גילוי של מינים החמצן תגובתי כוללת בתאי חסיד על ידי 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון di, מכתים
23 ביוני 2020
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות סה כ חמצן הסלולר מינים (ROS) באמצעות 2 ', 7 '-diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFH-DA). שיטה זו יכולה להמחיש לוקליזציה של רוס הסלולר בתאי חסיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית ועוצמה ROS מכמת עם קורא צלחת הקרינה. פרוטוקול זה הוא פשוט, יעיל וחסכוני.
שיטה זו יכולה לשמש לניתוח מיני חמצן תגובתי תאי בתאים חסידיים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בלבד, ולכומת את עוצמת מיני החמצן תגובתי עם קורא לוחיות פלואורסצנטיות. פרוטוקול זה פשוט, יעיל וחסכוני. התחל על ידי זריעה פעמיים 10 לתאי סרטן המעי הגס HCT116 החמישי ב- DMEM לתוך כל באר של צלחת 24 באר.
דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרת, החלף את מדיום התרבות ב-100 מיקרומולאר ברזלי גופרתי, או 10 מדיום המכיל טוקסורוביצין מיקרומולארי, ודגירה של הצלחת למשך 24 שעות נוספות. הכן את פתרון DCFH-DA על-ידי המסת 4.85 מיליגרם של DCFH-DA במיליליטר אחד של DMSO כדי ליצור פתרון מלאי של 10 מילימולרים.
ממש לפני הוספתו ל בארות, לדלל את המניה עם DMEM מחומם מראש כדי להפוך פתרון עבודה 10 micromolar, ו מערבולת זה במשך 10 שניות. כדי להכתים את התאים, להסיר את המדיום המכיל סמים, ולשטוף אותם פעם אחת עם DMEM. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של פתרון עבודה DCFH-DA לתוך כל באר, ו דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
לאחר הדגירה, להסיר את DCFH-DA מן בארות, ולשטוף אותם פעמיים עם DMEM, ופעם אחת עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של PBS לכל באר. השתמש בתעלת החלבון הפלואורסצנטי הירוק במיקרוסקופ הפלואורסצנטי כדי לצלם תמונות מייצגות של התאים.
לאחר מכן הסר את PBS, ולהוסיף 200 microliters של מאגר בדיקה radioimmunoprecipitation לכל באר. דגירה את הצלחת על קרח במשך חמש דקות, ולאסוף את lysates התא לתוך 1.5 צינורות מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות ב 21, 130 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
ואז להעביר 100 microliters של supernatant לצלחת שחורה 96 באר. השתמש בקורא מיקרופלסטיק באורך גל של 485 ננומטר, ואורך גל פליטה של 530 ננומטר, כדי למדוד את הפלואורסצנטיות בכל באר. לאחר מכן, למדוד את ריכוז החלבון עם בדיקה ברדפורד על ידי העברת microliter אחד של supernatant לצלחת ברורה 96 גם עם 100 microliters של פתרון בדיקה חלבון.
השתמש בריכוזי החלבון כדי לנרמל את התעצמות הפלואורסצנטיות. HCT116 תאים סרטניים המעי הגס טופלו עם 100 מיקרומולאר ברזלי סולפט, או 10 דוקסורוביצין מיקרומולרי, כדי לגרום ללחץ חמצוני. כצפוי, פלואורסצנטיות ירוקה הוגדלה באופן דרמטי על ידי שני הטיפולים.
כדי לכמת את השינויים בעוצמה היחסית, התאים היו lysed ו מנורמל עם ריכוזי חלבון. עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית הוגדלה באופן משמעותי על ידי ברזלי סולפט או טוקסורוביצין. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להפוך את פתרון DCFH-DA טרי ולהימנע מחשיפה לאור, כמו גם למזער את ההפרעה למצב התא, ולבצע שטיפה נרחבת של PBS ממש לפני צילום תמונה.
בנוסף לגילוי של ROS הכולל על ידי פרוטוקול זה, במיוחד ROS כגון חמצן יכול להתבצע.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי מיני חמצן רבטיביים (ROS) תאיים כוללים באמצעות DCFH-DA. השיטה מאפשרת ויזואליזציה של מיקום ה-ROS בתאים נצמדים וכימות של עוצמת ה-ROS.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה תאית
- ניתוח מיני חמצן רעילים (ROS)
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- מינויי חמצן ריאקטיביים ממלאים תפקיד קריטי באיתות תאי.
- הבנת הלוקליזציה של ROS יכולה לספק תובנות לגבי תהליכים תאיים.
- טכניקות פלואורסצנציה משמשות באופן נפוץ לזיהוי ROS.
- פרוטוקול זה תוכנן למען קלות שימוש וכדאיות כלכלית.
מטרת המחקר
- מתן שיטה מהימנה לגילוי ROS בתאים נצמדים.
- מתן אפשרות להדמיה וכמותיות של ROS באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- פישוט התהליך עבור חוקרים בתחום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זריעת תאי סרטן מעי גס HCT116 בלוחית בעלת 24 בארות.
- דגירה של התאים עם ferrous sulfate או doxorubicin.
- הכנת תמיסת DCFH-DA לזיהוי ROS.
- שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובקורא לוחות לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של מיקום ה-ROS בתאים.
- כימות של עוצמת ה-ROS הדגים את יעילות השיטה.
- הפרוטוקול הוכח כפשוט ויעיל עבור חוקרים.
- גישה חסכונית לניתוח ROS במחקרים תאיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה פשוטה לזיהוי ROS.
- ניתן ליישמו על סוגים שונים של תאים נצמדים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו כדי להגיע לתובנות עמוקות יותר לגבי מנגנונים תאיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גילוי כמותי של סך מיני החמצן הר एप्पטיביים (ROS) בתאים דבקים באמצעות צביעת DCFH-DA מספק מדד סטנדרטי לעקה חמצונית, גורם מרכזי במידול מחלות ובמחקרים של תגובה לתרופות. שיטה זו מאפשרת הערכה חסונה של מצב החמצון-חיזור התאי בעקבות הפרעות כימיות או גנטיות, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מנגנוניים ובתיקוף מטרות בשלבי גילוי מוקדמים. יעילותה כלכלית ויכולת ההרחבה שלה הופכות אותה למתאימה לשילוב בסריקות בסבב גבוה (high-throughput screening) ובתהליכי עבודה תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה כמותית של מסלולי עקה חמצונית במודלים תאיים רלוונטיים למחלה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות המווסתות את מאזן החמצון-חיזור התאי.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור התערבויות תרופתיות או גנטיות לפלט של ROS.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק בדיקה הניתנת לשחזור, המבוססת על פלואורסצנציה, לכימות ROS בתאים דבקים.
- תומך בסטנדרטיזציה ונורמליזציה של הבדיקה באמצעות מדידות של ריכוז חלבון.
- מאפשר הערכה מהימנה של עקה חמצונית המושרית על ידי תרכובות לצורכי מסכי סקר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מבצע התאמה בין מדדי סטרס חמצוני לבין מודלים של מחלות לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- תומך ברציפות משלב הגילוי במערכות in vitro ועד לתיקוף פרה-קליני של חומרים מווסתים של רדוקס.
- מספק ערך ניבוי לבטיחות ויעילות של תרכובות הקשורות למנגנונים חמצוניים.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול זה לגילוי ROS המבוסס על DCFH-DA משתלב ברצף שבין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי המולקולות המובילות, ומספק קריאה כמותית של ויסות עקה חמצונית במערכות תאיות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות של מטרות ומסלולים הקשורים לרדוקס.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות וסטנדרטיות של ROS לצורך מיון תרכובות.
- אנליטיקה: משלבת נורמליזציה של עוצמת פלואורסצנציה להשוואה איתנה של נתונים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי סטרס חמצוני in vitro לתיקוף במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע בדיקה יעילה מבחינת עלויות ובעלת יישום רחב לסוגי תאים והתערבויות מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בביולוגיה של חמצון-חיזור (redox) ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מייעל את הכימות של ROS באמצעות תהליכי עבודה ניתנים לשכפול ולהרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי קישור התערבויות לתוצאות של עקה חמצונית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של נכסים מווסתים של חמצון-חיזור.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובתפעול קורא לוחות (plate reader).
- נדרשת גישה לתשתית סטנדרטית לתרביות תאים ולכימות חלבונים.
- נדרש טיפול זהיר בריאגנט DCFH-DA כדי למנוע פירוק הנגרם מחשיפה לאור.
- סטנדרטיזציה של שלבי השטיפה והנורמליזציה היא קריטית לצורך הדירות (reproducibility).
- הפרוטוקול ניתן להתאמה לקווי תאים נצמדים שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור מודלים ספציפיים.
