולים תיאורטית לייצר איזופורם דיסטרופין פונקציונלי אך מקוצר. כדי לחשב את אחוזי דילוג המוצג באיון 3b, ריכוז החתרנות הטוחנת עבור הלהקה שמדלגת חולקה על-ידי הרצועה שמדלגים עליה ובטלה דילגה עליה. עבור חולה NS-07, האחוז לאחר הטיפול היה 72%, וזה היה 3.4% עבור NS-03. נתוני כתם מערבי (בשלושה רישיות) מחולים NS-03, NS-07, ושליטה בריאה מוצגים איור 4a. כצפוי, לא זוהתה להקת דיסטרופין לפני הטיפול. לאחר הטיפול להקה ממטופל NS-07 זוהתה עם משקל מולקולרי נמוך יותר בהשוואה לבקרה בריאה (דיסטרופין סוג פראי יש משקל מולקולרי של 427 kDa, ו NS-07 dystrophin יש משקל מולקולרי של 389 kDa). בגלל המחיקה exon ודילוג, isoform דיסטרופין ממטופל NS-07 חסר כמה exons, וזה היה צפוי להיות משקל מולקולרי נמוך יותר. חולה NS-03 הראה שום רמות לגילוי של דיסטרופין לאחר הטיפול. באות 4b, כמות הdystrophin לעומת שליטה בריאה עבור חולה NS-07 מוצג. המיקום שבו נמדדו עוצמת האות לחישוב של שחזור דיסטרופין מצוינים עם ריבועים כחולים. יחס ספקטרין דיסטרופין שימש לחישוב כמות ה דיסטרופין בהשוואה לזה של השליטה הבריאה. כך, האות מהדיסטרופין פחות רקע חולק על ידי הסכום של שני isoforms ספקטרין (ארוך וקצר) פחות רקע (ראה שלב 8.6.5). היחס לשליטה בריאה נקבע ל-100%. כמות ה dystrophin לעומת השליטה הבריאה בחולה NS-07 לאחר הטיפול היה 9.1%. עם זאת, לא ניתן היה לחשב את האחוז עבור חולה NS-03 בשל להקה דיסטרופין חלשה, אשר דומה לאלה שהושגו עבור דגימות טיפול קודמות עבור שני החולים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig1.jpg"> איור 1: דיאגרמה סכמטית של מחסנית ההעברה עבור ניתוח כתם מערבי. הרכבה של מחסנית העברת כתם המערבי עם נייר סופג ספוג במאגר כתמים A בתחתית ואחריו נייר סופג ספוג מאגר סופג B, קרום PVDF, 3-8% Tris-אצטט ג'ל ועל גבי 2 ניירות סופגים ספוגים ב- C סופג סופג מוצג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig2.jpg"> איור 2: ציור סכמטי של אקסון דילוג של exon 53 בחולה עם מחיקה exon 45-52 בגן DMD. לדוגמה, חולה NS-03 בניסוי הקליני להסלמה במינון היה מחיקה זו. אם אקסון 53 יישמר, ה-MRNA יהיה מחוץ למסגרת מאז צומת exon-exon בין exon 44 ו 53 משבש את מסגרת הקריאה, גורם עצירה קודון ב exon 53. מסגרת הקריאה משוחזרת כאשר מדלגים על exon 53, ומופקת איזופורם קצר יותר של דיסטרופין. כדי לזהות exon 53-דילוג על-ידי RT-PCR, פריימרים ב exon 44 ו 54 משמשים כך PCR-מוצר בין מדלג ו- mRNA לא מדלג יכול בקלות להתגלות. FWD: פריימר קדימה, REV: פריימר הפוך, PMO: פוספורודיאמידט מורפולינו אוליגומר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig3.jpg"> איור 3: דילוג על יעילות עבור חולים NS-03 ו NS-07 מדגימות ביופסיה שריר קדמי השוקיאלי. a) תמונת ג'ל שנוצרה על ידי מערכת אלקטרופורזה A של דגימות RT-PCR של דגימות לא מטופלות ומטופלות מחולים NS-03 ו-NS-07. הלוח העליון מציג את NS-03 ואת הלוח התחתון NS-07 בשלושה רישיות. עבור NS-03, הלהקה שלא מדלגים עליה היא 422 bp, והלהקה מדלגת היא 212 bp. עבור NS-07, הלהקות הן 836 bp ו 624 bp, בהתאמה. ניתוח רצף הראה שרשור של exon 44 ו exon 54 עבור NS-03 ואקסון 47 כדי exon 54 עבור NS-07. ב)דילוג על יעילות לפני ואחרי הטיפול מוצג עבור חולים NS-03 ו NS-07, מחושב מתוך ריכוז הטוחנתן של שתי הלהקות המסופקות על ידי מערכת A כמו להקה מדלג / (מדלג הלהקה + הלהקה לא דילג) x 100. יעילות דילוג עבור NS-03 היה נמוך מאוד לאחר הטיפול; עבור NS-07, יעילות דילוג היה מעל 70%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60672/60672fig4.jpg"> איור 4: כימות חלבון של isoforms דיסטרופין לפני ואחרי exon דילוג על טיפול. a) כימות חלבון של isoforms דיסטרופין לפני ואחרי exon דילוג על טיפול. כתם מערבי של ביופסיה שרירים מן השוקיאליים הקדמי מחולים NS-03 ו NS-07 לפני ואחרי הטיפול ומשליטה בריאה בשלושה אנשים. Dystrophin ניתן לראות ב 427 kDa עבור שליטה בריאה ב 389 kDa עבור NS-07 לאחר הטיפול. לא ניתן היה לזהות דיסטרופין עבור אף אחד מהמטופלים לפני הטיפול, או שלא ניתן היה לזהות אף אחד מהם לאחר טיפול בחולה NS-03. האזור בקופסה השחורה מוצג באות 4b. משמאל בכל כתם מוצג הסמן. ב)כמות ההתרררות ששוחזרה לאחר הטיפול בחולה NS-07. שחזור Dystrophin חושב בהתבסס על העוצמות של הלהקות עבור דיסטרופין, רקע, ואת isoform ארוך וקצר של ספקטרין על פי הנוסחה: (dystrophin - רקע)/(ספקטרין L -רקע) + (ספקטרין S - רקע) שבו היחס לבקרה בריאה מוגדר ל 100%. העוצמה של כל להקה נמדדה בתוך הקופסאות הכחולות המוצגות בדמות. שיקום ה דיסטרופין עבור NS-07 היה 9.1% לאחר הטיפול. אות ה דיסטרופין היה חלש מדי מכדי למדוד את הדגימות הלא מטופלות. גדלי מרקר מוצגים בקילו-דלטון. Dys: Dystrophin, BG: רקע, SL: ספקטרין ארוך isoform, SS: ספקטרין קצר isoform, שלי: מיויסין סוג 1. גדלי מרקר מוצגים בקילו-דלטון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60672/60672fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פתרון (פתרון</td>
			<td>נפח / תגובה (μl)</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>מים ללא תחנה (מסופקים)</td>
			<td>משתנה (משתנה</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>5X QIAGEN OneStep RT-PCR מאגר</td>
			<td>5.0</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix (המכיל 10 מיליון מ"מ של כל dNTP)</td>
			<td>1.0</td>
			<td>400 μM של כל dNTP</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר קדמי (10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.6 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר הפוך (10 μM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>0.6 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>QIAGEN צעד אחד RT-PCR אנזים לערבב</td>
			<td>1.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>מעכב RNase (אופציונלי)</td>
			<td>משתנה (משתנה</td>
			<td>5-10 יחידות/תגובה</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNA של תבנית</td>
			<td>50 ng</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>סה"כ</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: ריאגנטים RT-PCR. התרכובות הדרושות לתגובה אחת של RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פריימר (פרימר)</td>
			<td>רצף (20</td>
		</tr>
<tr>
<td>ת"א 44 00:00</td>
			<td>1.75 ק"מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>ת"א 35</td>
			<td>17.5.05, 1.75 מ', 3, 000 00:00:00,000 --&amp;10:00,00</td>
		</tr>
<tr>
<td>48 אף 00:00:</td>
			<td>1.75 מ', ג'ורג'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54/55R</td>
			<td>5'-TCTCTCTCACTCACCCTT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>54R (100)</td>
			<td>5'-GTGGACTTTCTACTACTCAT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: רשימת פריימר. רצפים עבור פריימרים המשמשים במחקר זה. פ: קדימה, ר: הפוך.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מחזור אחד</td>
			<td>שעתוק הפוך</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>50°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>מחזור אחד</td>
			<td>שלב הפעלה ראשוני של PCR</td>
			<td>15 דקות</td>
			<td>100°C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">35 מחזורים</td>
			<td>פירוק (פירוק)</td>
			<td>1 דקות</td>
			<td>94 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>אנאלית (119)</td>
			<td>1 דקות</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>השלוחה (השל</td>
			<td>1 דקות</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>מחזור אחד</td>
			<td>הארכה סופית</td>
			<td>7 דקות</td>
			<td>72 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>המתן</td>
			<td></td>
			<td>∞</td>
			<td>4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: PCR מותן בשימוש. הצג תנאי PCR עבור תגובת RT-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פתרון (פתרון</td>
			<td>נפח / תגובה (μl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>מים ללא תחבולות</td>
			<td>משתנה (משתנה</td>
		</tr>
<tr>
<td>BigDye שליחות קטלנית 3.1 תגובה מוכנה לערבב</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר קדמי/פריימר הפוך (3.2 μM)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNA של תבנית</td>
			<td>20 ng</td>
		</tr>
<tr>
<td>סה"כ</td>
			<td>20</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 4: ריאגנטים הנחוצים לתגובת ההתפתלה. השתמש בפרימר קדימה או הפוך בהתקנה, לא בשניהם בו-זמנית.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מחזור אחד</td>
			<td>1 דקות</td>
			<td>96 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">25 מחזורים</td>
			<td>10 שניות</td>
			<td>96 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 שניות</td>
			<td>50°C</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 דקות</td>
			<td>60 °C</td>
		</tr>
<tr>
<td>המתן</td>
			<td>∞</td>
			<td>4°C</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 5: תנאי PCR עבור רצף סנגר.

כאן, אנו מציגים את האפיון המולקולרי של ביטוי דיסטרופין 38 באמצעות רצף סנגר, RT-PCR, וכתמים מערביים בניסוי הקליני.

אפיון Exon דילוג יעילות בדגימות החולה DMD בניסויים קליניים של אנטיסנס אוליגונוקליאוטידים

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה מתוקנת להכנת וטיפול ברקמת השריר בהגדרות פרה-קליניות ובניסויים קליניים, החשובה להשגת תוצאות אמינות בתחום ה-DMD. הטכניקות רלוונטיות עבור exon דילוג על נסיונות עבור DMD. והיתרון העיקרי הוא כי, הם מבוססים היטב לשחזור אם מתבצע באופן קולקטיבי.טכניקות אלה מתמקדות בעיקר דילוג exon ב DMD, אבל עם שינוי של פריימרים, אותן טכניקות ניתן ליישם על מחלות אחרות שטופלו עם טיפולים splicing. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להשיג אקסון דילוג יעילות הן RNA וחלבון. כדי להכין מדגם לניתוח, ראשית לערבב כמויות שוות של מסטיק tragacanth ומים עד החניכיים הופך רך ודביק.טוענים תערובת זו לתוך 25 מזרקים מיליליטר ולוותר 0.5 עד סנטימטר אחד של מסטיק על דיסקי פקק בודדים. סמן את הדיסקים בצד הנגדי והצב מיכל איזופנטאן בחנקן נוזלי עד שחלק מהנוזל קופא. מניחים כל דגימה לתוך מסטיק tragacanth על הדיסקים עם ציר אורך של כל שריר בניצב לפקק.מניחים מסטיק סביב לתחתית של כל שריר כדי לעזור להחזיק את השריר במקום, ולהשתמש פינצטה להקפיא את הדגימות isopentane קר. מזיזים את הדגימות ברציפות למשך דקה אחת או עד להקפאה מוחלטת לפני הנחתן באופן זמני על קרח יבש. לאחר מכן, מניחים את הדגימות בבקבוקוני זכוכית לאחסון של 80 מעלות צלזיוס.כדי לקטע את רקמת השריר הקפואה לניתוח, הגדר קריוסטט לטמפרטורת עבודה של 25 מעלות צלזיוס, ולהעלות את בלוק השריר על המחזיק. לקצץ את בלוק הרקמה עד חלקים שטוחים מושגים. לקבלת PCR תעתיק הפוך וניתוח כתם מערבי, לקבל 10 פרוסות מיקרומטר עבה.לניתוח אימונוהיסטוכימי, השג שש עד שמונה פרוסות בעובי מיקרומטר, ולכתמת המטוקסילין ואאוסין, השג פרוסות בעובי 10 עד 12 מיקרומטר. לאחר הרכישה שלהם, למקם את החלקים פרוסים בשני צינורות מיליליטר. אחסן את הדגימות עבור PCR ורוקט מערבי ב 80 מעלות צלזיוס.כאן, מערכת אלקטרופורזה שבב, תמונות ג'ל של תגובות PCR תעתיק הפוך, ואת תוצאות רצף של הלהקה דילוג משני חולים לפני ואחרי הטיפול עם oligonucleotide antisense בניסוי שלב הסלמה מנה אחת מוצגים. שני המטופלים מטפחים מחיקות. כצפוי, לפני הטיפול, שני המטופלים לא הראו דילוג ורק להקה שלא דילגה יכולה להיות חזותית.לאחר 12 שבועות של טיפול, רצועה תחתונה ברורה דילגה היה חזותי עבור המטופל השני, עם זאת, זה עדיין היה קשה לזהות כל מוצר דילוג עבור המטופל הראשון. תוצאות רצף הראו שרשור של exons 47 ו 54 עבור החולה השני, ו exons, 44 ו 54 עבור החולה הראשון. כדי לחשב את אחוז הדילוגים, הריכוז הטוחן של הרצועה שדילגת עליה חולק על-ידי הרצועות שהמערכת דילגה עליהן והתהפך.כצפוי, לא זוהתה להקת דיסטרופין על ידי כתם מערבי לפני הטיפול. לאחר הטיפול זוהתה רצועה מהחולה השני עם משקל מולקולרי נמוך יותר בהשוואה לזה שנצפה בשליטה הבריאה. החולה הראשון, לעומת זאת, לא הראה רמות ניתנות לגילוי של דיסטרופין לאחר הטיפול.זה קריטי כדי לטפל ברקמת השריר כראוי, ולה מניח כל דגימה על מסטיק tragacanth באופן עקבי. ניתן לנתח את מקטעי הרקמה במספר דרכים שונות, כולל PCR מלאכותי, PCR דיגיטלי, כתם מערבי, אימונוהיסטוכימיה, ועם סוגים שונים של omics. טכניקות אלה ניתן להאיץ, הפיתוח, exon נוסף דילוג תרופות מיקוד exons שונים, והוא יכול להיות מיושם על הפיתוח של ויראלי מבוסס ושוב בעריכה עבור DMD.

characterizing-exon-skipping-efficiency-dmd-patient-samples-clinical

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

דילוג על אקסונים הוא כרגע אופציה טיפולית מבטיחה ביותר בניוון שרירים דושן (DMD). כדי להרחיב את תחולת לחולים DMD וכדי לייעל את יציבות / פונקציה של חלבונים בדיסטרופין מקוצץ וכתוצאה מכך, גישה-אקסון רב דילוג באמצעות מולקולות אנטיסנס קוקטייל פותחה הראינו הצלה בדיסטרופין מערכתית במודל הכלב.

Multi-אקסון דילוג שימוש אנטיסנס קוקטייל של ניוון השרירים הצמוד X לכלבים

כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

Oligonucleotides antisense שונים (AONs) הוכחו לגרום אקסון הכללה (splice אפנון) והצלה SMN ביטוי עבור ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA). כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור און lipotransfection לזירוז אקסון להיכלל הגן SMN2 ואת שיטות ההערכה כדי לקבוע את יעילות fibroblasts חולה SMA.

הערכה של הכללה אקסון שנגזרות אחוי Oligonucleotides Antisense מיתוג ב SMA החולה Fibroblasts

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור מודל יעיל של שריר ניוון שרירים Duchenne באמצעות MYOD1-המרה בתאי השתן כדי להעריך את השיקום של mrna הדיסטרופין ואת רמות החלבון לאחר דילוג קפיצה.

Exon דילוג ישירות מיותצינורות שהתקבלו מתאי שתן אנושיים

פרוטוקול זה מתאר את ההמרה של פיברובלסטים בעור לתוך myoblasts ואת הבידול שלהם myotubes. קווי התאים נגזרים מחולים עם הפרעות נוירומוסקולריות וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מנגנונים פתולוגיים ולבדוק אסטרטגיות טיפוליות.

תכנות ישיר של פיברובלסטים אנושיים למיובלסטים כדי לחקור טיפולים להפרעות נוירומוסקולריות

שחבור חלופי (AS) ופוליאדנילציה חלופית (APA) מרחיבים את מגוון האיזופורמים של שעתוק ותוצרים. כאן אנו מתארים פרוטוקולים ביואינפורמטיים לניתוח מבחני RNA-seq בתפזורת ו-3' של ריצוף קצה כדי לזהות ולהמחיש AS ו-APA המשתנים בין תנאי ניסוי.

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית minigene כדי לפקח על ההשפעה של מוטציות באתר 5-splice באתר על חיבור ומפתח מדכא U1 snRNA להצלת עיכוב חיבור המושרה מוטציה. הכתב והמדכא U1 snRNA מבנים באים לידי ביטוי בתאי HeLa, ו splicing מנותח על ידי הרחבת פריימר או RT-PCR.

בדיקה סלולרית מבוססת כתב לניטור יעילות חיבור

מאמר זה מפרט כיצד Elvax 40W יכול לשמש כשיטת שחרור איטי לאספקת סמים לרשתית החולדה הבוגרת. הפרוטוקול להכנה, טעינה, ומספקים מורכב סמים שרף לעין מתואר.

משלוח שחרור איטי תרופות דרך Elvax 40W לרשתית העכברוש: ​​השלכות לטיפול במצבים כרוניים

העדיפות הנוכחית בהקרנות לסרטן השד היא להפחית מינוני לב מבלי להתפשר על כיסוי רקמת מטרה. טכניקת הנשימה להחזיק מרצון שתוארה כאן היא פתרון פשוט וזול לבעיה זו ומסוגלת להיות הנהיג נרחב ללא הצורך בציוד מיוחד.

טכניקת הנשימה להחזיק מרצון לצמצום לב מנה ברדיותרפית שד שמאלי

שיטה זו פותחה במטרה לספק פתרון תרופתי קבוע באמצעות העורק הראשי, כדי להעריך את הפרמקוקינטיקה של תרופות חדשניות במודלים של עכברים.

חליטות עורק הראשי לpharmacokinetic וpharmacodynamic ניתוח של taxanes בעכברים

למדו פרוטוקול סטנדרטי להכנת רקמת שריר עבור ניסויים קליניים ב-DMD באמצעות טכניקות דילוג אקסונים. שיטות אלו מאפשרות זיהוי דיסטרופין וניתוח יעילות הטיפול בחולים.

אפיון Exon דילוג יעילות בדגימות החולה DMD בניסויים קליניים של אנטיסנס אוליגונוקליאוטידים

גלה סרטונים נוספים