Name: LarvaSPA, שיטה להרכבה ממושכת על זחל לטווח ארוך הדמיה לזמן קצר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: חקור את שיטת LarvaSPA להדמיה חיה ממושכת של זחלי Drosophila ליותר מעשר שעות. שיטה זו מאפשרת מחקר של תהליכים תאיים דינמיים בנוירונים תחושתיים היקפיים ובפיתוח דנדריטים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לינופנג טאנג להקמת גרסה מוקדמת יותר של שיטת LarvaSPA; גלן סוואן באוניברסיטת קורנל אולין הול מכונת להכנת אבות טיפוס מוקדם של חדר ההדמיה; פיליפ איסרמן לבניית מסגרות מתכת ולמתן הצעות על הכנת cuboids PDMS; קורנל BRC הדמיה מתקן לגישה מיקרוסקופים (ממומן על ידי NIH גרנט S10OD018516); מריה סעיד על הקריאה. הקריטית של כתב היד עבודה זו נתמכת על ידי מלגת קורנל הוענק ל-H.J.; קרן הסטארט-up של קורנל ומענקי NIH (R01NS099125 ו-R21OD023824) הוענקו ל C.H. H.J. ו C.H. הגה את הפרויקט ועיצב את הניסויים. H.J. ערכו ניסויים. ה. ג. ו. C.H. כתב את כתב היד.

1. הפיכת חדר ההדמיה לתמונה
<ol><li>ניתן לבנות את מסגרת המתכת מבלוק אלומיניום בחנות מכונות טיפוסית. המפרט של המסגרת מומחש באיור 1א.</li>
	<li>כדי לבנות את חדר ההדמיה, לאטום את החלק התחתון של מסגרת מתכת באמצעות coverslip ארוך (22 מ"מ x 50 מ"מ) ו-UV דבק (איור 1א). מרפאים את הדבק UV באמצעות מנורת UV שנערך ביד.</li>
</ol>2. ביצוע pdms קובוידס
<ol><li>הכן את העובש. לגבי cuboids של PDMS<ol>
<li>צרף שכבות של נייר אריזה למשטח הפנימי של מלבני (80 מ"מ x 55 מ"מ) צלחת פטרי או לוח עגול התרבות התאים. השתמש בשכבה אחת (0.063 מ"מ עבה) עבור הזחלים השני, 2 שכבות (0.126 מ"מ עבה) עבור הזחלים השלישי מוקדם, או שלוש שכבות (0.189 מ"מ עבה) עבור הזחלים השלישיהראשון העשרה (איור 1B).</li>
		<li>חותכים את הקלטת לרצועות של רוחב ספציפי עם להב תער: 1.5 mm עבור הקלטת 1-layer, ו-2 מ"מ עבור קלטת 2-שכבה או 3-שכבה. רוחב ועובי של הרצועה יקבע את גודל הזחלים כי קוביות PDMS הסופי יכול להחזיק. השאירו לפחות מרווח של 5 מ"מ בין שתי הרצועות. הסר את שכבות הקלטת המכסות את השטח (איור 1B).</li>
		<li>להסיר אבק מהמשטח הפנימי של הצלחת באמצעות סרט דביק. . העובש מוכן לשימוש</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן את תמהיל ה-PDMS.<ol>
<li>מערבבים 7 גרם של בסיס PDMS ו 0.7 g של ריפוי סוכן (10:1 יחס) ביסודיות במיכל קטן.</li>
		<li>מניחים את המיכל בתוך ואקום desiccator לפחות 15 דקות כדי להסיר את האוויר מן התערובת.</li>
		<li>לאט למזוג כ 5.5 g של התערובת PDMS על התבנית כדי להגיע לעובי של 1 – 2 מ"מ (איור 1B).</li>
		<li>מניחים את התערובת PDMS ב ואקום desiccator שוב לפחות 15 דקות כדי להסיר את בועות האוויר הנותרים מן התערובת. לשבור את הבועות האחרונים עם טיפ פיפטה.</li>
		<li>לרפא את PDMS על משטח שטוח בחממה חום ב 65 ° c עבור 2 h.</li>
		<li>השתמש להב גילוח כדי לשחרר את PDMS נרפא לאורך קצה העובש ולנתק אותו מן העובש. אחסן את ה-PDMS בין שתי פיסות נייר דביק גדול בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>עבור הזחלים השלישי מוקדם ומאוחר, לחתוך את pdms לתוך 8 מ"מ x 2 מ"מ x 1 מילימטר קובוידס (לאורך הקווים מנוקד באיור 1B) על-ידי מיקום החריץ שנוצר על-ידי רצועת הקלטת (step 2.1.2) במרכז הצד הארוך של התיבה (איור 1ב, ג). עבור הזחלים השני, לחתוך את התיבה כדי 8 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הרכבה הזחלים לאורך זמן להדמיה לטווח ארוך
<ol><li>הכינו את הכיסויים העליונים להרכבה.<ol>
<li>לבחור שש pdms קובוידס עם חריצים התואמים את הגדלים של הזחלים. בצע את החריץ והגודל המומלצים של PDMS בהתבסס על שלבים 2.1.1, 2.1.2 ו2.2.7.</li>
		<li>להסיר אבק מהמשטח של PDMS עם קלטת דביק.</li>
		<li>צרף ארבע חתיכות של קלטת כפולה (12 מ"מ x 5 מ"מ) על שמיכות ארוך (22 מ"מ x 50 מ"מ) לתיקון קובוידס pdms מאוחר יותר. הרווחים בין שתי הפרוסות של הסרט הכפול אמורים להיות זהים לרוחב החריץ של PDMS.</li>
		<li>החל טיפה קטנה (~ 1.2 μL) של דבק UV לתוך החריץ של כל אחד מקוביות ה-PDMS והוסף שש טיפות קטנות של דבק UV לחלל שבין הקלטת הכפולה על הכיסויים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>. הכן את הזחלים להרכבה<ol>
<li>באמצעות זוג מלקחיים, לנקות את הזחלים במים כדי להסיר מזון מפני השטח של הגוף.</li>
		<li>הניחו את הזחלים הנקיים על פיסת נייר קטנה של רקמה מצומצמת בצלחת פטרי קטנה (35 מ"מ) ללא מכסה. מניחים את צלחת פטרי קטנה לתוך גדול (60 מ"מ) צלחת פטרי המכילה פיסת נייר טישו יבש. בשכונה כימית, להחיל 8 – 12 טיפות (160-240 μL) של isof, על נייר הרקמה היבשה באמצעות הצנרת פלסטיק העברת ולסגור את המכסה של צלחת פטרי גדול.</li>
		<li>המתן 2 – 3 דקות תוך ניטור הזחלים. להוציא את הזחלים מהצלחת פטרי גדולה פעם ווים הפה שלהם להפסיק לזוז.</li>
	</ol>
</li>
	<li>. הר החיות<ol>
<li>כדי מבני התמונה בצד השני של החיה, מניחים את הזחלים מקיבוע על הדבק UV בין הקלטת הדו על הכיסויים עם הקוטיקולה הצדדית מול הכיסויים.</li>
		<li>לכסות כל זחל עם בלוק PDMS ולהתאים את המטען של הזחל לתוך החריץ של PDMS. השאר את הראש ואת זנב הזחל מחוץ לחריץ PDMS. הימנע מחסימת הנושפות של הזחל על ידי הדבק.</li>
		<li>לחץ על קצות הבלוק של PDMS אל הקלטת הכפולה מבלי להחיל כוח על החריץ. משוך בעדינות את זנב הזחל כדי לשטח את הקוטיקולה מתחת ל-PDMS.</li>
		<li>לרפא את הדבק UV עבור 4 דקות באמצעות מנורת UV מוחזק ביד בסביבה גבוהה (על 0.07 mW/mm2). התראה: הגן על העיניים עם משקפי הבטיחות בעת שימוש במנורת UV.</li>
		<li>הפוך את הכיסויים הפוכים וחזור על שלב 3.3.4.</li>
		<li>מויסטן חתיכה קטנה של נייר עדשה (15 מ"מ x 30 מ"מ) עם 20 μL – 30 μL של מים. הציבו את נייר העדשה ההרטיב בתחתית חדר ההדמיה (איור 1א, ד).</li>
		<li>הניחו את הכיסויים על החדר כדי שזחלים יהיו מול החלק הפנימי של החדר. לדבוק שני הקצוות של שמיכות למשטח המתכת באמצעות דבק UV (איור 1A, D). הצד השני של הזחלים מוכן להדמיה במיקרוסקופ קונפוקלית וקד (איור 1E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הדמיה
<ol><li>הזחלים של התמונה עם המיקרוסקופ המתאים. כל התוצאות המוצגות בפרוטוקול זה (איור 2, איור 3, וידאו S2, S3 וידאו, ו- video S4) נרכשו באמצעות מערכת קונפוקלית וקד עם 40x (1.30 NA) מטרת הנפט.</li>
</ol>5. השחזור של חדר הדמיה pdms קובוידס
<ol><li>לאחר הדמיה, להסיר את השמן על שמיכות העליון באמצעות נייר עדשה. לנתק את שמיכות העליון מתוך מסגרת מתכת על ידי חיתוך לחלל בין שמיכות ומסגרת מתכת עם להב תער. . חדר ההדמיה מוכן לשימוש חוזר</li>
	<li>לנתק את קובוידס pdms מתוך coverslip העליון עם מלקחיים. גלגל את קובוידס pdms על סרט דביק כדי להסיר שאריות דבק אבק. קובוידס pdms מוכנים לשימוש חוזר.</li>
</ol>

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).</li>
<li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+site-specific+changes+of+glutamate+receptor+composition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).</li>
<li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li>
<li>Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+axonal+trafficking+via+a+novel+live-imaging+technique+reveals+distinct+hedgehog+transport+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics.</a> Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+immunostaining+of+hemocyte+compartments+in+Drosophila+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging.</a> PLoS One. 9 (6), 98191(2014).</li>
<li>Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-driven+membrane+markers+for+analysis+of+nonautonomous+mechanisms+reveal+neuron-glia+interactions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direction+Selectivity+in+Drosophila+Proprioceptors+Requires+the+Mechanosensory+Channel+Tmc%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc.</a> Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).</li>
<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism%2C+segment%2C+and+somatic+body+wall+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li>
<li>Vaadia, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Proprioceptive+System+Dynamics+in+Behaving+Drosophila+Larvae+Using+High-Speed+Volumetric+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy.</a> Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).</li>
<li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50998(2014).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+imaging+chamber+for+in+vivo+imaging+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junctions+to+study+synapse+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+intact+Drosophila+larvae+at+sub-cellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (43), e2249(2010).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).</li>
<li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+depresses+glutamate+release+by+reducing+neuronal+excitability+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction.</a> The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).</li>
<li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+reduces+excitability+of+Drosophila+larval+motoneurons+by+activating+a+hyperpolarizing+leak+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance.</a> Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).</li>
<li>Chaudhury, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+chip+cryo-anesthesia+of+Drosophila+larvae+for+high+resolution+in+vivo+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li>
<li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li>
<li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134 (1), 55-64 (2007).</li>
<li>Poe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+space-filling+requires+a+neuronal+type-specific+extracellular+permissive+signal+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Drosophila+sensory+neuron+axons+and+dendrites+is+regulated+by+the+Akt+pathway+involving+Pten+and+microRNA+bantam%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam.</a> Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).</li>
<li>Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrite+injury+triggers+DLK-independent+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration.</a> Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).</li>
<li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+Externalization+Results+from+and+Causes+Neurite+Degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).</li>
<li>Desjardins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Awake+Mouse+Imaging%3A+From+Two-Photon+Microscopy+to+Blood+Oxygen+Level-Dependent+Functional+Magnetic+Resonance+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%3A+Cognitive+Neuroscience+and+Neuroimaging%22%5BJournal%5D)">Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging.</a> Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+brain+imaging+in+live+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies.</a> Nature Communications. 9 (1), 872(2018).</li>
<li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures%3A+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

כאן אנו מתארים LarvaSPA, שיטה רב-תכליתית של הרכבה חיה דרוזופילה לחיות לטווח ארוך הדמיה הזמן. שיטה זו אינה דורשת החלמה או הרכבה מחדש של זחלים, המאפשרים הדמיה ללא הפרעה. לכן הוא אידיאלי למעקב אחר תהליכים ביולוגיים שייקח שעות להשלים, כגון ניוון דנדט והתחדשות. שיטה זו יכולה לשמש גם עבור הדמיה הדינמיקה הסידן תאיים ואירועים subcellular כגון צמיחה מיקרוטודורית. כאשר קיר גוף הזחל יציב במהלך ההדמיה, את הרזולוציה המרחבית והטמפורלית ניתן לכוונן כדי להתאים את יישום ההדמיה בהישג יד (למשל, כדי לעקוב אחר תנועת subcellular מהיר...

הדמיה בזמן ההדמיה החיה היא שיטה רבת-עוצמה ללימוד תהליכים סלולאריים דינמיים. המידע המרחבי והזמני המסופק על ידי סרטים בזמן קפיצה יכול לחשוף פרטים חשובים למענה לשאלות בביולוגיה של התא. הזחל Drosophila ילה היה פופולרי במודל vivo לחקירות באמצעות הדמיה חיה, כי קיר הגוף השקוף שלה מאפשר הדמיה לא פולשנית של מבנים פנימיים1,2. בנוסף, כלים גנטיים רבים זמינים ב Drosophila ילה כדי fluorescently תווית מבנים אנטומיים ו3. עם זאת, הדמיה לטווח ארוך של הזחלים של דרוזוהילה מאתגרת. בשונה מעוברים מוקדמים נייחים או מגלמים, הזחלים דרוזופילה מתרחקים כל הזמן, ומצריכות הדמיה חיה. דרכים יעילות לשתק את הזחלים החיים בדרוזוהילה כוללים הרכבה בשמן הלוגן עם כלורופורם4, הרדמה באמצעות התמיסה Isof, או dichlorvos5, ודחיסה בין הכיסויים לבין שקופית המיקרוסקופ6. למרות שחלק מהשיטות הללו שימשו למיקרוסקופיה, אף אחד מהם אינו יעיל להדמיה חיה לטווח ארוך. שיטות אחרות פותחו עבור הדמיה קיר גוף נוירונים בזחלים זוחלים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית יקרוסקופית קונבנציונאלי אוהאור גיליון מיקרוסקופ 7,8,9. עם זאת, שיטות אלה אינן אידיאליות לניטור הדינמיקה התאית בשל התנועה של הזחלים.
שיטות חדשות פותחו על מנת להשיג הדמיה ארוכת טווח של הזחלים של דרוזוהילה . באמצעות שימוש פולידימיתיל siloxane (PDMS) "זחל", הזחלים Drosophila ילה ניתן להשתמש ביעילות באמצעות שאיבה שנוצר על ידי ואקום במיקרו בחדר מיוחד בלי לרפוטיזציה. עם זאת, שיטה זו אינה מציעה רזולוציה גבוהה בזמן עבור לימודי הביולוגיה של התא והיא בעלת מגבלות קפדניות על מידה10של בעלי חיים. שיטה נוספת המשתמשת במכשיר ההרדמה השיגה הדמיה חיה של הזחלים של דרוזופילה בנקודות זמן מרובות, והחלה לחקור את הצמתים הנוירוקולסטיים11,12,13,14,15,16. עם זאת, שיטה זו אינה מאפשרת הדמיה רציפה במשך יותר מ -30 דקות ודורשת שימוש בדפלוראנה שוב ושוב, אשר יכול לעכב את הפעילות העצבית ולהשפיע על התהליך הביולוגי שנלמד17,18. לאחרונה, שיטה חדשה המשלבת התקן microflu, וקריוהרדמה השתמשו כדי לשתק את הזחלים בגדלים שונים לפרקי זמן קצרים (דקות)19. עם זאת, שיטה זו מחייבת התקנים מיוחדים כגון מערכת קירור, ופרקי זמן ארוכים יותר דורשים צינון חוזר ונשנה של הזחלים.
כאן אנו מציגים שיטה רב-תכליתית של הזחלים דרוזופילה שתואם לדימות זמן ממושך של הדמיה במשך יותר מ -10 שעות. שיטה זו, אשר אנו מכנים "ייצוב זחל על ידי קובץ מצורף חלקית" (LarvaSPA), כרוך שמירה על העור הזחל לתוך coverslip עבור הדמיה בחדר הדמיה בנוי אישית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להפוך את חדר ההדמיה וכיצד לטעון זחלים במגוון שלבים התפתחותיים. בשיטה LarvaSPA, מקטעי הגוף הרצוי מודבקת את שמיכות באמצעות דבק UV-תגובתי. בנוסף, מתחיל הלחץ על הזחלים של PDMS, מניעת בריחה. האוויר והלחות בחדר ההדמיה מבטיחים את הישרדותם של הזחלים המוחדרים חלקית במהלך ההדמיה. היתרונות של LarvaSPA על טכניקות אחרות כוללים את הפעולות הבאות: (1) זוהי השיטה הראשונה המאפשרת הדמיה מתמשכת של הזחלים הדרוזופילה שלמים במשך שעות עם הזמן הגבוה והרזולוציה המרחבית; (2) לשיטה יש פחות הגבלות על גודל הזחל; (3) חדר ההדמיה ו-pdms קובוידס יכול להיות מיוצר בעלות מינימלית הם לשימוש חוזר.
בנוסף לתיאור שיטת הרכבת הזחל, אנו מספקים מספר דוגמאות של היישום שלה לחקר התפתחות הדנדריטים ו הדנדריטים מניוון של דרוסופילה הדנדריטים הדנדריזציה (da) נוירונים.

<table><tbody><tr><td>6061 מוטות אלומיניום</td><td>מקמאסטר-קאר</td><td>9246K421</td><td></td></tr><tr><td>3M סרט דו צדדי</td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>16093</td><td></td></tr><tr><td>סרט אריזה סקוטי 3M</td><td></td><td></td> 3M <td>1.88 אינץ' רוחב x 22.2 יארד</td></tr><tr><td>DUMONT #3 מלקחיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-241-34</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>Azer Scientific</td><td>1152250</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Midwest Veterinary Supply</td><td>193.33161.3</td><td></td></tr><tr><td>Leica Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td>SP8 מצויד בתהודה </td><td></td>סורק</tr><tr><td>נייר עדשה</td><td>ברקשייר</td><td>LN90.0406.24</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי (בינוניות)</td> <td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי (קטנות)</td> <td>VWR</td><td>10799-192</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>טד פלה, בע"</td>מ<td>121-20</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי מלבנית</td><td>VWR</td><td>25384-322</td><td></td></tr><tr><td>ערכת SYLGARD 184 (ערכת PBMS)</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>24236-10</td><td></td></tr><tr><td>העברת פיפטה</td><td>תרמו פישר 1371126</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדעי דבק UV</td><td>מוצרי נורלנד</td> <td>#6106, NOA 61</td><td>מקדם שבירה 1.56</td></tr><tr><td>מנורת UV (Workstar 2003)</td><td>Maxxeon</td><td></td><td></td>MXN02003</tr><tr><td>מייבש ואקום</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>71232</td><td></td></tr><tr><td>מגבונים</td><td>קימברלי-קלארק</td><td>Kimwipes</td><td></td></tr></tbody></table>

larvaspa, שיטה להרכבה ממושכת על זחל לטווח ארוך הדמיה לזמן קצר

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

הדמיה חיה היא גישה רבת ערך לחקירת שאלות בביולוגיה של התאים. הזחל של דרוזוהילה מתאים במיוחד להדמיה vivo חיה, משום שהקיר של גוף הזחל והאברים הפנימיים ביותר הם שקופים. עם זאת, הדמיה חיה רציפה של הזחלים של דרוזוהילה שלמים במשך יותר מ -30 דקות מאתגרת משום שקשה לשתק את הזחלים במשך זמן רב. כאן אנו מציגים שיטה הרכבה זחל בשם LarvaSPA המאפשרת הדמיה רציפה של הזחלים לחיות Drosophila ילה עם רזולוציה גבוהה בזמן ומרחבית במשך יותר מ -10 שעות. שיטה זו כרוכה חלקית הצמדת הזחלים כדי coverslip באמצעות דבק UV-תגובתי ובנוסף הרחקה התנועה זחל באמצעות polydiמתיל siloxane (PDMS) לחסום. שיטה זו תואמת לזחלים בשלבים ההתפתחותיים משלב שני ועד לנדידה השלישית. אנו מדגימים יישומים של שיטה זו במחקר תהליכים דינמיים של הנוירונים המגע הדרוזופילה, כולל הצמיחה דנדט וניוון הנגרמת מפגיעת הדנדריטים. ניתן ליישם שיטה זו גם על מנת לחקור תהליכים סלולאריים רבים אחרים המתרחשים ליד קיר הזחל.

חדר ההדמיה הזחל נבנה על ידי הדבקת מסגרת מתכת בהתאמה אישית ושני כיסוי ביחד. העיצוב של מסגרת המתכת מצוין באיור 1א. הזחלים של דרוזופילה בתוך החדר מדבקים לסרבל העליון בעזרת דבק UV ו-pdms cuboids. החריץ בתיבה הצדדית PDMS ובקלטת הדו-צידית מצורפת התיבה כדי ליצור את החלל להחזיק את הזחלים (איור 1ב, ג). PDMS מחיל גם לחץ עדין כדי לשטח את קיר הזחל הגוף ולהגביל פיזית את תנועת הזחל. לבסוף, פיסת נייר קטנה של עדשה רטובה ממוקם בתחתית החדר כדי לספק לחות. הגדרה זו...

פרוטוקול זה מתאר שיטה להרכבת הזחלים של דרוזוהילה כדי להשיג יותר מ-10 שעות של הדמיה של הפרעות זמן בבעלי חיים חיים שלמים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לדמות תהליכים ביולוגיים רבים קרוב לקיר הגוף הזחל.

LarvaSPA, שיטה להרכבה ממושכת על זחל לטווח ארוך הדמיה לזמן קצר

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

LarvaSPA היא השיטה הראשונה המאפשרת הדמיה חיה רציפה של זחלי דרוסופילה שלמים במשך יותר מ -10 שעות עם רזולוציה זמנית ומארית גבוהה. שיטה זו משמשת לחשיפת תהליכים תאיים דינמיים של נוירונים חושיים היקפיים של זחלים ולחקר תהליכים תאיים רבים אחרים שקורים ליד קיר גוף הזחל. שיטה זו קלה לשימוש ויש לה פחות הגבלה על גודל הזחל.שישה עד תשעה זחלים יכולים להיות מותקנים בתא ההדמיה באותו הזמן, מה שהופך את הניסוי לאפשרי. תא ההדמיה בקובואידים PDMS ניתן לייצר בעלות מינימלית והם לשימוש חוזר. שיטה זו שימושית במיוחד לחקר מנגנונים של התפתחות דנדריט ניוון דנדריט באמצעות נוירונים אישור זחל drosophila dendritic.היכולת לדמיין את אותו נוירון במשך שעות יכולה לחשוף כמה שינויים גלובליים ארוכי טווח של דפוסים דנדריטיים נובעים מהתנהגויות לטווח קצר ברמת הענף הבודד. שימוש בקובואידים PDMS התואמים את גודל הזחלים יגדיל את שיעור ההצלחה של זחלים משתק. אנא מצא קלטות שימושיות נוספות בסעיף פתרון הבעיות שלנו.לאחר בניית בלוק אלומיניום מחנות מכונות, לאטום את החלק התחתון של מסגרת המתכת באמצעות להחליק כיסוי ארוך עם דבק UV. לרפא את הרמז UV באמצעות מנורת UV כף יד במשך 30 שניות. חבר שכבות של סרט אריזה לפני השטח הפנימיים של צלחת פטרי מלבנית או צלחת תרבות תאים עגולים.השתמש בשכבה אחת לזחלים שניים בכוכב, שתי שכבות לזחלים בשליש המוקדם בכוכב, או שלוש שכבות לזחלים בשלהי הסיבוב השלישי בכוכב. חותכים את הקלטת לטיולים ברוחב מסוים עם סכין גילוח, 1.5 מילימטרים עבור קלטת שכבה אחת ושני מילימטרים עבור שתי שכבות או שלוש שכבות קלטת. השאירו לפחות רווח של חמישה מילימטרים בין שתי הרצועות.הסר את שכבות הקלטת המכסות את השטח. הסר אבק מפני השטח הפנימיים של הצלחת באמצעות סרט דביק. לאחר מכן, התבנית מוכנה לשימוש.כדי להכין את תערובת PDMS, לערבב שבעה גרם בסיס PDMS ב 0.7 גרם של סוכן ריפוי ביסודיות במיכל קטן. מניחים את המיכל בשואב ואקום במשך 15 דקות לפחות כדי להסיר אוויר מהתערובת. לאט לאט לשפוך על 5.5 גרם תערובת PDMS על התבנית כדי להגיע לעובי של 1 עד 2 מילימטר.מניחים את תערובת PDMS ב desiccator ואקום שוב לפחות 15 דקות כדי להסיר בועות אוויר שנותרו מן התערובת. לשבור את הבועות האחרונות עם קצה פיפטה. לרפא את PDMS על משטח שטוח באינקובטור חום ב 65 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי לשחרר את PDMS נרפא לאורך קצה התבנית ולנתק אותו מן התבנית. אחסן את ה- PDMS בין שתי חתיכות של סרט דביק גדול בטמפרטורת החדר. עבור זחלים בתחילת וסוף השלישי בכוכב, לחתוך את PDMS לשמונה על ידי שניים על ידי אחד מילימטר קובואידים על ידי מיקום החריץ שנוצר על ידי רצועת הקלטת במרכז הצד הארוך של הקובואיד.עבור זחלים שני בכוכב, לחתוך את הקובואיד לשמונה על אחד על אחד מילימטר. כדי להכין את החלק העליון להרכבה, בחר שישה קובואידים PDMS עם חריצים התואמים את גודל הזחלים. הסר אבק מפני השטח של PDMS עם סרט דביק.צרף ארבע חתיכות של סרט הדבקה דו צדדי בגודל של 12 על חמישה מילימטרים על תלוש כיסוי ארוך של 22 על 50 מילימטרים לתיקון קובואידים PDMS מאוחר יותר. כוונן את הרווחים בין שתי החלקים של קלטת דו-צדדית לרוחב החריץ PDMS. החל טיפה קטנה של דבק UV לתוך החריץ של כל קובואיד PDMS ולהוסיף שש טיפות קטנות של דבק UV לתוך הרווח בין קלטות דו צדדיות על החלקת הכיסוי.כדי להכין את הזחלים להרכבה, באמצעות זוג מדפים, לנקות את הזחלים במים כדי להסיר מזון מפני השטח של הגוף. מניחים את הזחלים הנקיים על פיסת נייר טישו לחה בצלחת פטרי קטנה ללא מכסה ומנחים את צלחת פטרי הקטנה בצלחת פטרי גדולה המכילה פיסת נייר טישו יבש. במכסה המנוע הכימי, השתמשו בצנרת להעברת פלסטיק כדי למרוח 160 עד 240 מיקרוליטרים של איזופלורן על נייר הרקמה היבשה וסגרו את המכסה של צלחת פטרי הגדולה.המתן שתיים עד שלוש דקות תוך ניטור הזחלים. ברגע שהקרסים בפה שלהם מפסיקים לזוז, מוציאים את הזחלים מהצלחת הגדולה של פטרי. מניחים את הזחלים משותקים על דבק UV בין קלטות דו צדדיות על החלקת הכיסוי עם קוטיקל הגב מול החלקת הכיסוי.מכסים כל זחל עם בלוק PDMS ומתאים את תא המטען של הזחל לתוך החריץ של PDMS. השאר את הראש והזנב של הזחל מחוץ לחריץ PDMS. הימנע חסימת צריחים של הזחל על ידי הדבק.לחץ כלפי מטה על הקצוות של בלוק PDMS על קלטת דו צדדית מבלי להחיל כוח על החריץ. משוך בעדינות את זנב הזחל כדי לשטח את החותך מתחת ל- PDMS. ללבוש משקפי בטיחות ולהשתמש מנורת UV כף יד כדי לרפא את דבק UV במשך ארבע דקות על ההגדרה הגבוהה.הפוך את החלקת המכסה במהופך ולהשתמש במנורת UV כדי לרפא את דבק UV במשך ארבע דקות נוספות. מניחים פיסת נייר עדשה קטנה בגודל של 15 על 30 מילימטרים בתחתית תא ההדמיה. לחות את הנייר עם 20 עד 30 microliters של מים.מניחים את פתק הכיסוי על התא כך שהזחלים פונים לתוך התא. השתמש דבק UV כדי לדבוק בשני הקצוות של החלקת המכסה על פני המתכת. הצד הגבי של הזחלים מוכן להדמיה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.לאחר ההדמיה, הסר את השמן על פתק הכיסוי העליון באמצעות נייר עדשה. נתק את החלק העליון של המכסה ממסגרת המתכת על-ידי חיתוך לחלל שבין החלקת המכסה למסגרת המתכת באמצעות סכין גילוח. תא ההדמיה מוכן לשימוש חוזר.נתק את הקובואידים PDMS מתליית הכיסוי העליונה עם מדפים. גלגלו את הקובואידים PDMS על סרט דביק כדי להסיר שאריות דבק ואבק. הקובואידים של PDMS מוכנים לשימוש חוזר.בפרוטוקול זה, זחלי דרוסופילה היו משותקים במשך יותר מ -10 שעות להדמיה רציפה. נתון זה מראה שישה זחלים שלישיים מאוחרים בכוכב המותקנים בתא. גזעי הזחלים תוקנו בזמן שראשיהם וזנבותיהם היו חופשיים לזוז.כאן, אנו מדגימים את היישום של LarvaSPA בחקר דינמיקת דנדריט עצבית ניוון דנדריט באמצעות נוירונים בכיתה ארבע DA כמודל. כדי לשתק בהצלחה זחלים בשיטה זו, זה קריטי להפסיק לחשוף את הזחלים כדי isoflurane פעם ווים הפה להפסיק לזוז לרפא את דבק UV לפני הזחלים להתעורר באופן מלא. כדי לחקור ניוון דנדריט והתחדשות, פגיעה בלייזר יכולה להתבצע כאשר הזחלים משותקים בתא ההדמיה.LarvaSPA עזר לנו להבין כיצד דנדריטים דינמיים גדל להיכשל innervate תאים אפידרמיס כמו פרוטאוגליקנים תא ב הכבד וכיצד phosphatidylserine נחשף על דנדריטים מנוונים לאחר פגיעה בלייזר. יש להגן על העיניים באמצעות משקפי בטיחות תוך שימוש במנורת ה-UV. לדפוק זחלים באמצעות isoflurane צריך להתבצע ברדס אדים.

larvaspa-method-for-mounting-drosophila-larva-for-long-term-time

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Mesoscopic הקרינה טומוגרפיה פועלת מעבר לגבולות חדירה של מיקרוסקופיה רקמות חתך פלואורסצנטי. הטכניקה מבוססת על תאורה השלכה רב ותיאור תחבורה פוטון. אנו להדגים ב-vivo כל הגוף 3D להדמיה של המורפוגנזה ה-GFP-לבטא דיסקים דמותי האגף...

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

מקור: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון מדגים טכניקת הדמיה חיה לחקר דפוסי עיניים בגולם Drosophila melanogaster. סמנים מתויגים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מאפשרים הדמיה של ארגון התאים והתמיינות במהלך היווצרות מבנה העין המתפתח.

הדמיה חיה של עין הגולם של דרוזופילה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

כאן אנו מתארים טכניקה מיקרוסקופית פשוטה ונגישה לציבור רחב לרכוש וידאו דיגיטלי באיכות גבוהה של מבוגרים תסיסנית ופנוטיפים מוטציה זחל מנקודת מבט לרוחב.

רכישת באיכות גבוהה וידאו דיגיטלי של דרוזופילה Behaviors הזחל ומבוגרים מנקודת מבט רוחבי

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הדמיה לחיות הפצע ותיקון ההיענות דלקתיות המשויך ברזולוציה גבוהה-עתיים ויוו. שיטה זו משתמשת השלב הגולמי של פיתוח דרוזופילה כדי לאפשר לטווח ארוך הדמיה ומעקב של אוכלוסיות תאים מסוים לאורך זמן והוא תואם עם איון יעיל מציאה RNAi בתיווך גנים.

לטווח ארוך In Vivo מעקב של תאים דלקתיים הדינמיקה בתוך דרוזופילה הגלמים

כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו מועסקים התמונה המרצפת הדנדריטי מאוד בהכנה חיה של המוח הזחל Drosophila ילה , ואת הפרוטוקול שפיתחנו לכמת זמן קפיצה 3d מערכות הדמיה עבור הערכות כמותית של דנדט דינמיקה בפיתוח נוירונים.

זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

כאן, מוצג פרוטוקול להדמיה חיה ארוכת טווח של רגל הדרוזופילה בשלב הגולם, הכולל הסרה מלאה של הגולם. ניתן ליישם פרוטוקול זה גם על רקמות אחרות.

הדמיה חיה לטווח ארוך של התפתחות רגל גולם דרוזופילה לאחר הסרת פופריום

חקור את שיטת LarvaSPA להדמיה חיה ממושכת של זחלי Drosophila ליותר מעשר שעות. שיטה זו מאפשרת מחקר של תהליכים תאיים דינמיים בנוירונים תחושתיים היקפיים ובפיתוח דנדריטים.

LarvaSPA, שיטה להרכבה ממושכת על זחל לטווח ארוך הדמיה לזמן קצר

גלה סרטונים נוספים