Name: הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: למד הדמיה תלת-ממדית ברזולוציית תא בודד לאורגנואידים שלמים באמצעות ניקוי אופטי ומיקרוסקופיית קונפוקל. פרוטוקול שלושת הימים מאפשר מיפוי מבני מפורט וניתוח כמותי של תתי-אוכלוסיות תאיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה על התמיכה הטכנית של מרכז הנסיכה מקסימה לאונקולוגיה ילדים ולכון הוברכט ולזייס על תמיכה בהדמיה ושיתופי פעולה. כל ההדמיה בוצעה במרכז ההדמיה של הנסיכה מקסימה. עבודה זו נתמכה כספית על ידי מרכז הנסיכה מקסימה לאונקולוגיה ילדים. JFD נתמך על ידי מלגת מארי קירי העולמית ומענק VENI מהארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO). ACR נתמכה על ידי מענק התחלתי של המועצה האירופית (ERC).

השימוש באורגניואידים המופקים בעכבר תואם לתקנים רגולטוריים ואושר על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים ע"ש מכון וולטר ואלייזה הול (WEHI). כל דגימות האורגנואידים האנושיים הוחזרו מבנקים ביולוגיים באמצעות טכנולוגיית אורגנואיד Hubrecht (HUB, www.hub4organoids.nl). אישורים התקבלו על ידי הוועדה האתית הרפואית של UMC אוטרכט (METC UMCU) לבקשת ה-HUB על מנת להבטיח תאימות עם חוק המחקר הרפואי ההולנדי המעורב בנושאים אנושיים והסכמה מדעת התקבלה מתורמים בעת הצורך.
1. הכנת ריאה
<ol><li>כדי להכין 4% (w /v) paraformaldehyde (PFA), לחמם 400 מ"ל של תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) כדי קצת פחות מ 60 ° C באמבט מים. מוסיפים 20 גרם אבקת PFA ומתמוססים באמצעות ערבוב.<ol>
<li>לאחר מכן, להוסיף כמה טיפות של 10 M NaOH. נותנים להתקרר על הקרח ולהוסיף כמה טיפות של 10 M HCl כדי להתאים את ה-pH ל 7.4. למעלה עם PBS עד 500 מ"ל ו aliquot (חנות ב -20 °C עבור עד 2 חודשים). הערה: אין לחמם מעל 60°C כדי למנוע השפלה של ה-PFA. זמן הכנה = 4 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להכין PBS עם Tween-20 (PBT) (0.1% v/v), הוסף 1 מ"ל של Tween-20 ל- 1 L של PBS (חנות ב- 4 °C עד 4 שבועות). הערה: זמן הכנה = 10 דקות.</li>
	<li>כדי להכין 100 מ"ל של 0.5 M אתילנדיאמיןtraacetic חומצה (EDTA), להוסיף 18.6 גרם של EDTA ו 2.5 גרם של NaOH כדי 80 מ"ל של dH2O. להתאים את ה-pH ל 8 עם 1 M NaOH ולמלא עד 100 מ"ל עם dH2O.</li>
	<li>כדי להכין 500 מ"ל של 1 M Tris, להמיס 60.55 גרם של Tris עם 42 מ"ל של מרוכז (36-38%) HCl ב 300 מ"ל של dH2O. להתאים את ה-pH ל 8 ולמלא ל 500 מ"ל.</li>
	<li>כדי להכין מאגר כביסה אורגנואיד (OWB), להוסיף 1 מ"ל של Triton X-100, 2 מ"ל של 10% (w /v) SDS ו 2 גרם של אלבומין סרום של סרן חזיר (BSA) ל- 1 L של PBS (חנות ב 4 °C עד 2 שבועות). הערה: זמן הכנה = 10 דקות.</li>
	<li>כדי להפוך 220 מ"ל של FUnGI, לערבב 110 מ"ל של גליסרול עם 20 מ"ל של dH2O, 2.2 מ"ל של מאגר Tris (1 M, pH 8.0) ו 440 μL של EDTA (0.5 M). מוסיפים 50 גרם פרוקטוז ומערבבים בטמפרטורת החדר (RT) בחושך עד להמסה. כשנקה, מוסיפים 49 גרם פרוקטוז ומערבבים עד להמסה. לאחר מכן מוסיפים 33.1 גרם אוריאה ומערבבים עד להמסה (לאחסן ב-4°C בחושך). הערה: אין לחמם כמו פרוקטוז קרמל בטמפרטורות גבוהות יותר. FUnGI מורכבת 50% (v / v) גליטרול, 9.4% (v /v) dH2O, 10.6 mM tris בסיס, 1.1 mM EDTA, 2.5 M פרוקטוז ו 2.5 M urea. זמן הכנה = יום אחד.</li>
	<li>כדי להכין PBS-BSA (1% עם רוחב/v), המיסו גר' אחד של BSA ב-100 מ"ל של PBS (חנות ב-4°C עד שבועיים). הערה: זמן הכנה = 10 דקות.</li>
</ol>2. שחזור אורגנואיד
הערה: השלבים הבאים חלים על אורגנואידים הגדלים בתמצית קרום מרתף (BME) שהיו תרבותיים בצלחת 24 באר עם גודל של 100-500 μm .
<ol><li>שאף את מדיום התרבות ושטוף פי 1 עם PBS קר כקרח. הימנע משיבוש מטריצת תלת-מיוד.</li>
	<li>מניחים את הצלחת על קרח ומוסיפים 1 מ"ל של תמיסת שחזור תאים קרים כקרח(טבלת חומרים)לכל באר. דגירה 30-60 דקות ב-4°C על שייקר אופקי (40 סל"ד). הערה: יש לפרק לחלוטין את טיפות מטריצת תלת-מיתד.</li>
	<li>מעיל קצה פיפטה 1 מ"ל עם BSA על ידי טבילה ב 1% PBS-BSA ו pipetting למעלה ומטה 2x. ציפוי זה ימנע אורגנואידים להיצמד לקצה. כדי לכסות את הצד הפנימי של צינור חרסי של 15 מ"ל, מלא ב- 5 מ"ל של PBS-BSA 1% , הפוך פי 2-3 ובטל את ה- PBS-BSA. הערה: ציפוי זה נחוץ עבור כל חומרים מתכלים מפלסטיק עד קיבעון (שלב 3.3).</li>
	<li>בעזרת קצה מצופה, תוסתר בעדינות את תכולת הבאר 5-10x והעבר את האורבנואידים לצינורות מצופה של 15 מ"ל. אורגנואידים מבארות שונות עם זהות זהה יכולים להיות מקצברים לתוך אותו צינור.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של קר כקרח 1% PBS-BSA לכל תרבות גם לשטוף ולאסוף את כל האורגן.</li>
	<li>הוסף PBS קר ל-10 מ"ל והתנועב למשך 3 דקות ב-70 x g ו-4°C כדי להשיג כדור הדוק ללא שכבה נראית לעין של מטריצה תלת-מית-ת-ית- הסירו בזהירות את הסופרנטנט.</li>
</ol>3. קיבעון וחסימה
<ol><li>בזהירות respenpened את organoids ב 1 מ"ל של PFA קר כקרח באמצעות קצה מצופה 1 מ"ל.</li>
	<li>תקן ב-4°C ל-45 דקות. בעדינות respenpened את organoids באמצע זמן קיבעון באמצעות קצה מצופה 1 מ"ל כדי להבטיח אפילו קיבעון בין כל organoids.</li>
	<li>מוסיפים 10 מ"ל של PBT קר כקרח לצינור, מערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור, דגירה במשך 10 דקות ומסתובבים ב-70 x g, שניהם ב-4 °C. הערה: מצעד זה ואילך ציפוי של טיפים בדרך כלל לא נחוץ כמו רוב סוגי אורגנואידים לא להיצמד לקצה לאחר קיבעון. עם זאת, אורגנואידים מסוימים עשויים לדרוש פלסטיק מצופה גם לאחר קיבעון.</li>
	<li>לחסום את organoids על ידי תחשוף מחדש את הכדור ב OWB קר כקרח (לפחות 200 μL של OWB לבאר) ולהעביר את organoids לצלחת השעיה 24 גם. הערה: אורגנואידים מתוך גלולה אחת גדולה ניתן לפצל על בארות מרובות כדי לבצע כתמים שונים.</li>
	<li>דגירה ב 4 °C במשך 15 דקות לפחות.</li>
</ol>4. אימונוללינג
<ol><li>פיפט 200 μL של OWB בבאר ריקה כדי לשמש התייחסות גם. הערה: החיסון יכול להתבצע גם ב-48 או 96 בארות כדי להפחית את השימוש בנוגדנים. עם זאת, המשתמש צריך להיות מודע לכך שביצועי הכתמים והשטיפת ניתן להפחית בשל נפח קטן יותר.</li>
	<li>תן לאובנואידים להתיישב בתחתית הצלחת. הערה: ניתן לבדוק זאת באמצעות סטריאומיקרוסקופ והוא נעשה קל יותר באמצעות רקע כהה.</li>
	<li>להטות את הצלחת 45° ולהסיר OWB עוזב את organoids ב 200 μL של OWB (השתמש בחומר עזר גם כדי להעריך 200 μL).</li>
	<li>הוסף 200 μL של OWB עם נוגדנים ראשוניים 2x מרוכז (למשל, E-cadherin [1:400] ו Ki67 [1:200] לתוצאות באיור 1; קרטין5 [1:500], קרטין 8/18 [1:200], MRP2 [1:50], ו Ki67 [1:200] לתוצאות באיור 2) ודרודר לילה ב-4°C תוך נדנדה/רעד קלות (40 סל"ד על שייקר אופקי).</li>
	<li>למחרת, להוסיף 1 מ"ל של OWB.</li>
	<li>מניחים לאוגן להתיישב בתחתית הצלחת למשך 3 דקות. הסר OWB משאיר 200 μL בצלחת. מוסיפים 1 מ"ל של OWB ולשטוף 2 שעות עם נדנדה קלה / טלטול.</li>
	<li>חזור על שלב 4.6 פעמיים נוספות.</li>
	<li>מניחים לאוגן להתיישב בתחתית הצלחת למשך 3 דקות. הסר OWB עוזב 200 μL בבאר.</li>
	<li>להוסיף 200 μL של OWB עם נוגדנים משניים, נוגדנים וצבעים מרוכזים 2x מרוכזים (לדוגמה, DAPI [1:1000], חולדה-AF488 [1:500], mouse-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] לתוצאות באיור 1; DAPI [1:1000], חולדה-AF488 [1:500], rabbit-AF555 [1:500], mouse-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] לתוצאות איור 2; DAPI [1:1000], פאלודין-AF647 [1:100] לתוצאות באיור 3) ותדגירה לילה ב-4°C תוך כדי נדנדה/רעידות קלות.</li>
	<li>למחרת, חזור על שלבים 4.5-4.7.</li>
	<li>מעבירים את האורגנואידים לצינור של 1.5 מ"ל ומסתובבים ב-70 x g למשך 3 דקות.</li>
</ol>5. ניקוי אופטי של אורגנואידים
<ol><li>להסיר ככל האפשר OWB על ידי pipetting מבלי לשבש את organoids.</li>
	<li>הוסף FUnGI (לפחות 50 μL, RT) באמצעות 200 μL טיפ עם הסוף לחתוך ולהשתמש מחדש בעדינות כדי למנוע היווצרות בועה. דגירה ב RT במשך 20 דקות. הערה: ניקוי אופטי על ידי FUnGI עלול לגרום להתכווצות רקמות קלה. זה לא ישפיע על המורפולוגיה הכללית של אורגנואידים חד שכבתיים ורב שכבתיים; עם זאת, אורגנואידים חד שכבתיים בצורת כדורית עם לומן גדול עלולים להתמוטט. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ודגימות ניתן לאחסן ב 4 °C (עבור לפחות 1 שבוע) או ב -20 ° C (לפחות 6 חודשים).</li>
</ol>6. הכנת שקופיות להדמיה קונפוקל
<ol><li>הכנת מזרק 10 מ"ל עם חומר איטום סיליקון(טבלת חומרים). חבר קצה μL 200 μL וחתוך את הקצה כדי לאפשר זרימה עדינה של הסיליקון צמיגי לאחר לחיצה על המזרק. השתמש במזרק כדי לצייר מלבן של 1 ס"מ על 2 ס"מ באמצע שקופית.</li>
	<li>חותכים את הקצה של 200 טיפ μL ולהעביר את האורגנואידים ב FUnGI לאמצע המלבן.</li>
	<li>מניחים כיסוי על גבי. כדי למזער בועות אוויר לכודות, מקם תחילה את הצד השמאלי של הכיסוי, ולאחר מכן הנמך באיטיות את כיסוי הכיסוי משמאל לימין עד שאין אוויר לכוד ולאחר מכן שחרר את הסם. הערה: ניתן להשתמש במחללים הגודלים ההזויים של האורבנואידים כדי למנוע את נזקיהם.</li>
	<li>לחץ בעדינות על כל קצוות הכיסוי כדי לחבר אותו בחוזקה לאיטום הסיליקון. השקופית מוכנה כעת להדמיה. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ותו לאחסן את המדגם ב- 4 °C (למשך שבוע אחד לפחות) או -20 °C (למשך 6 חודשים לפחות).</li>
</ol>7. רכישת תמונה ועיבוד
<ol><li>באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal(טבלת חומרים),תמונה השקופית עם רב טבילה 25x או שמן טבילה 40x יעד עבור הדמיה confocal.<ol>
<li>השתמש בהגדרות הרכישה הבאות עבור המטרה 25x: מסגרת מצב סריקה, גודל מסגרת 1024 x 1024, גודל voxel 332 nm x 332 nm x 1.2 μm, זמן לשכון פיקסלים <2 μs, סריקה דו-כיוונית, מספר ממוצע 1, עומק סיביות 8. כדי להפחית את ההתכתמות, השתמש בהתחלת לייזר נמוכה (<5% באופן כללי, <10% עבור כתמים חלשים).</li>
		<li>השתמש במצב Z-stack כדי להגדיר את הגבולות הנמוכים והעליונה והגדר את גודל שלב ה- Z לאופטימלי. בעת הדמיה של מבני אורגנואידים גדולים או אורגנואידים מרובים יחד, השתמש במצב ריצוף עם חפיפה של 10% וציין את תחום העניין. הערה: עם הגדרות אלה, גודל הנתונים עבור אורגנואיד טיפוסי בקוטר של <300 μm הוא <1 GB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור ערכות נתונים סריקת אריח, לתפור את קבצי ההדמיה בתוכנה מלווה מיקרוסקופ (טבלת חומרים). במקטע העיבוד, בחר תפירה כשיטה, בחר פלט חדש תחת פרמטרים ובחר את הקובץ לתפירה. הקש החל כדי להתחיל בתפירה.</li>
	<li>השג ייצוג מעובד תלת-ממדי של ההדמיה תחת הכרטיסיה תצוגת תלת-ממדית תוכנת ההדמיה(Table of Materials)ולאחר מכן מטב את מאפייני הבהירות, הניגודיות והעיבוד תלת-ממדי. יצא תמונות RGB של התוצאות כקבצי TIFF.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshot%3A+Growing+Organoids+from+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Bartfeld, S., Stem Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+responses+to+CFTR-modulating+drugs+using+rectal+organoids+derived+from+subjects+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis.</a> Science Translational Medicine. 8 (344), 84(2016).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Multipotent+Luminal+Progenitor+Cells+in+Human+Prostate+Organoid+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Nanki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Routes+toward+Wnt+and+R-spondin+Niche+Independency+during+Human+Gastric+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis.</a> Cell. 174 (4), 856-869 (2018).</li>
<li>Jamieson, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+a+robust+mouse+mammary+organoid+system+for+studying+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics.</a> Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+In+vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5-+or+Lgr6-expressing+taste+stem%2Fprogenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Schutgens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubuloids+derived+from+human+adult+kidney+and+urine+for+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling.</a> Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Tissue Clearing.</a> Cell. 171 (2), 496(2017).</li>
<li>Rios, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+a+novel+population+of+binucleated+mammary+epithelial+cells+in+lactation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation.</a> Nature Communications. 7, 11400(2016).</li>
<li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).</li>
<li>Rios, A. C., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+organoids%3A+a+bright+future+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging organoids: a bright future ahead.</a> Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDISCO%3A+A+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Body+Profiling+of+Cancer+Metastasis+with+Single-Cell+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution.</a> Cell Reports. 20, 236-250 (2017).</li>
<li>Murakami, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+single-cell-resolution+whole-brain+atlas+using+CUBIC-X+expansion+microscopy+and+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing.</a> Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Rios, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraclonal+Plasticity+in+Mammary+Tumors+Revealed+through+Large-Scale+Single-Cell+Resolution+3D+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging.</a> Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+three-dimensional+imaging+to+the+intestinal+crypt+organoids+and+biopsied+intestinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues.</a> The Scientific World Journal. 2013, 624342(2013).</li>
<li>Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+methods%3A+An+overview+of+the+techniques+used+for+the+imaging+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).</li>
<li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146, 166884(2019).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

כאן, אנחנו שמים קדימה פרוטוקול מפורט להדמיה תלת-ממדית של אורגנואידים שלמים עם רזולוציה של תא יחיד. כדי לבצע פרוטוקול זה בהצלחה, יש לנקוט מספר שלבים קריטיים. בסעיף זה אנו מדגישים שלבים אלה ומספקים פתרון בעיות.
הצעד הקריטי הראשון הוא הסרת מטריצת תלת-מית-מיוד. רוב האורגנואידים מופצים במבחנה עם השימוש מטריצות המחקים את הסביבה החוץ תאית vivo כדי לשפר את היווצרות של מבנים 3D מקוטב היטב. כתמים מתקבעים ובעקבות הבאים בתוך מטריצת 3D אפשרי, אבל יכול להיות נחות לחדירה של נוגדנים או יכול ליצור אות רקע גבוה (נתונים לא מוצגים). הסרה יעילה של מטריצות יכולה להיות מושפעת על ידי סוג של מטריצה, הכמות והגודל של organoids וculturing ממושך. לכן, ייתכן שיהיה צורך במיטוב עבור תנאי תרבות שונים. עבור אורגנואידים המתואורים במטריגל או BME, צעד של 30-60 דקות בתמיסת שחזור תאים קרים כקרח מספיק כדי להמיס את המטריצה מבלי לפגוע באורגנואידים. בנוסף, הסרת מטריצת 3D התומכת עלולה לגרום לאובדן מבנים מקומיים ולשיבוש של מגעים אורגנואידים עם סוגי תאים אחרים, למשל כאשר אורגנואידים הם שיתוף תרבות עם פיברובלסטים או תאים חיסוניים. יתר על כן, קיבעון אורגנואיד אופטימלי הוא חיוני בשימור ארכיטקטורת רקמות 3D, אנטי ניות חלבון ומזעור פלואורסצינטיות אוטומטית. תיקון במשך 45 דקות עם 4% PFA ב 4 °C הוא בדרך כלל מספיק עבור תיוג של מגוון רחב של אורגנואידים ואנטיגן. עם זאת, שלב קיבעון ארוך יותר, עד 4 שעות, הוא בדרך כלל מתאים יותר אורגנואידים המביעים חלבונים כתב פלורסנט, אבל ידרוש אופטימיזציה עבור פלואורופורים שונים. זמני קיבעון קצרים מ-20 דקות אינם מספיקים כדי לתייג כראוי את F-actin באמצעות בדיקות פאלואידין. בעיה נפוצה נוספת היא אובדן אורגנואידים במהלך הפרוטוקול. לכן חשוב (i) בזהירות מעיל טיפים צינור וצינורות עם 1% BSA-PBS כמתואר בעת טיפול organoids לא תקן כדי למנוע מהם דבק פלסטיק, (ii) להשתמש בדבקות נמוכה או לוחות השעיה כדי למנוע את הדגימה מדבק לצלחת, ו(iii) לאפשר מספיק זמן עבור organoids להתיישב בתחתית הלוחית לפני הסרת בזהירות את המאגרים. FUnGI צמיגי pipetting עשוי להציג בועות. טיפול הדגימה פינה ב RT מפחית צמיגות ומשפר את קלות השימוש, ובכך למזער את אובדן organoids. בעוד רוב organoids קל להתמודד, אורגנואידים סיסטיק עם לומן מוגדל יש נטייה גבוהה להתמוטט בעת תיקון עם 4% PFA או כאשר פינה עם FUnGI. אפקט זה ניתן להפחית, אבל לא לגמרי למנוע, באמצעות קיבעון שונה (למשל, פורמלין או PFA-גלוטראלדהייד). עם זאת, זה עלול להשפיע על השפעה אוטומטית, חדירה נוגדן וזמינות epitope. כאשר אורגנואידים סיסטיק מופיעים מקופלים לאחר סליקה, מומלץ לדלג על שלב הסליקה והתמונה על ידי מיקרוסקופי פוטון מרובה, אשר פחות מעוכב על ידי פיזור אור. לבסוף, השגת כל מבנה 3D של אורגנואידים יכול להיות מאתגר ודורש מרחק מינימלי בין כיסויים אורגנואיד. בנוסף, כאשר אורגנואידים יש מקום לנוע בסוכן הרכבה שלהם, זה יכול לגרום X- ו- Y-shifts בעת הקלטת נתונים בעומק Z. שימוש פחות איטום סיליקון במהלך הכנת שקופיות יכול לפתור הרכבה תת-אופטימלית בין כיסויים ושקופית מיקרוסקופ. עם זאת, מעט מדי סיליקון עלול להוביל לדחיסת אורגנואיד ואובדן של המבנה 3D הטבוע שלהם. FUnGI משפר את הטיפול בהרכבת שקופיות ויציבות של אורגנואידים תוך כדי הדמיה, בשל צמיגותו הגבוהה יותר.
בעוד פרוטוקול זה יכול לשמש עבור מגוון רחב של יישומים ללמוד תוכן סלולרי עומק וארכיטקטורה תלת-מימד של אורגנואידים שלמים, יש לקחת בחשבון מגבלות מסוימות. מתודולוגיה זו היא די בתפוקה נמוכה וגוזלת זמן. אכן, משתמשים צריכים לזכור כי הדמיה אורגנואידים גדולים שלמים ב3D דורש גם ריצוף ורכישת מדגם Z, המוביל לזכי רכישה ממושכות. ניתן להשיג הדמיה מהירה יותר באמצעות נכסי מיקרוסקופ, כולל סורק דיסק תהודה או ספינינג, או על ידי טכנולוגיית מיקרוסקופ גיליון אור26. שיקול נוסף הוא כי סמנים יכולים לבוא לידי ביטוי הטרוגני בין אורגנואידים שונים מאותה מדגם. לכן, אורגנואידים מרובים יש לרכוש כדי ללכוד טוב יותר הטרוגניות אורגנואיד זה בתרבות. לבסוף, בעוד הליך המעבדה הרטובה המלאה הוא פשוט, לאחר תהליך של נתונים דורש מיומנויות בתוכנה לניתוח תמונה עבור הדמיה 3D וכימות, כמו גם סטטיסטיקה לכריית כל המידע הנוכחי ב- dataset.
בעשור האחרון, תחום הדמיית נפח התקדם מאוד, הן בשל פיתוח של מגוון רחב של סוכני ניקוי אופטי ושיפורים בטכנולוגיותמיקרוסקופיות וחשביות 27,30,31. בעוד בעבר רוב המחקרים התמקדו בהדמיית נפח גדול של איברים או גידולים קשורים, לאחרונה שיטות עבור רקמות קטנות ושבריריות יותר, כולל מבנים אורגנואידים,פותחו 36,37,38. לאחרונה פרסמנו שיטה פשוטה ומהירה להדמיית אורגנואידים להרכבה שלמה ממקורות שונים, גודל וצורה ברמת התא היחיד לעיבוד תלת-ממדי וניתוחתמונה 26, שאותם הצגנו כאן עם כמה שיפורים (למשל, FUnGI, הרכבה על סיליקון) ומלווים בפרוטוקול וידאו. שיטה זו עדיפה על הדמיה דו-ממדית קונבנציונלית המבוססת על מקטע בפענוח מורפולוגיה מורכבת של תאיםוארכיטקטורת רקמות( איור 2 ) וקלה ליישום במעבדות עם מיקרוסקופ קונפוקאלי. עם התאמות קלות לפרוטוקול, הדגימות יכולות להיעשות תואמות, סופר-רזולוציה confocal, מולטי פוטן, כמו גם הדמיית גיליון אור, מה שהופך פרוטוקול זה ישים נרחב ומספק למשתמשים כלי רב עוצמה כדי להבין טוב יותר את המורכבות הרב מימדי שניתן לדגמן עם organoids.

קידום שיטות תרבות חדשניות, כגון טכנולוגיית אורגנואידים, אפשר את תרבות האיברים במנה1. אורגנואידים גדלים למבנים תלת מימדיים (תלת-ממדיים) המקלים מחדש את רקמת המוצא שלהם כשהם משמרים תכונות פנוטיפיות ופונקציונליות. אורגנואידים הם כעת אינסטרומנטלילטיפול בשאלות ביולוגיות בסיסיות 2,מידול מחלות כולל סרטן 3, ופיתוח אסטרטגיות טיפול מותאמותאישית 4,5,6,7. מאז הפרוטוקול הראשון ליצירת אורגנואידים נגזר תאי גזע מבוגרים מעיים 8 , טכנולוגיית אורגנואיד התרחב לכלולמגווןרחב של רקמות בריאות סרטניים נגזר איברים כוללערמונית 9, מוח10, כבד1 1,12,בטן 13, חזה14,15,רירית הימת הי רקמה 16,בלוטת הרוק 17,בלוטת טעם 18,לבלב 19,וכליה 20.
הפיתוח של אורגנואידים הסכים עם עלייתן של טכניקות מיקרוסקופיות נפחיות חדשות שיכולות להמחות את הארכיטקטורה של רקמת הר שלמה ב-3D 21,22,23,24. הדמיה תלת-ממדית עדיפה על הדמיית מקטע רקמות 2D מסורתי בהדמיה של הארגון המורכב של דגימות ביולוגיות. מידע תלת-מיוד מוכיח שהוא חיוני להבנת הרכב תאי, צורת התא, החלטות גורל תא ואינטראקציות תא-תא של דגימות ביולוגיות שלמות. טכניקות ניתוח אופטי לא דקורטיבי, כגון מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי או רב-פוטון (CLSM ו-MLSM) ומיקרוסקופ פלואורסצנס גיליון אור (LSFM), מאפשרות כעת הדמיה משולבת של שני הפרטים העדינים, כמו גם ארכיטקטורת רקמות כללית, בתוך דגימה ביולוגית אחת. גישת הדמיה רבת עוצמה זו מספקת את ההזדמנות ללמוד את המורכבות המבנית שניתן לדגמן עםאורגנואידים 25 ולמפה את ההתפלגות המרחבית, זהות פנוטיפית ו מצב תאי של כל התאים הבודדים המחברים את המבנים תלת-ממדיים אלה.
לאחרונה פרסמנו פרוטוקול מפורט עבור הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של אורגנואידים קבועים ומנוקים26. פרוטוקול זה תוכנן במיוחד וממוטב לעיבוד מבני אורגנואיד עדינים, בניגוד מתודולוגיות לרקמות גדולות ושלמות כגון דיסקו27,28, מעוקב29,30,31, ו CLARITY32,33. ככזה, שיטה זו ישימה בדרך כלל למגוון רחב של אורגנואידים השונים במקור, גודל וצורה ותוכן סלולרי. יתר על כן, בהשוואה לפרוטוקולי הדמיה נפחיים אחרים הדורשים לעתים קרובות זמן ומאמץ ניכרים, הפרוטוקול שלנו אינו תובעי ותושלם בתוך 3 ימים. יישמנו את פרוטוקול ההדמיה 3D שלנו כדי לדמיין את הארכיטקטורה ואת ההרכב התאי של מערכות אורגנואיד שפותחו לאחרונה נגזר רקמות שונות, כוללדרכי הנשימה האנושיות 34,כליה 20,כבד 11,אורגנואידים סרטן השדהאנושי 15. בשילוב עם מעקב פלואורסצנט צבעוני, שיטה זו שימשה גם כדי לחשוף את הפוטנטיות של תאי בסיס באורגן מאמיעכבר 14.
כאן, אנו מחדדים את הפרוטוקול על-ידי הצגת סוכן ניקוי לא-רעלים FUnGI35. ניקוי FUnGI מושגת בשלב דגירה יחיד, קל יותר להרכבה בשל צמיגותה, ושומרת טוב יותר על פלואורסץ' במהלך האחסון. בנוסף, אנו מציגים נתרן dodecyl סולפט (SDS) למאגר השטיפה כדי לשפר כתמים גרעיניים, כמו גם שיטה מבוססת סיליקון להרכבה להכנת שקופיות קלה לפני מיקרוסקופיה. איור 1 מספק מבט כולל גרפי על הפרוטוקול (איור 1A) ודוגמאות של אורגנואידים בעלי תמונות תלת-מיתיד (איור 1B-D). בקיצור, אורגנואידים התאוששו מטריצת 3D שלהם, קבוע immunolabeled, פינה אופטית, תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal ולאחר מכן 3D מעובד עם תוכנת הדמיה.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגה נעילה בטוחה</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל צינורות צנטריפוגה נעילה בטוחה</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת התאוששות תאים</td><td>קורנינג</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מיקרוסקופ קונפוקלי ZEN</td><td>Zeiss</td><td>ZEN צינורות חרוטיים שחור/כחול</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass #1.5 24x60 מ"מ</td><td>מנזל-גלזר</td><td>G418-15</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass #1.5 48x60 מ"מ</td><td>ProSciTech</td><td>G425-4860</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td>דילול 1:1000</td></tr><tr><td>דיסקציה סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>סרט דביק דו צדדי 12,7 מ"מ 6,35 מ'</td><td>סקוטש 3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>1x</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>פוקוס שקוף</td><td>CelExplorer</td><td>FC-101</td><td></td></tr><tr><td>פרוקטוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>בום גליצרול</td><td></td><td>76050771.0500</td><td></td></tr><tr><td>צנרת העברה מדורגת</td><td>Samco</td><td>222-15</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אופקי</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td> <td>Ajax Firechem.</td><td>265.2.5L-PL</td><td>10M פתרון מלאי,</td></tr><tr><td>תוכנת Imaris</td> קורוזיבית שקופיות מיקרוסקופ <td>מטוס Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost</td><td>ThermoFisher</td><td>10143352</td><td>קצה קרקע, 90 מעלות 26 מ"מ ~ 76 מ"מ</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500g</td><td>מסוכן</td></tr><tr><td>פלואידין Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher</td><td>A22287</td><td>דילול 1:100-200</td></tr><tr><td>דילול E-cadherin</td><td>ThermoFisher</td><td>13-1900</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>B56</td><td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>קרטין 5</td><td>BioLegend</td><td>905501</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>קרטין 8/18</td><td>DSHB (אוניברסיטת איווה)</td><td></td> <td>דילול 1:200</td></tr><tr><td>MRP2</td><td>Abcam</td><td>ab3373</td><td>דילול 1:50</td></tr><tr><td>חולדה משנית IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>דילול ThermoFisher</td><td>A-21208</td><td>1:500</td></tr><tr><td>עכבר משני IgG (H+L) Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher</td><td>A-31570</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>ארנב משני IgG (H+L) Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher</td><td>A-31572</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>איטום סיליקון</td><td>גריפון</td><td>S-200</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>ThermoFisher</td><td>28312</td><td></td></tr><tr><td>כדורי נתרן הידרוקסיד (NaOH) Merck</td><td>Millipore</td><td>567530</td><td>10 M תמיסת מלאי,</td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאי השעיה</td> קורוזיביות <td>Greiner Bio-One</td><td>662102</td><td>24 בארות</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>11486631</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8532</td><td>Dangerous</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure נקודת התכה נמוכה (LMP) Agarose</td><td>ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>תחנת עבודה אוריאה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

טכנולוגיית אורגנואיד, במבחנה 3D culturing של רקמה מיניאטורית, פתח חלון ניסיוני חדש עבור תהליכים תאיים השולטים פיתוח איברים ותפקוד, כמו גם מחלות. מיקרוסקופית פלואורסץ מילאה תפקיד מרכזי באיפיון הרכב התא שלהם בפירוט והדגמת הדמיון שלהם לרקמות שהם מקורם. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף עבור הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של אורגנואידים שלמים על תיוג חיסוני. שיטה זו ישימה באופן נרחב עבור הדמיה של אורגנואידים שונים במקור, גודל וצורה. עד כה יישמענו את השיטה דרכי הנשימה, המעי הגס, הכליה, ואורגנואידים בכבד נגזר רקמה אנושית בריאה, כמו גם אורגנואידים גידול בשד אנושי אורגנואידים בלוטת עכבר. אנו משתמשים בחומר סלה אופטי, FUnGI, המאפשר רכישה של אורגנואידים תלת-מיוד שלמים עם הזדמנות לכמת חד-תאי של סמנים. פרוטוקול זה של שלושה ימים מקצירת אורגנואידים לניתוח תמונה ממוטב להדמיה תלת-ממדית באמצעות מיקרוסקופית קונפוקלית.

אורגנואידים הדמיה ב3D מאפשר הדמיה של אדריכלות, הרכב הסלולר, כמו גם תהליכים תאיים בפירוט רב. הטכניקה המוצגת אינה תובענית וככל הנראה ניתן להחילה על מגוון רחב של מערכות אורגנואידים הנגזרות מאיברים שונים או מינים מארחים.
הכוח של הדמיה 3D לעומת הדמיה דו-ממדית מאויר על ידי תמונות של אורגנואידים בלוטת מאם העכבר שנוצרו באמצעות שיטות שפורסמו לאחרונה14. השכבה המרכזית של אורגנואידים אלה מורכבת מתאי זוהרים בצורת טורים K8/K18, והשכבה החיצונית מכילה תאי בסיס מוארך K5-postive(איור 2A),אשר מסכם את המורפולוגיה של בלוטת המאם ב vivo. ארגון מקוטב זה מאתגר להעריך ממקטע אופטי דו-מיו-ד של אותו אורגנואיד(איור 2B,לוח אמצעי). דוגמה נוספת של מבנה מורכב כי הוא בלתי אפשרי לפרש ללא מידע 3D היא הרשת של MRP2 חיובי canaliculi המאפשרים את האיסוף של נוזל המרה של אורגנואידים כבדאנושי 11 (איור 2B). זה מדגים כיצד השיטה שלנו מאפשרת הדמיה של תכונות מבניות חיוניות של אורגנואידים. יתר על כן, האיכות והרזולוציה שהושגו מאפשרים פילוח חצי אוטומטי וניתוח תמונה. לכן, מספר תאים כולל ונוכחות של סמנים ניתן לכמת בתתי סוגים תאיים ספציפיים באורגן שלם. אנו ממחישים זאת על ידי פילוח הגרעין של אורגנואיד שלם המכיל 140 תאים, אשר 3 תאים להציג חיוביות גבוהה עבור סמן מחזור תא Ki67 (איור 2C). ערוץ DAPI נבחר כערוץ מקור, ומקטעים נוצרים בהתבסס על שלב סף עוצמה וקוטר כדור של 10 μm. אובייקטים נוגעים בהם מפוצלים לפי אזור הגדל מנקודות זרע. לבסוף, מסנן גודל של 10 voxels מוחל כדי להסיר מקטעים המושרה רעש קטן. עבור כל קטע המייצג גרעין, העוצמה המהותית של ערוץ Ki67 מיוצאית לאחר מכן לתווה.
לאחרונה פיתחנו את סוכן ניקוי אופטי FUnGI35, אשר עכשיו שילבנו בפרוטוקול זה כדי לחדד את השקיפות של organoids. FUnGI הוא קל לשימוש, כמו ניקוי מושגת בקלות על ידי צעד דגירה יחיד לאחר כתמי חיסון. יתרון נוסף של הסוכן הוא צמיגותו, מה שמקל על טיפול בדגימה במהלך הרכבת שקופיות. דגימות פלורסנט ב- FUnGI שומרות על הפלואורסצנטיות שלהן גם כאשר הם מאוחסנים במשך מספר חודשים ב-20°C. אנו מדגימים כי FUnGI עולה על ביצועים לא ברורים פרוקטוז-גליסרול באיכות אות פלורסנט עמוק באורגניואיד(איור 3A,B),וכי אורגנואידים מנוקה פטריות יש עוצמה פלואורסצנטית משופרת הכוללת בהשוואה אורגנואידים לאברור (איור 3C).
לסיכום, אנו מתארים טכניקת הדמיה תלת-ממדית לא תובענית ושחזור לרכישת נתונים רב-עוצמה של אורגנואידים עם תבלין חיסוני. פרוטוקול זה יכול לשמש בקלות כדי למצוא מגוון של אורגנואידים כולל אלה של עכבר ומוצא אנושי, ממודלים בריאים ומחלות. הכנת המדגם הפשוט ניתן להתאים כדי להקל על confocal, מולטי פוטן ומיקרוסקופי גיליון אור פלורסנט כדי להשיג רזולוציה תאית תת תאית של אורגנואידים שלמים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig1.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של פרוטוקול הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה. אורגנואידים נמצאים במטריקס תלת-מיוד שלהם. קיבעון וחסימה מתבצעים לפני immunolabeling עם נוגדנים וצבעים. ניקוי אופטי מושגת בשלב אחד באמצעות סוכן ניקוי FUnGI. ניתן לבצע עיבוד תלת-ממדי של תמונות באמצעות תוכנת הדמיה. (א)סקירה סכמטית של ההליך. (ב)פינה תמונה 3D רכוב הר מלא של אימונואיד אורגנואיד המעי הגס האנושי immunolabeled עבור F-actin ו E-cadherin (E-cad) (25x שמן המטרה). סרגל קנה מידה = 40 μm. (ג)נוקתה תמונה קונפוקל תלת-מיוד שלמה. סרגל קנה מידה = 20 μm. (ד)קטע אופטי מוגדל של אימונול חיסוני אורגנואיד מעי גס אנושי עבור F-actin, E-cadherin (E-cad) ו Ki67 (25x שמן המטרה). סרגל קנה מידה = 5 μm. נתון זה שונה מ- Dekkers ואח '26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig2.jpg"> איור 2: הדמיה רב-נפחית מדמיינת ארכיטקטורה תלת-ממדית מורכבת. תמונות קונפוקליות המייצגות ערכות נתונים תלת-מיוד להרכבה שלמה (החלונית השמאלית), מקטעים אופטיים תלת-מיוד (בלוח האמצעי) ואזורים תלת-מית-מיוד של אזור מוגדל (החלונית הימנית). (א)אורגנואיד המופק מתא בזל יחיד של בלוטת מאם העכבר הממחיש את הארגון 3D של תאי בזלת מומית מוארך המקיפים תאים זוהרים או מסומן עבור K8/18, K5 ו-F-actin (ניקוי פרוקטוז-גליצרול; 25x שמן המטרה). פסים בקנה מידה מייצגים 55 μm (החלונית השמאלית) ו 40 μm (לוחות אמצעיים ויניים). (ב)אורגנואיד כבד עוברי אנושי עם רשת תלת-מימדית מורכבת של תעלות MRP2-חיוביות, המסויגות עבור DAPI, MRP2 ו-F-actin (ניקוי פרוקטוז-גליטרול; מטרת שמן פי 40). פסים בקנה מידה מייצגים 25 μm (החלונית השמאלית) ו 8 μm (לוחות אמצעיים ויניים). (ג)תמונת הרכבה שלמה תלת-ממדית קונפוקלית של אורגנואיד כבד עוברי אנושי המסומן ב- DAPI ו- Ki67 (לוח שמאלי) ותמונה מפולגת בערוץ DAPI באמצעות תוכנת הדמיה (הפאנל האמצעי). סרגל קנה מידה = 15 μm. גרף המתווים המייצג את עוצמת אומר Ki67 בכל התאים (DAPI מחולק) של האורגניואיד כולו (140 תאים) (החלונית הימנית). נתון זה שונה מ- Dekkers ואח '26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig3.jpg"> איור 3: ניקוי אופטי של אורגנואידים עם FUnGI. (א)תמונות מייצגות של אורגנואידים אנושיים במעי הגס המסויגים ב-F-actin (ירוק) ו-DAPI (אפור) ותמונות ללא ניקוי, נקי עם פרוקטוז-גליטרול או נוקה עם FUnGI (25x שמן המטרה). לוח שמאלי: עיבוד תלת-ממדי של האורבנואיד. לוח ימני: קטע אופטי של האורבנואיד בעומק 150 μm. עבור מצב "אין ניקוי" הבהירות של התמונה היה צריך להיות מוגבר בהשוואה לתנאים "פרוקטוז-גליטרול" ו -"FUnGI" כדי לדמיין את האורגנואיד. סרגל קנה מידה = 50 μm. (ב)רגרסיה לא ליניארית מתאימה המציגה את הירידה בעוצמת DAPI עם עומק Z הולך וגדל עבור שיטות סליקה אופטיות שונות. ערכים מייצגים עוצמות של תאים בודדים שזוהו על-ידי פילוח DAPI ומנורמלים לעוצמת DAPI הממוצעת של 50 μm הראשון של organoid. כדי למנוע הערכה נמוכה של ההתכה הנגרמת על ידי תאים בהירים יותר בקצוות העמוקים יותר ומבנים ניצנים, רק האזורים המרכזיים של organoids נותחו. (ג)שלושה אורגנואידים לכל מצב בגודל ועומק דומים לכיוון כיסוי ים נתונו באמצעות הגדרות מיקרוסקופ זהות. ערכות הנתונים המלאות של תלת-מיוד היו עם תא בודד המקטע אות DAPI לצורך השוואה. גרף עמודות המציג עוצמה ממוצעת של DAPI עם שיטות ניקוי שונות ב ערכות נתונים מפולחות מלאות. הנתונים מתוארים כנתונים ממוצעים ± SD. ערכים הם עוצמות של &gt;3800 תאים בודדים שזוהו על-ידי פילוח DAPI. = p &lt; 0.0001, Kruskal-Wallis מבחן עם דו צדדי של דאן השוואה מרובה לאחר הוק בדיקות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

את כל המבנה תלת-ממדי ואת התוכן התאי של אורגנואידים, כמו גם את הדמיון הפנוטיפיק שלהם לרקמות המקוריות ניתן ללכד באמצעות פרוטוקול הדמיה תלת-ממדי ברזולוציה של תא יחיד המתואר כאן. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של אורגנואידים המשתנים במקור, גודל וצורה.

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לדמיין את המורכבות המבנית של אורגנואידים, המאפשר מיפוי של זהות, סולפט, והפצה במבנים אלה 3D ברזולוציה של תא יחיד. הפרוטוקול המהיר שלנו לשלושה ימים מותאם באופן מלא לאברנואידים ממקור מתאים ומשתמש בהכנת מדגם פשוטה, הכוללת שלב ניקוי אופטי לא רעיל ושיטת הרכבה מבוססת סיליקון. למרות שהפרוטוקול שלנו פשוט, חלקם הם צעדים קריטיים כגון הטיפול המאורגן, או הכנת השקופית, ניתן להסביר טוב יותר באמצעות הדגמה חזותית מאשר באמצעות טקסט.כדי לשחזר 100 עד 500 אורגנואידים בקוטר מיקרומטר הגדלים בתמצית קרום מרתף ב -24 צלחות באר, לשטוף כל ריתוך כדי להיות שנקטפו עם PBS מבלי לשבש את מטריצות 3D, ולהציב את הצלחת על קרח. מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון התאוששות קר כקרח לכל באר ומ מניחים את הצלחת על שייקר אופקי בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 דקות. טובלים טיפים אחד של פיפיות מיליליטר לתוך 1%BSA בתת פתרון PBS ופיפטי למעלה ולמטה פעמיים כדי לצפות כל טיפ עם BSA.לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של 1%PBS BSA אחד צינור 15 מיליליטר לכל מצב, ולהפוך את הצינור פעמיים עד שלוש פעמים לפני השלכת הפתרון, כדי לצפות את החלק הפנימי של הצינור. כדי לאסוף את האורגנואידים, השתמשו בקצה מצופה כדי להשעות בעדינות את תכולת הבאר חמש עד עשר פעמים, ומשוך את כל האורגנואידים מכל תנאי בצינור מצופה אחד של 15 מיליליטר. יש לשטוף כל באר במיליליטר אחד של קרח קר 1%PBS BSA כדי להבטיח שכל האורגנואידים נאספו, ולהעביר את הכביסה לצינורות המתאימים.הביאו את הנפח הסופי בכל צינור עד 10 מיליליטר עם PBS קר, ומחזירים את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה כדי להשיג לוח צבעים הדוק ללא שכבה נראית לעין של מטריצה תלת-ממדית. כדי לתקן את האורגנואידים, השתמשו בקצה פיפטה מצופה של מיליליטר כדי להשעות מחדש בזהירות כל גלולה במיליליטר אחד של פורמלדהיד קר כקרח, ולתקן בארבע מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. בעדינות להשעות מחדש את האורגנואידים באמצע זמן קיבוע.לאחר 45 דקות, מוסיפים 10 מיליליטר של PBS קר כקרח בתוספת tween 20 לכל צינור ומערבבים בעדינות על ידי היפוך, לפני הנחת הצינורות בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. כדי לחסום את האורגנואידים, בסוף הדגירה, לסובב את הדגימות ולהשעות מחדש את כדורי לפחות 200 microliters של חיץ כביסה organoid קר כקרח לכל באר להיות מצופה. ואז להעביר את האורגנואידים ל בארות בודדות של צלחת השעיה 24 בארות עבור דגירה 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.עבור immunolabeling להוסיף 200 microliters של מאגר כביסה organoid לתוך היטב התייחסות ריקה, ולאפשר organoids להתיישב לתחתית הצלחת. כאשר האורגנואידים התיישבו, להטות את הצלחת בזווית של 45 מעלות כדי לאפשר הסרה של כל אבל האחרון 200 microliters של חיץ לשטוף. לאחר מכן, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של חיץ כביסה אורגנואידי המכיל את הנוגדנים העיקריים של עניין, ומ מניחים את הצלחת לילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה קלה ורעידות ב 40 מהפכות לדקה.למחרת בבוקר, מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ כביסה אורגנואידי לכל באר, ומאפשרים לאורגנואידים להתיישב בתחתית הצלחת במשך שלוש דקות. כאשר האורגנואידים התיישבו, הסר את כל 200 המיקרוליטרים מלבד 200 המיקרוליטרים האחרונים מכל באר, ושטוף את האורגנואידים בשלושה שטיפות של שעתיים עם מיליליטר אחד של חיץ כביסה אורגנואידי טרי, ונדנדה קלה ורעידות לכל שטיפה. לאחר הכביסה השלישית, אפשר לאורגנואידים להתיישב בתחתית הצלחת במשך שלוש דקות לפני הסרת כל מלבד 200 המיקרוליטרים האחרונים של חיץ כביסה אורגנואידי מכל באר.הוסף 200 microliters של מאגר כביסה organoid המכיל את הנוגדנים המשניים המתאימים לכל באר עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה קלה ורעידות. למחרת בבוקר, לשטוף את האורגנואידים עם שלוש שטיפות של שעתיים במיליליטר אחד של חיץ כביסה organoid טרי לכל לשטוף, כפי שהוכח. לאחר הכביסה האחרונה, להעביר את האורגנואידים לתוך צינור אחד 1.5 מיליליטר לגם, ולאסוף את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה.עבור ניקוי אופטי של האורגנואידים, להסיר מאגר לשטוף כמה שיותר מכל צינור ככל האפשר, מבלי לשבש את האורגנואידים, ולהשתמש שונה 200 טיפ פיפטה microliter להוסיף לפחות 50 microliters של FUnGI לכל גלולה. לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר ניתן לאחסן את האורגנואידים עד שבוע בארבע מעלות צלזיוס, או עד שישה חודשים במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין שקופיות להדמיה אורגנואידית על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, מלא מזרק 10 מיליליטר עם איטום סיליקון ולצרף טיפ פיפית 200 מיקרוליטר שונה למזרק.השתמש במזרק כדי לצייר מלבן של אחד על שני סנטימטרים באמצע שקופית, ולהשתמש טיפ פיפטה שונה שני 200 מיקרוליטר למקם organoids פינה באמצע המלבן. כדי למקם כיסוי להחליק מעל האורגנואידים, מניחים את הצד השמאלי של הכיסוי להחליק למטה הראשון, לפני לאט להוריד את החלקת המכסה משמאל לימין עד שאין אוויר לכוד. לאחר מכן יש להפעיל בעדינות לחץ על כל הקצוות של החלקת המכסה כדי לחבר אותו בחוזקה לאיטום הסיליקון.כדי לדמיין את האורגנואידים, מקם את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל ובחר מטרה מרובת טבילה 25 X להדמיית קונפוקלים. הגדר את המיקרוסקופ להגדרות הרכישה המתאימות, ובחר כוח לייזר נמוך להפחתת הלבנת תמונות. השתמש במצב מחסנית Z כדי להגדיר את הגבולות העליונים של הקצה התחתון והגדר את גודל שלב Z בצורה מיטבית.בעת הדמיית מבנים אורגנואידיים גדולים, או אורגנואידים מרובים יחד, השתמש במצב ריצוף עם חפיפה של 10%ומציין את אזור העניין. כאשר כל הפרמטרים נקבעו, השג ייצוג תלת-ממדי של ההדמיה בתוכנת ההדמיה ומטב את מאפייני הבהירות, החדות והעיבוד תלת-ממדי. לאחר מכן ייצאו תמונות RGB של התוצאות כקובצי TIFF.החוזק של הדמיה 3D לעומת הדמיה 2D מאויר על ידי תמונות אלה של אורגנואידים בלוטת החלב של העכבר שנוצרו כפי שהודגם. השכבה המרכזית של האורגנואידים הייצוגיים הללו מורכבת מתאים זוהרים חיוביים בצורת טוראר K8/K18, והשכבה החיצונית מכילה תאי בזיליקום חיוביים מוארכים K5, אשר מסכמים מחדש את המורפולוגיה של בלוטת החלב ב- vivo. ארגון מקוטב זה מאתגר להעריך מקטע אופטי דו-מימדי של אותו אורגנואיד.דוגמה נוספת למבנה מורכב שלא ניתן לפרש ללא מידע תלת מימדי היא רשת של CANALICULI חיובי MRP2 המאפשרים איסוף של נוזל מרה של אורגנואידים בכבד אנושי. יתר על כן, האיכות והרזולוציה המתקבלות מאפשרות פילוח וניתוח תמונה חצי אוטומטיים. לכן, מספרי תאים כוללים ונוכחות סמנים ניתן לכמת בתת-סוגים תאיים ספציפיים באורגנואידים שלמים.על ידי פילוח הגרעינים של אורגנואיד שלם המכיל 140 תאים, ניתן לזהות שלושה תאים המציגים חיוביות גבוהה עבור סמן מחזור התא Ki67. סוכן סליקת אופטי, FUnGI, ביצועים טובים יותר לא ברור ניקוי פרוקטוז-גליצרול באיכות אות פלואורסצנטי עמוק בתוך אורגנואיד. עם FUnGI פינה אורגנואידים המדגימים עוצמת פלואורסצנטיות משופרת הכוללת לעומת אורגנואידים לא ברורים.שים לב כי כל BME שאריות המדגם עלול לגרום חדירת נוגדנים מופחתת יכול להוביל אות רקע גבוה. בנוסף, אורגנואידים סיסטיק לא צריך להיות פינה אופטית אם הם מתמוטטים. עם התאמות קלות לפרוטוקול, ניתן להשתמש בדגימות עם מיקרוסקופיה קונפוקל, מולטי פוטון ונייר חום ברזולוציה גבוהה.

single-cell-resolution-three-dimensional-imaging-of-intact-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים, חזקים ומשלימים לביצוע הדמיית צביעה ורזולוציה תת-תאית של מודלים קבועים של תרביות תאים תלת-ממדיות בטווח של 100 מיקרומטר עד מספר מילימטרים, ובכך מאפשרים הדמיה של המורפולוגיה, הרכב סוג התא והאינטראקציות ביניהם.

צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

פרוטוקול זה מתאר כיצד להדביק organoids מעיים אנושיים מהצד apical או basolateral שלהם כדי לאפיין אינטראקציות מארח / פתוגן ברמת תא יחיד באמצעות טכנולוגיית רצף RNA של תא יחיד (scRNAseq).

התאמת Organoids במערכת העיכול עבור זיהום פתוגן ורצף תא יחיד תחת בטיחות ביולוגית רמה 3 (BSL-3) תנאים

מאמר זה מציג פרוטוקול ייצור לסוג חדש של מצע תרבית עם מאות מיקרו-מיכלים למ"מ2, שבו ניתן לגדל אורגנואידים בתרבית ולצפות בהם באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. פרוטוקולי זריעת התאים ומערכת החיסון מפורטים גם הם.

פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לתרבית והדמיה תלת-ממדית של אורגנואידים

פרוטוקול זה מתאר שיטה אוטומטית למחצה לבדיקות סמים אורגנואידיות בתפוקה בינונית עד גבוהה ותוכנת ניתוח תמונה אוטומטית אגנוסטית למיקרוסקופ לכימות ולהמחשה של תגובות תרופתיות רב-פרמטריות בעלות אורגנואיד יחיד ללכידת הטרוגניות תוך-גופית.

בדיקת תרופות אורגנואידיות של גידולים רב-פרמטריים באמצעות הדמיית תאים חיים של Widefield לניתוח בתפזורת ואורגנואיד יחיד

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה. אנו מתארים גם שיטה להקמת חד-שכבות תאים הנגזרות מאורגנואידים תלת-ממדיים, המאפשרים גישה לצד האפי של תאי אפיתל.

תרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזרזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה והקמת חד-שכבות תאים

פרוטוקול זה משלב ניקוי אופטי ותיוג חיסוני להדמיה קונפוקלית בנפח מלא של אורגנואידים ברשתית שלמה. הוא משמר מבנה תלת מימדי, מאפשר הדמיה מפורטת של מסלולים עצביים מרכזיים, משפר את חקר הבשלת הרשתית, ארגון מרחבי ויישומיו הפוטנציאליים במודלים של מחלות ורפואה מותאמת אישית.

הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה עם רזולוציה תאית

אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב להדמיה ברזולוציה גבוהה, ללא תוויות ותלת מימד של אורגנואידים באמצעות הולוטומוגרפיה קוהרנטית נמוכה. פרוטוקול זה מפרט הכנת תרבית אורגנואידים, רכישת הדמיה וניתוח תמונה חישובי, המאפשר הדמיה בזמן אמת של דינמיקה מבנית ותגובות תרופות באורגנואידים חיים.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה וניתוח למידת מכונה ללא תוויות של אורגנואידים במעי באמצעות הולוטומוגרפיה בקוהרנטיות נמוכה

תא בודד electroporation (SCE) היא טכניקה מיוחדת המאפשרת משלוח של ה-DNA או מקרומולקולות אחרים לתוך תאים בודדים בתוך הרקמה בשלמותה, כולל ההכנות vivo. כאן אנו בפירוט את הליך SCE של פלורסנט לצבוע או פלסמיד דנ"א לתוך הנוירונים במוח שלם של laevis Xenopus הראשן.

תא יחיד electroporation in vivo בתוך המוח המתפתח אינטקט

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

למד הדמיה תלת-ממדית ברזולוציית תא בודד לאורגנואידים שלמים באמצעות ניקוי אופטי ומיקרוסקופיית קונפוקל. פרוטוקול שלושת הימים מאפשר מיפוי מבני מפורט וניתוח כמותי של תתי-אוכלוסיות תאיות.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

גלה סרטונים נוספים