קוונפיקציה של מתכת Leaching ב קיבוע מתכת זיקה כרומטוגרפיה
17 בינואר 2020
אנו מציגים שיטת כימות קלה של מתכות הציגו דגימות שהוכנו באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה מתכת ללא קיבוע. השיטה משתמשת הידרוקסילנול כחול מחוון הצבע מתכת וספקטרוסקופיה UV-Vis כמו הגלאי.
השיטה שלנו היא משמעותית, כפי שהוא מאפשר הביוכימאי הממוצע במהירות לקבוע אם דגימות מבודדות באמצעות כרומטוגרפיה זיקה מתכת משותק מזוהמים עם מתכות מעבר. היתרון העיקרי הוא הקלות שבה ניתן לבצע את ההתנצלות. ההתמדה משתמשת מכשור וטכניקות משותפות לרוב מעבדות הביוכימיה, וזה יכול להיות מיושם בקלות ובמהירות.
בעוד במאמר זה אנו מיישמים שיטה זו עבור דגימות מבודדות עם עמודת ניקל-NTA, השיטה יכולה לשמש עם כל שרפין זיקה מתכת אחר. משתמשים בפעם הראשונה צריך לנסות שיטה זו עם פתרון מלאי ניקל של ריכוז ידוע. פעולה זו תכיר להם את זרימת העבודה, הצבעים לדוגמה וההיפנים המוצגים בשינויים ספקטרליים.
הדגימה של ההליך תהיה קול סוויין, טכנאי מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הפעל וחימום ספקטרופוטומטר UV-Vis. לקבוע את שברי הכרומטוגרפיה להיות assayed באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis מערך דיודה עם ספיגה אופטית ב 280 ננומטר לכמת את החלבון.
השג חיץ מדגם של 10 עד 100 מילימולרים עם PH בין 7 ל- 12, כגון טריס, HEPES, MOPS ומאגר פוספט. הכן 12% משקל לפי פתרון נפח של פיזור HNB במאגר מדגם באמצעות 120 מיליגרם של HNB reagent עבור כל מיליליטר של פתרון מלאי מוכן. הגדר את הספקטרופוטומטר לאיסוף נתונים ב-647 ננומטר.
השתמש בקובט קוורץ מלא במאגר הדגימה כדי לרוקן את הספקטרופוטומטר. הכן פתרון בקרה ב cuvette המכיל 50 microliters של מלאי HNB למיליליטר של נפח בדיקה הכולל. אפשר לפקד דגירה למשך שלוש דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
למדוד ולתזמן את הספיגה ב 647 ננומטר עבור מדגם הבקרה. הכינו את דגימות ההתזה על ידי ערבוב של 150 מיקרוליטרים של מלאי HNB עם 2850 מיקרוליטרים של שברי חלבון מדוללים כראוי עם מאגר הדגימה. אפשר לדגימה להדגור במשך שלוש דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
חזור על הקלטת הספקטרום כדי שכל שבר יימדד. במקרה שבו דילול לא מספיק מתקבל, הלהקה הספקטרלית כולה ב 647 ננומטר נעלם. בעוד עם דילול חזק מדי, המדגם אינו ניתן להתוות מהפקד.
כדי לקבוע את ריכוז המתכת בכל מדגם, מצא תחילה את ההבדל של כל ספיגת מדגם ב 647 ננומטרים מהבקרה HNB. לקבוע את ריכוז המתכת micromolar באמצעות הנוסחה שבה DF הוא גורם הדילול עבור שבר האשכים, דלתא A-B-S 647 הוא שינוי הספיגה ב 647 ננומטר, 3.65 פעמים 10 כדי שלילי 2 מייצג את מקדם ההכחדה של HNB, ואני הוא הנתיב האופטי של cuvette בסנטימטרים. במחקר זה, הספקטרום של HNB חינם ב PH ניטרלי בספקטרום מייצג של שברים שהושלאו עבור יון ניקל מהבידוד של MSP1E3D1 מוצגים כאן.
ירידה בספיגה ב-647 ננומטר בהשוואה לבקרת ה-HNB נצפתה, אשר התאים להיווצרות מתחמי HNB בנוכחות מתכת מעבר. כדי להדגים את היישום של הראי הזה, שני חלבוני פיגום קרום מתויג שלו, MSP1E3D1, MSP2N2, ורומן, שלושה heme, c-סוג ציטוכרום GSU0105, מ geobacter sulfurreducens, נותחו. תוכן החלבון וניקל יון של כל שבר עבור GSU0105 הועברו באופן משמעותי אחד מהשני, בעוד שברי MSP1E3D1 ו MSP2N2 שהכילו את החלבון ביותר היו גם את התוכן הניקל הגבוה ביותר.
זה גם מאויר כי תוכן המתכת לא יכול להיות מופץ באופן שווה בין שברים שנאספו באמצעות כרומטוגרפיה זיקה מתכת מגויסת. חשוב ביותר לערבב כראוי ובעקביות את הריק בכל הדגימות ולאפשר זמני דגירה שווים עבור הריק בכל הדגימות. שברי חלבון בעלי עניין מיוחד יכולים להיות מנותחים עוד יותר עם ספקטרומטריית ספיגה אטומית או ICPMS כדי לאשר זיהום מתכת ולבדוק יונים מתכת חלבון chelated או קשור בחוזקה.
מלבד זיהוי קשירת מתכות מעבר, טכניקה זו יכולה לשמש למדידת זיקה מחייבת ליוני מתכת מעבר לחלבונים. HNB וכל ניקל נוכח דגימות הם מגרים לעיניים ולעור בהתאמה. PPE סטנדרטי כולל כפפות והגנה על העיניים יש להשתמש במהלך השיטה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג בדיקה פשוטה לכימות מתכות בדגימות שהוכנו באמצעות כרומטוגרפיית ספיקציה של מתכת אימוביליזית (immobilized metal affinity chromatography). השיטה משתמשת ב-hydroxynaphthol blue כאינדיקטור קולורימטרי ומנצלת ספקטרופוטומטר UV-Vis לצורך הגילוי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- כימיה אנליטית
- כרומטוגרפיית זיקה למתכת
רקע
- זיהום של דגימות במתכות מעבר עלול להשפיע על תוצאות הניסוי.
- כרומטוגרפיית ספיקה של מתכת מקובעת (Immobilized metal affinity chromatography) היא טכניקה נפוצה בביוכימיה.
- שיטות קיימות לזיהוי זיהום במתכות עשויות להיות מורכבות או לדרוש ציוד ייעודי.
- קיים צורך בשיטה פשוטה ונגישה לצורך ניתוח שגרתי במעבדות ביוכימיה.
מטרת המחקר
- אספקת בדיקה פשוטה לזיהוי זיהום מתכת בדגימות.
- מתן אפשרות לביוכימיהים להעריך במהירות את טוהר הדגימה.
- פיסוח השימוש בציוד מעבדה נפוץ לצורך כימות מתכת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש ב-hydroxynaphthol blue כאינדיקטור קולורימטרי.
- יישום ספקטרופוטומטריית UV-Vis לצורך גילוי.
- בדיקה באמצעות עמודות nickel-NTA ושרפים אחרים בעלי זיקה למתכת.
- ניסויים ראשוניים עם ריכוזים ידועים של תמיסות סטוק של nickel.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מאפשרת הערכה מהירה של זיהום למתכות.
- ניתן לקבל תוצאות באמצעות טכניקות מעבדה סטנדרטיות.
- השיטה ניתנת להתאמה לסוגים שונים של שרף בעל זיקה למתכת (metal affinity resins).
- משתמשים יכולים להכיר את זרימת העבודה באמצעות ניסיונות ראשוניים.
מסקנות
- הבדיקה המוצעת מפשטת את הגילוי של זיהום ממתכות.
- היא נגישה לביוכימיים ממוצעים המשתמשים בציוד מעבדה נפוץ.
- השיטה משפרת את המהימנות של דגימות שהוכנו באמצעות כרומטוגרפיית זיקה למתכת (metal affinity chromatography).
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
הדלפת מתכות מעמודי כרומטוגרפיית זיקה למתכות מאובהלות (IMAC) מחדירה מזהמי מתכות מעבר העלולים לעכב פעילות אנזימטית ולפגוע באמינות הבדיקות במחקר ופיתוח בביופארמה. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ונגישה לכימות זיהום זה באמצעות ספקטרופוטומטריית UV-Vis נפוצה ו-hydroxynaphthol blue (HNB), המאפשרת בקרת איכות שגרתית ללא צורך במכשור ייעודי. על ידי השגת רגישות נאנומולרית באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי, הבדיקה תומכת בשמירה על שלמות הנתונים בתהליכי תיקוף מטרות בשלב מוקדם ובזרימות עבודה של טיהור חלבונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר לבחון האם עיכוב אנזימטי שנצפה נובע מהביולוגיה של המטרה או מזיהום למתכות, ובכך מפחית תוצאות חיוביות כוזבות בתהליך תיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: נעזר בספקטרופוטומטרי UV-Vis קיים ובבופרים נפוצים, מה שמאפשר יישום מהיר בקרב צוותי מחקר ופיתוח ללא צורך בהשקעה בציוד חדש.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק קריאות כמותיות של יוני מתכת באורך גל של 647 nm, מה שמאפשר את הקשר בין רמות השכיפה (leaching) לבין טהרת הפракציה בניקוי IMAC.
- ערך תפעולי: מתקנן את הערכת הזיהום בין וריאנטים של חלבונים ושרפים, ובכך תומך בפיתוח בדיקה הדירה לייצור חלבונים עם תג His.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: מאשר את היעדר המתכות בחלבונים מופקים לפני ביצוע בדיקות פונקציונליות, ובכך משפר את הביטחון החזוי במחקרי מעורבות מטרה (target engagement) המשכיים.
- ערך תפעולי: מספק קריטריון לשחרור מנות חלבון, המאפשר קבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) לפני השקעה בבדיקות יעילות פרה-קליניות.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בין טיהור ב-IMAC לבין אפיון ביוכימי או ביופיזיקלי בהמשך התהליך, ומשמשת כנקודת בקרה לניקיון הדגימה לפני בדיקות קינטיקה של אנזימים, בדיקות קישור או מחקרים מבניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי שלילת ארטיפקטים המתווכים על ידי מתכות בנתוני פעילות אנזימטית או אינטראקציית חלבונים.
- סינון: מבטיחה את מוכנות המבחן על ידי אימות ששברי חלבון מומחצים נקיים ממתכיות מעבר מעכבות שעלולות להטות את תוצאות סינון התרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת ערכי דלתה כמותיים של בליעה ב-647 nm, המאפשרים חישוב של ריכוזי מתכת במיקרומולר לצורך השוואה בין סדרות ייצור.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין איכות הניקוי לרצף פרה-קליני על ידי הבטחה שזיהום מתכת לא יטעה את תיקוף המטרה או את מדידות הסמנים הביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כשלב בקרת איכות (QC) בר-שימוש שניתן להחיל על כל ניקוי מבוסס IMAC, ללא קשר לסוג השרף או לחלבון המטרה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי ביטול מקור נפוץ לרעש ביוכימי במבחנים מבוססי אנזימים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה בין מעבדות באמצעות שימוש בשיטה קולורימטרית עם פרמטרי דגירה ומדידה מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון לכישלון של ניסויים עקב עיכוב מתכתי שלא זוהה, ובכך משפר את יעילות ההון במסעי זיהוי מובילים (lead identification).
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף של מטרות חלבון מותאם סיכון על בסיס טוהר מאושר, ובכך תומך בהקצאת משאבים טובה יותר בשלבים המוקדמים של הגילוי.
שיקולי יישום
- דורש היכרות עם ספקטרופוטומטריה ב-UV-Vis והכנה בסיסית של תמיסות עבור ריאגנט HNB.
- תלוי בגישה לקובטות קוורץ ובספקטרופוטומטר המסוגל לבצע מדידות בליעה ב-647 nm.
- מחייב דילול עקבי של הדגימות ותזמון דגירה כדי להבטיח חישובי delta-AB מדויקים.
- עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור חלבונים בעלי בליעה אינטרינזית חזקה או הפרעה צבעונית ב-647 nm.
- מומלץ לשלב עם שיטות אורתוגונליות כגון AAS או ICPMS לצורך אישור כאשר נדרשת כימות מתכות ברמת ביטחון גבוהה.
