Name: הפגנת קשר ליניארי בין גורם גידול של כלי דם אנדותל והורמון מחלגיזציה בתמציות קליפת הכליה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: חקור את הקשר בין VEGF ל-LH בתמציות קליפת הכליה מפרות וחזירים באמצעות ELISA ורגרסיה ליניארית. שיטה זו מסייעת לחוקרים ללמוד על פיזיולוגיה כליתית ואנגיוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לקבוצת המטבחיים (Blissfield, MI) לאספקת הכליות של השור והכיצין. לא היה צורך במימון מענק למחקר זה.

במחקר זה לא נעשה שימוש בחיות או ניסויים.
1. טיפול ברקמה
<ol><li>להשיג כליות של שור ופורצין את כל הכליות מיד לאחר שטבח מתוך מטבחיים. . הובלה על קרח למעבדה</li>
	<li>עם הגעתם למעבדה, לשטוף כליות עם 50 מ ל של מלוחים קר הקרח-פוספט מואגור (PBS). חזור על שלב זה 2x כדי להסיר דם לחלוטין.</li>
	<li>לשמור על הכליות על קרח (או בקירור) עד חילוץ נוסף.</li>
</ol>2. חיתוך הכליות
<ol><li>השתמשו במספריים סטריליים, מלקחיים, סכין ומנות פטרי כדי לנתח את הכליות ולבלו את החלק הנדרש ברקמה.</li>
	<li>הכן מאגר לפירוק של ריפה לפני ניתוח בכליות. התמוססות 5 מ"מ, 0.5 M EDTA, 1 טריס M (pH = 8.0), NP-40 (מזהה + GEPAL CA-630), 10% נתרן deoxycholate, ו 10% SDS במים כפולים מזוקקים, ואז לערבב ביסודיות. להכניס למקרר את מאגר הליזה של ריפה כאשר לא בשימוש.</li>
	<li>בעדינות לחתוך את הכליה לחצי (משונן מישור) וחותכים פיסת רקמה (50-70 מ"מ2) מאזור הקליפה במרכז הכליה (שקילה 80-100 mg על ידי משקל רטוב).</li>
	<li>מטפחת את בלוק הרקמה לחתיכות קטנות בסכין כדי לסייע לתהליך המגון.</li>
	<li>לאחר להפוך את הרקמות, להעביר אותם צינור microfuge עם 1 מ ל של מאגר החילוץ הקרח קר 1x ריפה. הניחו את הצינורות בקרח עד לחילוץ נוסף.</li>
</ol>3. רקמת הומוגון
<ol><li>סמן את הצינורות הmicrofuge עם פרטים ספציפיים לדוגמה עבור אוסף הרקמה הסופרנטית.</li>
	<li>שימוש במכשיר כף יד עם בדיקה סטרילית, ולאחר מכן המגון את הרקמות עבור 1-2 דקות בתנאים קרים (דגימות על דלי קרח) עד שאין גושים של רקמות גלויים.</li>
	<li>נושא הרקמה תמציות מיד עבור צנטריפוגה ב צנטריפוגה בקירור ב 9,600 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.</li>
	<li>להסיר את הצינורות מהצנטריפוגה ולמקם אותם על דלי קרח.</li>
	<li>לאסוף את supernatant לתוך microfuge צינור חדש בתווית ולאחסן על הקרח. . להשליך את הגלולה</li>
	<li>הכינו מחזורי הפרדה נפרדים של סופרנטנים עבור LH ו-ובדיקות מקושרות-אנזים הקשורות לאנזימים (אליסה) וניתוח חלבון מוחלט, בהתאמה, כדי למנוע הקפאת ההפשרה.</li>
</ol>4. שור ו Porcine LH השיטת אליסה
<ol><li>אחסן את כל רכיבי שיטת ה-אליסה כלולים במערכת הורמון החלבית הזמינה מסחרית (LH) (ראה טבלת חומרים) ב-2-8 ° c. זה כולל את הנוגדן, HRP-המשלים, שיטת הפעולה (96 היטב), ככייל, מאגר לשטוף (20x להתרכז), מצע A, מצע B, ולעצור פתרון. הכן את כל הריאגנטים כפי שמומלץ על ידי הוראות היצרן.</li>
	<li>לפני תחילת השיטת, הביאו את כל הריאגנטים ואת הצלחת לטמפרטורת החדר (RT). השתמש במספר הדרוש של בארות לצורך השימוש באותו מספר, חותם ושמור על הבארות שאינן בשימוש ב-4 ° צ' עד לשימוש.</li>
	<li>דלל את מאגר הכביסה (15 מ ל של 20x להתרכז) עד 300 mL עם מים כפולים מזוקקים</li>
	<li>הגדר את הבארות הריקות ללא כל פתרון.</li>
	<li>הוסף 50 μL של תקן או מדגם לכל טוב (n = 2), ולאחר מכן להוסיף עוד 50 μL של חזרת peroxidase (hrp)-המשלים לכל טוב. מיד להוסיף עוד 50 μL של פתרון נוגדן לכל טוב. לאטום את הצלחת, לערבב היטב, ו הדגירה 1 h ב 37 ° c.</li>
	<li>לשטוף את הבארות עם מאגר לשטוף 1 x (200 μL/טוב) ולחזור 4x.</li>
	<li>הוסף 50 μL של מצע A ו-50 μL של מצע B לכל באר, ומערבבים היטב על ידי הקשה על הצלחת בצד בעדינות. אטום את הצלחת ואת הדגירה של 15 דקות ב 37 ° c בחושך במשך 15 דקות.</li>
	<li>הוסף 50 μL של פתרון להפסיק כל טוב, להקיש בעדינות על הצלחת, ולקרוא את הצלחת באמצעות הספקטרוסקופיה להגדיר 450 אורך גל ננומטר.</li>
	<li>לנרמל את השור ו חזירי רמות לחלבון מוחלט (ראה סעיף 6).</li>
</ol>5. שור ופורצין-שיטת אליסה
<ol><li>אחסן את כל רכיבי הזמינות של אליסה הכלולים במקדם הגדילה המסחרי והזמין של כלי הדם (ראה לוח חומרים) ב-2-8 ° c. זה כולל את הנוגדן, HRP-המשלים, שיטת הפעולה (96 היטב), ככייל, מאגר לשטוף (20x להתרכז), מצע A, מצע B, ולעצור פתרון. הכן את כל הריאגנטים כפי שמומלץ על ידי הוראות היצרן.</li>
	<li>לפני שמתחילים את האפשרות, להביא את כל הריאגנטים ואת הצלחת לשאת את לוחית. השתמש במספר הדרוש של בארות לצורך הצורך, לחתום ולשמור על הבארות שאינן בשימוש ב-4 ° צ' עד לשימוש.</li>
	<li>דלל את מאגר הכביסה (15 מ ל של 20x להתרכז) עד 300 mL עם מים כפולים מזוקקים</li>
	<li>הוסף 100 μL של התקן או מדגם לכל טוב (n = 2). לאטום את הצלחת, לערבב היטב, ו דגירה עבור 2 h ב 37 ° c.</li>
	<li>להסיר את הנוזל בכל באר ולהוסיף 100 μL של זיהוי מגיב A לכל טוב, לאטום את הצלחת, ו הדגירה עבור 1 h ב 37 ° c.</li>
	<li>לשטוף את הבארות עם מאגר לשטוף 1 x (400 μL/טוב) ולחזור 4x.</li>
	<li>הוסף 100 μL של זיהוי מגיב B לכל טוב ומערבבים היטב על ידי הקשה על הצלחת בצד בעדינות. אטום את הצלחת והטה את הצלחת 1 h ב 37 ° c.</li>
	<li>לשטוף את הבארות עם מאגר לשטוף 1 x (400 μL/טוב) ולחזור 4x.</li>
	<li>הוסף 90 μL של פתרון המצע לכל טוב, הקש בעדינות על הצלחת, ו-דגירה עבור 1 h ב 37 ° c.</li>
	<li>הוסף 50 μL של פתרון להפסיק כל טוב, להקיש בעדינות על הצלחת, ולקרוא את הצלחת באמצעות הספקטרוסקופיה להגדיר 450 אורך גל ננומטר.</li>
	<li>לנרמל את השור ואת מפלס הפרוטאין-A רמות לחלבון מוחלט (סעיף 6).</li>
</ol>6. שערוך חלבון סה
<ol><li>הערכת חלבון מוחלט של השור ואת תמציות כליות חזירי על ידי תקן באמצעות סרום שור סטנדרטי (bsa) באמצעות ערכה מסחרית (ראה טבלת חומרים) על פי המלצות היצרן.</li>
</ol>7. אנליזה סטטיסטית
<ol><li>לחשב את הממוצע, חציון, ואת סטיית התקן של כל האנליטה.</li>
	<li>בדוק את הסטייה של התפלגות המדגם מהרגיל ניצול קולמוגורוב-סמירנוף מבחן להחליט, על פי השימוש, בין פרמטרית לעומת. בדיקות סטטיסטיות לא פרמטרית. אם הנתונים מופצים בדרך כלל, לאחר מכן לבצע בדיקה סטטיסטית באמצעות בדיקות פרמטרית.</li>
	<li>בנסיבות מתאימות (כגון התפלגות נתונים נורמלית), לנצל מודלים רגרסיה כדי לבחון את הקשר הליניארי בין LH ו-והוא.</li>
</ol>

<ol><li>Advani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+VEGF+in+maintaining+renal+structure+and+function+under+normotensive+and+hypertensive+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).</li>
<li>Majumder, S., Advani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+the+diabetic+kidney%3A+More+than+too+much+of+a+good+thing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).</li>
<li>Liu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+kidney+leads+to+progressive+impairment+of+glomerular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).</li>
<li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li>
<li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor%3A+basic+science+and+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress.</a> Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).</li>
<li>Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+Levels+of+Luteinizing+Hormone+and+VEGF+are+Strongly+Correlated+in+Healthy+Mammalian+Eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes.</a> Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).</li>
<li>Babitha, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteinizing+hormone%2C+insulin+like+growth+factor-1%2C+and+epidermal+growth+factor+stimulate+vascular+endothelial+growth+factor+production+in+cultured+bubaline+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).</li>
<li>Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+Primate+Ovulatory+Follicle+Is+Stimulated+by+Luteinizing+Hormone+via+Prostaglandin+E2%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2.</a> Biology of Reproduction. 92 (1), 15(2015).</li>
<li>Movsas, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+Luteinizing+Hormone+%28LH%29+in+Living+Human+Vitreous+and+the+Effect+of+LH+Receptor+Reduction+on+Murine+Electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram.</a> Neuroscience. 385, 1-10 (2018).</li>
<li>Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+Signaling+by+the+Luteinizing+Hormone+Receptor+Reduces+Ocular+VEGF+and+Retinal+Vascularization+during+Mouse+Eye+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development.</a> Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).</li>
<li>Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+luteinizing+hormone%2Fchorionic+gonadotropin+%28LH%2FCG%29+receptor+precursor+in+a+human+kidney+cell+line+stably+transfected+with+the+rat+luteal+LH%2FCG+receptor+complementary+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA.</a> Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).</li>
<li>Lei, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+luteinizing+hormone%2Fhuman+chorionic+gonadotropin+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene.</a> Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).</li>
<li>Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF%29+in+renal+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology.</a> Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).</li>
<li>Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+mature+luteinizing+hormone+receptor+in+rodent+urogenital+and+adrenal+tissues+is+developmentally+regulated+at+a+posttranslational+level%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level.</a> Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).</li>
<li>Ondruschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-mortem+in+situ+stability+of+serum+markers+of+cerebral+damage+and+acute+phase+response%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response.</a> International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).</li>
<li>Swain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+post-mortem+interval%3A+A+comparison+between+cerebrospinal+fluid+and+vitreous+humour+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+and+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry.</a> Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).</li>
<li>Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+method+for+the+detection+of+residues+of+amphenicol+antibiotics+in+bovine%2C+ovine+and+porcine+kidney+by+optical+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor.</a> Talanta. 172, 120-125 (2017).</li>
<li>Konstantinou, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-Linked+Immunosorbent+Assay+%28ELISA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).</a> Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).</li>
<li>Levesque, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+urine+vascular+endothelial+growth+factor+levels+are+associated+with+mechanical+ventilation%2C+bronchopulmonary+dysplasia+and+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity.</a> Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).</li>
<li>Leviton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antecedents+and+early+correlates+of+high+and+low+concentrations+of+angiogenic+proteins+in+extremely+preterm+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns.</a> Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).</li>
<li>Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+vitreous+fluid+analysis+in+the+translational+research+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy.</a> Mediators of Inflammation. , 872978(2012).</li>
<li>Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+molecular+and+genomic+biomarkers+of+retinal+drug+efficacy%3A+use+of+ocular+fluid+sampling+to+evaluate+VEGF%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF.</a> Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).</li>
</ol>

מכון מחקר זיגצ'יק (ZRI) הוא מכון מחקר פרטי (למטרות רווח), וד ר תמי מובסאס (מייסד ומנהל ZRI) יש בקשות לפטנטים ופטנטים מאומתים לשימוש באנטטרופין היריבים בטיפול במחלות עינית וסוכרת. מלבד להיות עובד (ביוכימאי) ב ZRI, ד ר א. מותוסר אין קונפליקטים פיננסיים אחרים לדווח. א. אריבלאגן (מתמחה בקיץ ב ZRI, סטודנט לתואר ראשון באוניברסיטת מישיגן) אין קונפליקטים פיננסיים אחרים לדווח.

לרכישת כליות מהמטבחיים מיד לאחר מוות בעלי חיים הוא המפתח להצלחה במתודולוגיה זו. זהו היתרון העיקרי של ניצול איברים מפרות וחזירים במקום גופות אדם. בדרך כלל יש לפחות עיכוב של 12-24 h מזמן המוות עד שאיברי הגוף האנושיים מושגו. בגלל ההרכב הכימי של איברי הגוף משתנה באופן משמעותי בתוך 2 h לאחר המוות15,16, מחקרים בכליות האדם האנושי לא יכול לשקף את הנסיבות בחיים האמיתיים. למרות שהפרוטוקול מדגיש במידה ניכרת את חשיבות הרכישה המיידית והמיקום של איברי בעלי חיים על הקרח לאחר הח...

גורם הצמיחה של כלי הדם a ("וכדומה"), מסייע לווסת אנגיוגנזה וחדירות כלי הדם בכליות ובאיברים אחרים1,2 (להלן, המכונה "הנקרא" מכונה "כולי"). רמות הטיפול בכליה הן תחת שליטה הומאטית. כאשר רמות הכליות מוגברות או מדוכאים, הכליה עלולה להיות תקלה. לדוגמה, בתוך 3 שבועות לאחר הלידה, עכברים עם הטרוזיזטיות מיוחדות לפיתוח של ה-"ולפתח" אנדוקיזיס וכלי-דם (כלומר, נגעים כליות הנתפסים באקלמפסיה האנושית), וכישלון כליות בשלב הסופי מתרחש בהטרוזיטים אלה בגיל 3 חודשים. Podocyte הומוזיטים מסוימים מתים מפני הידרופס ואי ספיקת כליות בתוך יום אחד של לידה3,4.
מצד שני, ביטוי יתר של כליות הכליות גורם פרוטאינוריה ו-היפרפרפיה של הכליה3,4. לדוגמה, ארנבים טרנסגניים המבטאים את התצוגה המתקדמת של התערוכה מתקדמת באמצעות שיעורי סינון מוגברים בשלבים המוקדמים של נפרופתיה, ואחריו שיעורי סינון מופחת בשלבים מאוחרים יותר3. סוכרת כליירופאתי, הגורם העיקרי של מחלת הכליה בשלב הסופי אצל מבוגרים סוכרתית, הוא מקושר באופן משמעותי עם התקנה ברמה2,5. הרבה תשומת לב שולמו לתפקיד של היפוקסיה בגרימת ביטוי ה-, בתנאים פתולוגיים5. עם זאת, הגורמים השולטים במצב הפיזיולוגי (הן בכליה והן באיברים אחרים) אינם מובנים היטב2,6. זיהוי גורמים אלה (למעט חמצן) המעורבים ברגולציה הפיזיולוגית והפתולוגית היא משימה חשובה.
הורמון מחלפף (LH), הורמון פרו-אנגיוגנטי, מסייע לווסת את הביטוי הפיזיולוגי באברי הרבייה כגון השחלה והטנות7,8. מחקרים קודמים סיפקו ראיות כי LH גם עוזר לווסת את הגוף באיברים שאינם רבייה, כגון העיניים6,9,10. קולטנים LH מצויים לשד הקליפה של הכליה11,12. של הערה, כליה תאים אפיתל הכרישים, כמו גם את הקולטן LH, אקספרס וואפ11,12,13,14. לוקחים את שני התצפיות האלה יחד, אנו שיערו כי LH גם עוזר לווסת את הביטוי והוא בכליה13,14. כדי לספק ראיות של הקשר LH/מערכת זו, הפרוטוקול המוצג שואפת להראות כי רמות LH מסוגלים לנבא רמות של הכליה. מספר רב של חקירות קודמות הקשורות בכליות השתמשו במודלים היונקים הנמוכים ביותר (כלומר, מכרסמים וארנבים)2. כדי לתרגם את העבודה הזאת לגוף האנושי, המחקר בוחן את היחסים בין ומעלה LH ביותר יונקים בסדר גבוה (כאן, שור מודלים חזירי). כדי לבצע מטרה זו, חלבון מוחלט ליפוסט היה מוכן באזור קליפת המוח של שור וכליות חזירי.

<table><tbody><tr><td>ערכת בקר LH ELISA</td><td>MyBiosource, סן דייגו, קליפורניה.</td><td></td><td></td>MBS700951</tr><tr><td>Bovine VEGF-A ELISA KIT</td><td>MyBiosource, סן דייגו, קליפורניה.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון מיקרו BCA</td> MBS2887434 <td>ThermoFisher Scientific Inc, קולומבוס, אוהיו.</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>ערכת חזיר LH ELISA</td><td>MyBiosource, סן דייגו, קליפורניה.</td><td></td><td></td>MBS009739</tr><tr><td>חזיר VEGF-A אליסה</td><td>ריי ביוטק, נורקרוס, ג'ורג'יה.</td><td>ELP-VEGFA-1</td><td></td></tr><tr><td>RIPA מאגר ליזה ומיצוי</td><td>ThermoFisher Scientific Inc, קולומבוס, אוהיו.</td><td>89901</td><td></td></tr></tbody></table>

הפגנת קשר ליניארי בין גורם גידול של כלי דם אנדותל והורמון מחלגיזציה בתמציות קליפת הכליה

Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts

גורם הגדילה של כלי הדם (מסייע) לשלוט באנגיוגנזה ובחדירות כלי הדם בכליה. הפרעות כליות, כגון כלייתית סוכרתית, משויכות לדיסתקנה של הכליות. הגורמים השולטים ב-, בתנאים הפיזיולוגיים בכליות, אינם מובנים היטב. הורמון מחלפף (LH), הורמון פרו-אנגיוגנטי, מסייע לווסת את הביטוי הפיזיולוגי באברי הרבייה. בהינתן כי קולטני LH נמצאים בכליה, אנחנו, במכון מחקר זיגצ'יק, שיערו כאן כי LH גם מסייע לווסת את הביטוי בכליה כמו גם. כדי לספק ראיות, כיוונו להראות כי רמות LH מסוגלים לנבא רמות של היונקים בכליה. רוב החקירות הקשורות לנושא הכרוך בכליות השתמשו ביונקים בעלי סדר נמוך יותר כמודלים (כלומר, מכרסמים וארנבים). כדי לתרגם את העבודה הזאת לגוף האנושי, הוחלט לבחון את הקשר בין המערכת הבין הגדולה לבין ה-LH לבין יונקים בעלי סדר גבוה יותר (קרי, מודלים של שור ופורצין). פרוטוקול זה משתמש בחלבון מוחלט. מקליפת הכליה המפתחות להצלחת שיטה זו כוללים רכש של כליות מחיות מטבחיים מיד לאחר המוות, כמו גם נורמליזציה של רמות אנליטה (בתמצית הכליה) על ידי חלבון מוחלט. מחקר זה ממחיש בהצלחה קשר ליניארי משמעותי בין LH ו-ובהן כליות השור ו חזירי. התוצאות מתוכונות. בשני זנים שונים המחקר מספק הוכחות תומכות כי השימוש בתמציות כליות מפרות וחזירים הם משאב מעולה, חסכוני, ושופע לחקר הפיזיולוגיה של הכליות, במיוחד עבור בחינת הקורלציה בין מנתחי ה-, והאנליטים אחרים.

רמות ממוצע וחציון של LH ו-ומסוג בעלי חיים מופיעים על ידי סקס מוצגים בטבלה 1. לאחר אימות נורמליות של נתונים על ידי Kolmogorov-סמירנוף בדיקות של נורמליות, מודלים רגרסיה לינארית היו מנוצלים כדי לבחון את הקשר בין LH ו-מודל. LH נמצאה להיות מנבא חזק ומשמעותי של ובהן הכליות שור ו חזירי (מודל כליות של שור: n = 7, R2 = 0.86, p = 0.002; חזירי מודל הכליה: n = 7; R2 = 0.66, p = 0.025).
הקשר הליניארי LH...

מוצג כאן הוא פרוטוקול לניצול הכנה לתמצית כליה קליפת הכליה ונורמליזציה חלבון מוחלט כדי להדגים את הקורלציה בין גורם הצמיחה של כלי הדם והורמון החלמיזציה בכליות היונקים.

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic ...

הפרוטוקול שלנו מבחין כי השימוש בתמציות כליות מפרות וחזירים הוא משאב מצוין וחסכוני לחקר פיזיולוגיה של הכליות, במיוחד בחינת המתאם בין גורם הגדילה ה אנדותל כלי הדם ואנליטים אחרים. זה תמיד היה אתגר לתאם VEGF, גורם גדילה חיוני אנגיוגנזה איברים, עם חלבונים אחרים. טכניקה זו מאפשרת לנו לבחון את הקשר בין VEGF ו analytes כגון הורמונים.זה בהחלט יקדם את בסיס הידע שלנו לגבי גורם גדילה חשוב זה. שיטה זו עשויה להיות שימושית עבור מתאם analytes אחרים תמציות קליפת המוח הכליה מלבד אלה שהוזכרו בסרטון זה. הדגמה חזותית תסייע לאחרים להשיג תוצאות לשחזור ללא שגיאות דגימה.השימוש ברקמה טרייה חיוני להצלחת טכניקה זו. חשוב להשיג כליות שלמות טריות מיד לאחר השחיטה מבעל חיים. תמיד להעביר את הרקמה למעבדה על קרח.השתמש מספריים סטריליים, מלקחיים, סכין, וצלחות פטרי לנתח כליות ולגלות את החלק הנדרש רקמה. חותכים בעדינות את הכליה לחצי לאורך מישור הסגיטל וחותכים חתיכת רקמה מאזור קליפת המוח במרכז הכליה. טחון את הרקמה לחתיכות קטנות עם הסכין ולהעביר אותו לתוך צינור microfuge עם מיליליטר אחד של קרח קר 1X RIPA מאגר החילוץ תיזה.סמן את הצינור עם פרטים לדוגמה ספציפיים והצב אותו על קרח. השתמש homogenizer כף יד עם בדיקה סטרילית כדי הומוגניזציה של הרקמה במשך 1 עד שתי דקות עד שלא נראים גושים, ואז מיד צנטריפוגה הצינור ב 9, 600 פעמים גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, להכין aliquots נפרדים של המדגם עבור ELISA וניתוח חלבון הכולל, כדי למנוע מחזורי הקפאה / הפשרה מרובים.לפני תחילת הבדיקות, הביאו את כל חברי ההנהלה ואת צלחת ההתזה לטמפרטורת החדר תוך הסרת הבארות העודפות ואחסוןן בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. מדללים את חיץ הכביסה 20X ל-300 מיליליטר במים מזוקקים כפולים ומגדירים את בארות הריקות ללא כל פתרון. הוסף 50 microliters של תקן או מדגם ועוד 50 microliters של חזרת peroxidase חידה לכל באר, ואז מיד להוסיף 50 microliters של פתרון נוגדנים לכל באר ולאטום את הצלחת.מערבבים את הצלחת ו דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, לשטוף כל באר עם 200 microliters של חיץ לשטוף. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של מצע A ומצע B לכל באר, מערבבים את הצלחת בעדינות על ידי הקשה על הצד, ואז לאטום ולהדגר אותו בחושך במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.הוסף 50 מיקרוליטרים של פתרון עצירה לכל באר. הקישו בעדינות על הצלחת וקראו את הספיגה ב-450 ננומטר עם ספקטרופוטומטר. מכינים את הריג'נדים ושוטפים את המאגר כפי שתואר קודם לכן, ואז מוסיפים 100 מיקרוליטרים סטנדרטיים או מדגמים לכל באר, אוטמים את הצלחת, מערבבים היטב ודגירים אותה במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.הסר את הנוזל בכל באר ולהוסיף 100 microliters של reagent זיהוי A.Seal את הצלחת דגירה זה עוד שעה. לאחר מכן, לשטוף כל באר עם 400 microliters של חיץ לשטוף, ולאחר מכן להוסיף 90 microliters של פתרון מצעים לכל באר, בעדינות הקש על הצלחת, ו דגירה זה עוד שעה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה האחרונה, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של פתרון עצירה לכל באר, הקישו בעדינות על הצלחת וקראו את הספיגה ב-450 ננומטר עם ספקטרופוטומטר.להעריך את החלבון הכולל של תמציות כליות חזיר וחזיר עם בדיקה סטנדרטית BSA ולהשתמש בהערכה זו כדי לנרמל את התוצאות LH ו VEGF-A-ELISA. הרמות הממוצעות והחציון של LH ו- VEGF חושבו עבור בעלי חיים ומינים. לאחר אימות הנורמליות של נתונים, מודלים רגרסיה ליניארית נוצלו כדי לבחון את הקשר בין LH ו VEGF.LH נמצאה כמנבאת חזקה ומשמעותית של VEGF בכליות חזיר וחזירים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לדגום אזורים זהים בכל רקמה. הליך דומה יכול לשמש כדי לחלץ כל סוג של רקמה.זכור לנרמל אנליטים על ידי תמצית חלבון הכולל של כל רקמה שאתה משתמש.

demonstrating-linear-relationship-between-vascular-endothelial-growth

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים המבדק פשוט מבוססי תאים לזיהוי, כימות לפקח על פעילות בני משפחת פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם של הליגנדים. את assay משתמש קולטנים chimeric לידי ביטוי קו תא גורם תלוי לתת הערכה וכמותיות או הכמות של קולטן מחייב cross-linking ידי ליגנד.

מבדק פשוט עבור הערכת גורמי הגדילה של אנדותל כלי דם

כתב יד זה מתאר בדיקת היווצרות צינור כדי לכמת את ההשפעות של תרכובת או מצב נתון על אנגיוגנזה על ידי שימוש בהיווצרות צינור תא אנדותל בסביבה מבוקרת.

Assay גיבוש האנדותל תא Tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- Growth Factor מופחתת מטריקס

בנוסף, לשימוש בתרופות עבור התאוששות של תפקוד כליות מחייב שליטה של ​​הלוקליזציה וההפצה של המתחם הטיפולי. כאן אנו מתארים בפרוטרוט טכניקה פשוטה למסירת intrarenal של סמים בחולדות. הליך זה עשוי להתבצע בקלות ללא תמותת שחזור גבוה.

משלוח intravascular של מוצרים ביולוגיים לכליה עכברוש

פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר של מחלת glomerular. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

כאן אנו מציגים פרוטוקול דגימה דם הזנב-טיפ לאיסוף הדגימה תכופים בעכברים ערככם. שיטה זו שימושית עבור להערכת דפוסי הפרשת הורמון מחלמן פועמת, יכול להיות מותאם ניתוח גורמים אחרים במחזור.

תכופות לקיחת דמים קצה הזנב בעכברים להערכה של הפרשת הורמון מחלמן פועמת

הורמון מגרה זקיק (FSH) ברקמות ואיברים חוץ-גונדליים שונים קשור לפתוגנזה של מחלות מרובות. ניתן להשתמש במודל העכבר שעבר כריתת שחלות וטיפול ב- FSH (OVF) כדי לחקור את הפעולות החוץ-גונדליות של FSH.

חקר השפעות עצמאיות של הורמון מגרה זקיקים in vivo במודל עכבר

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים המפרטים הוראות ליישום תרביות תאים תלת-ממדיות באמצעות מטריצות קולגן וקולגן-אגרוז במערכת מיקרופיזיולוגית. פרוטוקולים אלה תומכים בתרבית משותפת של צינורית הכליה הפרוקסימלית וקרצינומה של תאי הכליה, המדמים תנאי in vivo ומאפשרים חקירה מתקדמת של אינטראקציות בין תאי סרטן הכליה.

תרבית משותפת מיקרופלואידית של אפיתל כליות בריא וגידול למודל התקדמות סרטן הכליה

וידאו זה מדגים שתי שיטות להכנת והצבת חרוזים, אשר היה מצופה גורם הגדילה, על explants של קליפת המוח המתפתח. חרוזים אלה יכולים לשמש כדי לעורר ביטוי גנים מוגבל מרחבית על פיתוח רקמות עצביות כגון explants forebrain. שיטות ניתנים לשימוש הן Affi-Gel חרוזים חרוזים acryllic הפרין.

פקטור מצופה צמיחה השמה ביד על Explants forebrain הגבי

קיים מגוון של גורמי גדילה וחלבונים אינטראקציה לגרום לתאים לקחת על גורלות תאים שונים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מדגימים את השימוש כהכנה אובו לכתובת האינטראקציות האפשריות בין חלבונים שונים בהתפתחות ידי הצבת חרוזים על E2.5 עוברי אפרוח.

הצבת פקטור מצופה חרוזים צמיחה על עוברי תרנגולת בשלב מוקדם

אנו מתארים את הכנת גורם תא T צמיחה המשמש הרחבה של מבחנה של אנטיגן ספציפי לערמונית קווי עכברוש T לימפוציטים.

הכנת פקטור T צמיחת תאים מן Splenocytes עכברוש

חקור את הקשר בין VEGF ל-LH בתמציות קליפת הכליה מפרות וחזירים באמצעות ELISA ורגרסיה ליניארית. שיטה זו מסייעת לחוקרים ללמוד על פיזיולוגיה כליתית ואנגיוגנזה.

הפגנת קשר ליניארי בין גורם גידול של כלי דם אנדותל והורמון מחלגיזציה בתמציות קליפת הכליה

גלה סרטונים נוספים