הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

את כל המבנה תלת-ממדי ואת התוכן התאי של אורגנואידים, כמו גם את הדמיון הפנוטיפיק שלהם לרקמות המקוריות ניתן ללכד באמצעות פרוטוקול הדמיה תלת-ממדי ברזולוציה של תא יחיד המתואר כאן. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של אורגנואידים המשתנים במקור, גודל וצורה.

הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לדמיין את המורכבות המבנית של אורגנואידים, המאפשר מיפוי של זהות, סולפט, והפצה במבנים אלה 3D ברזולוציה של תא יחיד. הפרוטוקול המהיר שלנו לשלושה ימים מותאם באופן מלא לאברנואידים ממקור מתאים ומשתמש בהכנת מדגם פשוטה, הכוללת שלב ניקוי אופטי לא רעיל ושיטת הרכבה מבוססת סיליקון. למרות שהפרוטוקול שלנו פשוט, חלקם הם צעדים קריטיים כגון הטיפול המאורגן, או הכנת השקופית, ניתן להסביר טוב יותר באמצעות הדגמה חזותית מאשר באמצעות טקסט.

כדי לשחזר 100 עד 500 אורגנואידים בקוטר מיקרומטר הגדלים בתמצית קרום מרתף ב -24 צלחות באר, לשטוף כל ריתוך כדי להיות שנקטפו עם PBS מבלי לשבש את מטריצות 3D, ולהציב את הצלחת על קרח. מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון התאוששות קר כקרח לכל באר ומ מניחים את הצלחת על שייקר אופקי בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 דקות. טובלים טיפים אחד של פיפיות מיליליטר לתוך 1%BSA בתת פתרון PBS ופיפטי למעלה ולמטה פעמיים כדי לצפות כל טיפ עם BSA.

לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של 1%PBS BSA אחד צינור 15 מיליליטר לכל מצב, ולהפוך את הצינור פעמיים עד שלוש פעמים לפני השלכת הפתרון, כדי לצפות את החלק הפנימי של הצינור. כדי לאסוף את האורגנואידים, השתמשו בקצה מצופה כדי להשעות בעדינות את תכולת הבאר חמש עד עשר פעמים, ומשוך את כל האורגנואידים מכל תנאי בצינור מצופה אחד של 15 מיליליטר. יש לשטוף כל באר במיליליטר אחד של קרח קר 1%PBS BSA כדי להבטיח שכל האורגנואידים נאספו, ולהעביר את הכביסה לצינורות המתאימים.

הביאו את הנפח הסופי בכל צינור עד 10 מיליליטר עם PBS קר, ומחזירים את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה כדי להשיג לוח צבעים הדוק ללא שכבה נראית לעין של מטריצה תלת-ממדית. כדי לתקן את האורגנואידים, השתמשו בקצה פיפטה מצופה של מיליליטר כדי להשעות מחדש בזהירות כל גלולה במיליליטר אחד של פורמלדהיד קר כקרח, ולתקן בארבע מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. בעדינות להשעות מחדש את האורגנואידים באמצע זמן קיבוע.

לאחר 45 דקות, מוסיפים 10 מיליליטר של PBS קר כקרח בתוספת tween 20 לכל צינור ומערבבים בעדינות על ידי היפוך, לפני הנחת הצינורות בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. כדי לחסום את האורגנואידים, בסוף הדגירה, לסובב את הדגימות ולהשעות מחדש את כדורי לפחות 200 microliters של חיץ כביסה organoid קר כקרח לכל באר להיות מצופה. ואז להעביר את האורגנואידים ל בארות בודדות של צלחת השעיה 24 בארות עבור דגירה 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

עבור immunolabeling להוסיף 200 microliters של מאגר כביסה organoid לתוך היטב התייחסות ריקה, ולאפשר organoids להתיישב לתחתית הצלחת. כאשר האורגנואידים התיישבו, להטות את הצלחת בזווית של 45 מעלות כדי לאפשר הסרה של כל אבל האחרון 200 microliters של חיץ לשטוף. לאחר מכן, מוסיפים 200 מיקרוליטרים של חיץ כביסה אורגנואידי המכיל את הנוגדנים העיקריים של עניין, ומ מניחים את הצלחת לילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה קלה ורעידות ב 40 מהפכות לדקה.

למחרת בבוקר, מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ כביסה אורגנואידי לכל באר, ומאפשרים לאורגנואידים להתיישב בתחתית הצלחת במשך שלוש דקות. כאשר האורגנואידים התיישבו, הסר את כל 200 המיקרוליטרים מלבד 200 המיקרוליטרים האחרונים מכל באר, ושטוף את האורגנואידים בשלושה שטיפות של שעתיים עם מיליליטר אחד של חיץ כביסה אורגנואידי טרי, ונדנדה קלה ורעידות לכל שטיפה. לאחר הכביסה השלישית, אפשר לאורגנואידים להתיישב בתחתית הצלחת במשך שלוש דקות לפני הסרת כל מלבד 200 המיקרוליטרים האחרונים של חיץ כביסה אורגנואידי מכל באר.

הוסף 200 microliters של מאגר כביסה organoid המכיל את הנוגדנים המשניים המתאימים לכל באר עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה קלה ורעידות. למחרת בבוקר, לשטוף את האורגנואידים עם שלוש שטיפות של שעתיים במיליליטר אחד של חיץ כביסה organoid טרי לכל לשטוף, כפי שהוכח. לאחר הכביסה האחרונה, להעביר את האורגנואידים לתוך צינור אחד 1.5 מיליליטר לגם, ולאסוף את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה.

עבור ניקוי אופטי של האורגנואידים, להסיר מאגר לשטוף כמה שיותר מכל צינור ככל האפשר, מבלי לשבש את האורגנואידים, ולהשתמש שונה 200 טיפ פיפטה microliter להוסיף לפחות 50 microliters של FUnGI לכל גלולה. לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר ניתן לאחסן את האורגנואידים עד שבוע בארבע מעלות צלזיוס, או עד שישה חודשים במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי להכין שקופיות להדמיה אורגנואידית על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, מלא מזרק 10 מיליליטר עם איטום סיליקון ולצרף טיפ פיפית 200 מיקרוליטר שונה למזרק.

השתמש במזרק כדי לצייר מלבן של אחד על שני סנטימטרים באמצע שקופית, ולהשתמש טיפ פיפטה שונה שני 200 מיקרוליטר למקם organoids פינה באמצע המלבן. כדי למקם כיסוי להחליק מעל האורגנואידים, מניחים את הצד השמאלי של הכיסוי להחליק למטה הראשון, לפני לאט להוריד את החלקת המכסה משמאל לימין עד שאין אוויר לכוד. לאחר מכן יש להפעיל בעדינות לחץ על כל הקצוות של החלקת המכסה כדי לחבר אותו בחוזקה לאיטום הסיליקון.

כדי לדמיין את האורגנואידים, מקם את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל ובחר מטרה מרובת טבילה 25 X להדמיית קונפוקלים. הגדר את המיקרוסקופ להגדרות הרכישה המתאימות, ובחר כוח לייזר נמוך להפחתת הלבנת תמונות. השתמש במצב מחסנית Z כדי להגדיר את הגבולות העליונים של הקצה התחתון והגדר את גודל שלב Z בצורה מיטבית.

בעת הדמיית מבנים אורגנואידיים גדולים, או אורגנואידים מרובים יחד, השתמש במצב ריצוף עם חפיפה של 10%ומציין את אזור העניין. כאשר כל הפרמטרים נקבעו, השג ייצוג תלת-ממדי של ההדמיה בתוכנת ההדמיה ומטב את מאפייני הבהירות, החדות והעיבוד תלת-ממדי. לאחר מכן ייצאו תמונות RGB של התוצאות כקובצי TIFF.

החוזק של הדמיה 3D לעומת הדמיה 2D מאויר על ידי תמונות אלה של אורגנואידים בלוטת החלב של העכבר שנוצרו כפי שהודגם. השכבה המרכזית של האורגנואידים הייצוגיים הללו מורכבת מתאים זוהרים חיוביים בצורת טוראר K8/K18, והשכבה החיצונית מכילה תאי בזיליקום חיוביים מוארכים K5, אשר מסכמים מחדש את המורפולוגיה של בלוטת החלב ב- vivo. ארגון מקוטב זה מאתגר להעריך מקטע אופטי דו-מימדי של אותו אורגנואיד.

דוגמה נוספת למבנה מורכב שלא ניתן לפרש ללא מידע תלת מימדי היא רשת של CANALICULI חיובי MRP2 המאפשרים איסוף של נוזל מרה של אורגנואידים בכבד אנושי. יתר על כן, האיכות והרזולוציה המתקבלות מאפשרות פילוח וניתוח תמונה חצי אוטומטיים. לכן, מספרי תאים כוללים ונוכחות סמנים ניתן לכמת בתת-סוגים תאיים ספציפיים באורגנואידים שלמים.

על ידי פילוח הגרעינים של אורגנואיד שלם המכיל 140 תאים, ניתן לזהות שלושה תאים המציגים חיוביות גבוהה עבור סמן מחזור התא Ki67. סוכן סליקת אופטי, FUnGI, ביצועים טובים יותר לא ברור ניקוי פרוקטוז-גליצרול באיכות אות פלואורסצנטי עמוק בתוך אורגנואיד. עם FUnGI פינה אורגנואידים המדגימים עוצמת פלואורסצנטיות משופרת הכוללת לעומת אורגנואידים לא ברורים.

שים לב כי כל BME שאריות המדגם עלול לגרום חדירת נוגדנים מופחתת יכול להוביל אות רקע גבוה. בנוסף, אורגנואידים סיסטיק לא צריך להיות פינה אופטית אם הם מתמוטטים. עם התאמות קלות לפרוטוקול, ניתן להשתמש בדגימות עם מיקרוסקופיה קונפוקל, מולטי פוטון ונייר חום ברזולוציה גבוהה.