פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

פרוטוקול זה מאפשר הקלטה של קשר תגובת ריכוז תפקודי מלא של אגוניסט GPCR מאוכלוסיית תא אחד ומספק אפיון ייסורים מפורט אפילו עבור מספרי דגימה של תאים נמוכים. היתרון העיקרי של מנון סדרתי הוא העלייה בתפוקה שכן באר אחת מספיקה לניתוח תגובת ריכוז מלא. טכניקה זו מתאימה היטב לחקר התברואה יחידה במודלים ביולוגיים נדירים ומורכבים, כמו פורמטים של איברים על שבב במיכלים מיקרופלואידיים סגורים.

הפרוטוקול אינו קשה לביצוע, בתנאי שהציוד המתאים זמין. הכנת פתרונות הליגנד השונים של GPCR בריכוז הנכון היא המפתח להצלחה. מייקל סקיבה, סטודנט לתואר שני, ואן מילדנר, סטודנטית לתואר ראשון, מהמעבדה שלנו ידגימו את ההליך.

עבור זריעת תאים על מערכי האלקטרודה, הוסף את הריכוז המתאים של תאים ל הבארות של כל מערך אלקטרודה, ולאפשר לתאים להתיישב הומוגנית על תחתיות הבאר במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר לפחות 36 שעות באינקובטור סטנדרטי לתרבות תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני, בדקו את שכבות התא לפי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי להבטיח כיסוי מלא של כל אלקטרודה עם תאים. לאחר מכן החליפו את מדיום תרבות התאים בכל באר בנפח המתאים של מדיום מחומם מראש, נטול סרום.

כדי להתחיל הקלטת מבוי סולדנס, מקם את מערך האלקטרודה במחזיק המערך המחבר של מנתח ההימנעות, ואשר מגע תקין של מבוי סולדנס נמוך בין האלקטרודות לבין מנתח ההימנעות. בחר את סוג האלקטרודה ו/או תבנית מרובת בארות בממשק המשתמש של התוכנה. אם מצבי רכישת נתונים בתדר יחיד ותדירות מרובה זמינים ומספר בארות שיש לנתח נמוך או שרזולוציית הזמן אינה קריטית, בחר הקלטות תדרים מרובים.

כדי להבטיח רזולוציית זמן מרבית, בחר תדר ניטור יחיד. לאחר מכן התחל ברכישת נתוני קורס הזמן ובחר את תיקיית הנתונים עבור היכן לשמור את הנתונים. קריאות בלתי מוגבלות יירשמו במספר התדרים שצוין עבור כל באר כדי ליזום את פרוטוקול התוספת הטורית במצב אגוניסט עבור מערך שמונה בארות, להוסיף 30 microliters של הריכוז הנמוך ביותר של אגוניסט של עניין לתאים.

לאחר מכן תן לתאים להגיב ולהצייד לתקופה מוגדרת מראש של זמן לפני הוספת 30 microliters של הריכוז הגבוה הבא עד כל דילול סדרתי של אגוניסט נוסף. כדי לנתח את הנתונים, הפחת את ההפחתה של נקודת הנתונים האחרונה לפני התוספת הראשונה של פתרון אגוניסט והגדר את הזמן של אפס חיבור כדי לנרמל את ערכי ההפחתה. להתוות את מהלך הזמן של מכשול מנורמל, ולתכנן את קורסי הזמן האישיים כדי לזהות את מקסימום ב מכשול לאחר כל צעד נוסף.

חבר גליון נתונים עם ערכים אלה והתווה את הערכים של שינוי מבוי סביל מרבי כפונקציה של הריכוז היוניסטי. לאחר מכן השתמשו בשגרה של התאמת נתונים כדי לקבוע את הריכוזים היעילים החצי-מקסימליים ואת התגובה המרבית באמצעות המודל הלוגיסטי בן ארבעת הפרמטרים. בניסוי מייצג זה נוספו לתאים 10 פתרונות עם הגדלת ריכוזי היסטמין ברצף כל 15 דקות, והשינוי בהיכל נמדד בכל נקודת זמן.

לאחר מכן ניתן היה לתוות את שינויי ההיסדנס כפונקציה של ריכוז היסטמין ואת פונקציית ההעברה של מודל לוגיסטי בן ארבעה פרמטרים המותאם לנקודות הנתונים הניסיוניות משבע בארות. כדי להסביר את הפחתת קולטן היסטמין אפשרי, רגישות התא, או overstimulation, טווח הנתונים לניתוח ניתן להפחית, כפי שמוצג עבור ניסוי מינון סדרתי יחיד זה. לאחר מכן ניתן להחיל אופטימיזציה של שלושה פרמטרים על הנתונים, מתן ריכוז יעיל חצי מקסימלי של 0.75 פלוס או מינוס 0.12 מיקרומולר לניתוח זה.

התוספת של דיפנהידרמין אנטגוניסט קולטן היסטמין 20 דקות לפני ההיסטמין הראשון תוצאות עלייה מאוחרת של עכבה בתוך ערכת מינון סדרתי, בהתאם לצורך אגוניסט גבוה יותר כדי להפוך תגובה התא. ביחסי תגובת המינון, ההשפעה של היריב באה לידי ביטוי כתזוזה ימינה של העקומות, המתאימה לעלייה בריכוז היעיל החצי מקסימלי, בתנאי שהאנטגוניסט הוא ליגנד תחרותי ביחס לאגוניסט. יישום מוצלח של ערכת מנון סדרתי הוא קל מבחינה טכנית אבל דורש תכנון מתחשב, כפי שהוא מאתגר לבצע את כל השלבים עם העיתוי הנכון.

מינוי סדרתי סלל את הדרך לביצוע מחקרי תגובת ריכוז עם מערכות קריאה אחרות המוגבלות ביחס למספר הדגימות המנוטרות במקביל. היתרונות הספציפיים של מינוי סדרתי מאפשרים את המחקר של משכן אותות מתווך קולטן עם readouts חדשים לחלוטין רגישים לשינויים פנוטיפיים אחרים, כמו ציטומכניקה. נא ללבוש כפפות ומנועים בעת הכנת פתרונות המלאי של אגוניסט הקולטן, כפי שהם עלולים להיות מסוכנים כאשר בשאיפה או בלע.