Name: כימות פרמטרים Spatiotemporal של אקסוציטוזיס תאי בתאים Micropatterned (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: חקור כימות ספטיו-טמפורלי של אקסוציטוזיס ליזוזומלי בתאי אפיתל פיגמנט רטינלי באמצעות מיקרוסקופיית TOF. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של דינמיקת הפרשה בתאים ויישומיה במחקר סרטן וחיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים מאוד תיירי גאלי (המרכז לפסיכיאטריה ומדעי המוח, INSERM) למתן פלסמיד VAMP7-pHluorin. אנו מודים לטארן דואונג על ייעוץ בנושא ניתוח סטטיסטי וחברי מעבדת GOUD לדיונים פוריים. המחברים מכירים מאוד את מתקן הדמיית תאים ורקמות (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg ו PICT-IBiSA @Pasteur) ואת ניקון הדמיה מרכז, המכון קירי (פריז), חבר תשתית המחקר הלאומי הצרפתי צרפת-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. נתמך על ידי האגודה לשפוך la Recherche sur le Cancer (ARC) ו P.M. קיבל מימון מתכנית המחקר והחדשנות אופק של האיחוד האירופי 2020 תחת מארי Skłodowska-Curie מענק הסכם מס ' 666003. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) ו-Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), כמו גם המרכז הלאומי דה לה רשרש סיינטיפיק ומשקיע קירי.

1. הכנת תאים מיקרו-פטרניים
<ol><li>תעבירת תאים<ol>
<li>יום אחד לפני transfection, זרע 2.5 x 106 hTERT-RPE1 תאים לתוך באר אחת של 12 צלחת באר (2 x 2 ס"מ) ב 1 מ"ל של בינוני.</li>
		<li>ביום של transfection, להכין את תערובת transfection עם VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL של חוצץ, 0.8 μg של ה-DNA, 3 μL של תערובת טרנספד). דגירה במשך 10 דקות. הערה: VAMP7 הוא v-SNARE lysomal, התמזגו עם תג pHluorin זוהר. הגשושית pHluorin מרווה על ידי pH נמוך, אבל במהלך פרוטונים exocytosis משתחררים pHluorin מתחיל לפלוטאות 10,,11.</li>
		<li>מוסיפים את תערובת הטרנס-פעולה לתאים במדיום שלהם.</li>
		<li>שנה את 4 השעות הבינוניות לאחר הוספת תערובת הטרנס-פעולה בתאים.</li>
		<li>השתמש בתאים לניסויים במהלך 24-48 השעות הבאות.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מיקרופטרן (שיטת פוטוליתוגרפיה)<ol>
<li>שוטפים את כיסויי הכיסוי (קוטר 25 מ"מ) באתנול ולתת להם להתייבש במשך 5 דקות.</li>
		<li>הפעל כיסויים על ידי תאורה תחת UV עמוק במשך 5 דקות.</li>
		<li>צור תא לח על-ידי לחות יסודית של מגבת נייר שעליה ממוקם סרט פרפין. להוסיף טיפות (30 μL עבור 22 מ"מ coverslip) של פולי-L-לייסין-שתל-פוליאתילן גליקול (PLL-g-PEG) פתרון (0.1 מ"ג / מ"ל, 10 mM HEPES, pH = 7.4) וכיסויי מקום עם המשטח מופעל עליהם. סגור את התא הלח עם החלק העליון ותרגם כיסויי במשך שעה אחת.</li>
		<li>לשטוף כיסויים 2x ב PBS ו 1x במים מזוקקים ולתת להם להתייבש.</li>
		<li>שוטפים את מסך הפוטו קוורץ במים מזוקקים ולאחר מכן עם אתנול או פרופנול. יבש את מסכה הצילום עם זרימת אוויר מסוננת. הערה: פוטו-מסכה קוורץ מצופה בצד אחד עם כרום אנטי-רפלקסיבי המכיל חורים בצורה של מיקרו-פטרנים. בפרוטוקול זה נעשה שימוש במיקרו-פטרנים בצורת טבעת של 37 μm. כאשר UV עמוק הוא נוצץ על מסכה, האור יכול לעבור רק דרך חורים אלה12.</li>
		<li>לחשוף את מסכה הצילום (בצד כרום מצופה) UV עמוק במשך 5 דקות כדי לנקות את פני השטח.</li>
		<li>הוסף טיפות מים קטנות (10 μL עבור כיסוי 20 מ"מ) בצד מצופה כרום של מסיכה. מניחים את כיסוי הכיסוי עם הצד PLL-g-PEG שטופלו על הטיפה ויבשו את המים הנוספים. ודא כי אין בועות אוויר טופס בין המסכה ואת כיסויי. הערה: כוח נימו של המים יהיה לשתק את כיסויי.</li>
		<li>לחשוף את מסיכה הצילום UV עמוק במשך 5 דקות עם הצד שאינו מצופה כרום למעלה (כיסויים מחוברים על פני השטח התחתון). הערה: האור יכול לעבור רק דרך החורים ולשנות את פני השטח שטופלו ב-PLL-g-PEG של כיסויים מתחת לסיכה.</li>
		<li>הסר את הכיסויים מהסיכה על-ידי הוספת עודפי מים. הערה: כיסויים אמורים לצוף במהירות.</li>
		<li>דגירה כיסויים בתמיסה של חלבוני מטריצה חוץ תאית (50 μg / מ"ל של פיברונקטין, 5 μg / מ"ל של פיברינוגן פלורסנט מדולל במים) על סרט פרפין בתא לח (כמו בשלב 1.2.3) עבור 1 שעה תחת מכסה המנוע זרימה למינאר כדי למנוע זיהום. הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה על-ידי אחסון הכיסויים ב- PBS ב- 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>זריעת תאים על משטחים מיקרו-פטרניים<ol>
<li>השתמש במחזיק כיסוי מגנטי שמתאים לגודל של כיסויי מיקרו-פטרונים כדי להרכיב את הכיסויים. ביום הרכישה, לחמם את מחזיק כיסוי ל 37 ° C כדי למנוע הלם תרמי עבור התאים במהלך השלבים הבאים.</li>
		<li>הכן את המדיום תבנית על ידי השלמת DMEM / F12 בינוני עם 20 mM HEPES ו 2% של פניצילין / סטרפטומיצין.</li>
		<li>המקום מכסה את המחזיק עם הצד micropatterned למעלה ולהוסיף תבנית בינונית ברגע כיסוי הוא על בסיס המחזיק. הוסף את החותם ושתק עם המכשיר המגנטי. ממלאים את מחזיק כיסויי הכיסוי בתבנית בינונית וסוו אותו עם מכסה הזכוכית. הערה: היה מהיר, כדי לא לאפשר כיסוי להתייבש. אין לשטוף את מחזיק כיסוי עם אתנול בין ניסויים, כי החותם עשוי לשמור על כמה אתנול, אשר יכול להגיב עם PLL-g-PEG ותוצאה של מתח התא. יש לשטוף את מחזיק כיסוי הכיסוי רק עם מי סבון. יתר על כן, המפרק יכול להיות דגירה במדיום דפוס ב 37 מעלות צלזיוס עבור 1 שעות כדי לדלל את המוצר שיורית.</li>
		<li>לאסוף תאי hTERT-RPE1 transfected על ידי trypsinization (0.5 מ"ל עבור לוח אחד 12 גם) ולהוסיף 1 מ"ל של 10% FBS DMEM / F12 בינוני.</li>
		<li>הוסף 0.5 x 106 תאים hTERT-RPE1 transfected למחזיק כיסוי ולעקוף אותו מחדש. דגירה במשך 10 דקות באינקובטור.</li>
		<li>יש לשטוף את מחזיק כיסוי 5x עם תבנית בינונית כדי להסיר תאים שאינם מחוברים ושאריות FBS על ידי הוספת המדגם תבנית עם פיפטה אחת ושאף את המדיום עם פיפטה אחרת כדי ליצור זרימת כביסה. תמיד לשמור על נפח קטן של דפוס בינוני במחזיק כיסוי כדי למנוע ייבוש של התאים על כיסוי micropatterned, אשר יוביל למוות תא.</li>
		<li>דגירה באינקובטור במשך 3 שעות כדי לאפשר התפשטות תאים מלאה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. רכישת נתוני אקסוציטוזיס
<ol><li>הדמיה של אירועי אקסוציטוזיס<ol>
<li>מחזיק כיסוי מקום מתחת ל-TIRM. יש לזהות את האות על-ידי מצלמה רגישה עם תבנית ההדמיה הטובה ביותר הזמינה. הערה: בניסוי זה, מטרת עדשה 100x ומצלמת EMCCD עם 512 x 512 פיקסלים אזור זיהוי שימש להולידה גודל פיקסל של 160 נארם.</li>
		<li>חפש תא המביע VAMP7-pHluorin כי הוא מופץ באופן מלא (איור 1A). הערה: תאים המביעים VAMP7 ניתנים לזיהוי בבירור, מכיוון שהם מציגים אות ירוק.</li>
		<li>שנה את זווית הלייזר עד לזווית TIRF המאפשרת הדמיה של אירועי אקסוציטוזיס VAMP7-pHluorin. בצע רכישה של 5 דקות בתדר התואם לקצב האקסוציטוזיס ולעוות הזמן (בדרך כלל 3 הרץ, איור 1D)באמצעות תוכנת המיקרוסקופ. הערה: לתאי hTERT-RPE1 יש קצב הפרשה lysomal של כ- 0.3 הרץ במיקרו-פטרנים. אקסוציטוזיס Lysosomal יש משך אופייני של 1 s. הוא מאופיין בעוצמת שיא ואחריו ריקבון אקספוננציאלי. דיפוזיה של הגשוש צריך להיות ברור בשלב זה(איור 1B, ג).</li>
		<li>עבור כל תא, לבצע גם רכישה של micropattern באמצעות תוכנת מיקרוסקופ(איור 1A).</li>
	</ol></li>
	<li>רכישת קואורדינטות אקסוציטוזיס<ol>
<li>פתח את הסרט שנרכש עם ImageJ/FIJI. השתמש בקובץ | יבוא | רצף תמונות. מצא אירועי אקסוציטוזיס בעין. אירוע אקסוציטוזיס מאופיין במראה של אות בהיר ההתפשטות כלפי חוץ(איור 1).</li>
		<li>השתמש בכלי הנקודה כדי לסמן את מרכז האירוע האקסוצ'ית. השתמש ב'ניתוח' | למדוד כדי למדוד קואורדינטות X ו- Y, כמו גם את קואורדינטת הזמן (מספר פרוסה). בצע מדידות אלה עבור כל אירועי האקסוציטוזיס של הסרט.</li>
		<li>שמור את התוצאות (תוצאות | קובץ | שמירה בשם). הכן קובץ טקסט עבור כל תא מנותח בשם "Results(cell_name).txt" המכיל את נקודות הציון של הפרוסה, קואורדינטות X ו- Y עבור כל אירועי האקסוציטוזיס בסדר זה. קובץ הטקסט אמור להיראות כך: רדיוס קוטר של מזהה X Y Feret RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115 RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115 הערה: הקפד להחליף את כל פסיקים בנקודות.</li>
		<li>מדוד את המרכז והקטר של כל תא באמצעות "הכלי הסגלגל". התאימו מעגל מושלם (אל תשתמשו בסגלגל) והשתמשו ב "מדידה" כדי להשיג את קואורדינטות X ו-Y וקוטרו של פרט. שמור את זהותו של כל תא (מזהה), קואורדינטות X ו- Y, קוטר ורדיוס של Feret (קוטר/2) בקובץ טקסט בשם "spherical parameter.txt". קובץ הטקסט אמור להיראות כך: רדיוס קוטר של מזהה X Y Feret RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115 RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115 הערה: הקפד להחליף את כל פסיקים בנקודות.</li>
		<li>מדוד את עובי טבעת המיקרו-פפטרן (אורך ההדבקה) בעזרת הכלי הישר ושמור את מזהה התא, רדיוס התא (מהקובץ: "פרמטר כדורי.txt") ואורך הדבקה בקובץ טקסט בשם "Pattern parameter.txt". חשב את אורך ההדבקה המנורמל על-ידי חלוקת אורך ההדבקה לפי רדיוס התא. הערה: הקפד להחליף את כל פסיקים לפי נקודות. הקובץ אמור להיראות כך: אורך הדבקת רדיוס תא מזהה אורך הדבקה מנורמל RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174 RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826</li>
	</ol></li>
</ol>3. ניתוח מרחבי של תא יחיד
<ol><li>חבילת R והתקנה הערה: חבילת R עבור ניתוח זה מנצלת את חבילת Spatstat13 כדי לחשב את הצפיפות הדו-ממדית (2D) ואת פונקציית K של ריפלי. הקוד הוא קוד פתוח ומשתמש בקבצי טקסט שתוארו בעבר.<ol>
<li>הורד והתקן R https://www.r-project.org/ (גירסה 3.5.2 שימש בניתוח זה).</li>
		<li>הורד את החבילה (ואת ערכת הנתונים הדגמה) מ: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper</li>
		<li>התקן את החבילה ב- R Studio באמצעות "כלים" באמצעות "התקנת חבילות". בחר "קובץ ארכיון החבילה ( .zip; .tar.gz)" עבור הקטגוריה "התקן מ:" ובחר את קובץ החבילה. לחץ על "התקן".</li>
		<li>טען את החבילה עם הפונקציה "ספריה ("ExocytosisSpatialAnalysis") " על-ידיכתיבת פקודה זו בסטודיו R והקשה על "Enter".</li>
		<li>הפעל את החבילה עם הפונקציה "ESA()" על-ידי כתיבת פקודה זו בסטודיו R והקשה על "Enter". הערה: ממשק משתמש ייפתח.</li>
		<li>בחר את הספריה עבור ערכת הנתונים (קבצי .txt) ובסי ספריה עבור קווי פלט. הערה: ניתן לשנות פרמטרים של הניתוח (ראה טקסט להלן) באמצעות ממשק משתמש.</li>
		<li>קובץ Script זה יתחיל ויבצע את הניתוח באופן אוטומטי. הוא מספק קבצי .pdf של קוויווים תואמים וקבצי .txt המכילים תוצאות מספריות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+and+endocytosis%3A+modes%2C+functions%2C+and+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li>
<li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li>
<li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li>
<li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li>
<li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li>
<li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li>
<li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914(2013).</li>
<li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+%22Hotspots%22+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li>
<li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+%28Ti-Vamp%29+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li>
<li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li>
<li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaddeley%2C+A+%22Spatial+point+Patterns%3A+Methodology+and+Applications+with+R%22">Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R</a>. , CRC Press. Indianapolis, IN. (2015).</li>
<li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li>
<li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li>
<li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li>
<li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311(2018).</li>
<li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+kernel+estimators+for+density+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+Statistics+%26+Data+Analysis%22%5BJournal%5D)">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

עקבנו אחר אירועי אקסוציטוזיס מהתא הליזומלי על ידי TIRFM הדמיית תאים חיים של VAMP7-pHluorin בתאים מיקרו-פטרן בצורת טבעת מנורמל וביצע ניתוח סטטיסטי קפדני של הפרמטרים המרחביים של אירועי אקסוציטוזיס. מתוך שימוש בתפקוד ה-K של ריפלי ומבחן סטטיסטי המבוסס על מרחק השכן הקרוב ביותר, אישרנו כי הפרשה מlysosomes אינהתהליך אקראי 8,9. שני הניתוחים הסטטיסטיים הראו בצורה משכנעת כי אירועי אקסוציטוזיס מציגים קיבוץ באשכולות (דמויות דו-מיוד ו-2G). ה...

אקסוציטוזיס הוא תהליך תאי אוניברסלי שבו שלוק מתפתל עם קרום הפלזמה ומשחרר את תכולתו. שלבית יכול להתמזג לחלוטין עם קרום פלזמה (היתוך מלא) או ליצור נקבובית היתוך שנשאר פתוח בזמן מוגבל (נשיקה וריצה)1. לדוגמה, חלבונים מסונתזים חדשים משתחררים למדיום החוץ-תאי מהשלוקים שהגיעו ממתחם Golgi. מסלול זה biosynthetic, anterograde הוא קדמוני, במיוחד אורגניזמים רב תאיים, כדי להפריס פפטידים איתות (למשל, הורמונים, נוירוטרנסמיטורים) ורכיבי מטריצה חוץ תאית (למשל, קולגן), כמו גם את התנועה חלבוני טרנסמברנה לממברנה פלזמה. בנוסף, הפרשות יכולות להתרחש אנדוזומים שונים: 1) מיחזור אנדוזומים על מנת לעשות שימוש חוזר חלבונים transmembrane; 2) גופים רב-ווריקולריים (MVBs) לשחרור אקסוזומים; ו-3) ליזומה לשחרור אנזימים פרוטאוליטיים. הפרשה אנדו-פלומטית כבר הראה להיות חשוב עבור גידול נורייט, היווצרות פסאודופודיה, תיקון קרום פלזמה, ואיתות תלוי ATP2.
כדי ללמוד אקסוציטוזיס ברמת תא יחיד, מספר טכניקות הועסקו. מהדק תיקון מאפשר זיהוי של אירועי אקסוציטוזיס יחיד עם רזולוציה זמנית גבוהה במגוון רחב של תאים חיים3. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת מידע על התאמה למיקום אחר של אירועי אקסוציטוזיס, ולא מאיזה תא היא מתרחשת. מיקרוסקופאלקטרונים מאפשרת הדמיה ישירה של אירועים אקסוציטיים ברזולוציה מרחבית גבוהה, ובשילוב עם חיסונים מספקת מידע על הספציפיות של התאים והמולקולות המעורבים. חיסרון בגישה זו הוא חוסר המידע על הדינמיקה של התהליך, כמו גם חוסר יכולתו לבצע מחקרים בתפוקה גבוהה. גישות מיקרוסקופיות אור כגון מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM), אשר מנצל את השדה evanescent כדי להאיר פלואורופורים בקרבת כיסוי (100 טנ"מ), מספק רזולוציה זמנית ומרחבית טובה כדי ללמוד אירועי אקסוציטוזיס. עם זאת, שיטה זו תואמת רק לתאים דבקים ותוחל רק על החלק האוורירי/נחות של התאים.
הערה, קרום הפלזמה חושף הטרוגניות משמעותית המבוססת על תסביכי דבק הנוכחיים רק באזורים מוגבלים. הטרוגניות זו מגבילה, למשל, את ספיגת ליגנדיםשונים 4. באופן דומה, לאחרונה דווח כי הפרשה ממתחם Golgi מרוכזת "נקודות חמות" קרום פלזמה5. יתר על כן, ידוע כי מטענים מסוימים מופרשים באמצעות exocytosis הקשורים למוקדהדבקה 6. לכן, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולמת לשאלה אם אירועי אקסוציטוזיס מופצים באופן אקראי בחלל, או אם הם מרוכזים באזורים מסוימים של קרום הפלזמה. מספר כלים סטטיסטיים המבוססים על פונקציית K של ריפלי הוצעו לחקור אתהשאלות האלה 7,8,9. הגישה שלנו משלבת כלים אלה עם micropatterning כדי לשלוט בצורת התא והטרוגניות קרום פלזמה. בנוסף למתן אמצעי להבחין בין אזורים דביקים ולא דביקים, טכניקה זו גם מאפשרת השוואה בין תאים ותנאים שונים ומגבירה את כוחם של ניתוחים סטטיסטיים.
כאן אנו מעסיקים מגוון של כלים סטטיסטיים כדי ללמוד את ההתפלגות המרחבית של אירועי אקסוציטוזיס מתא lysosomal בפיקוח TIRFM הדמיית תאים חיים של VAMP7-pHluorin בתאי hTert-RPE1 מיקרו-פטורן בצורת טבעת. אושר כי הפרשת ליזומים אינה תהליך אקראי8-,9, ושאירועי אקסוציטוזיס מציגים קיבוץ באשכולות. שימו לב, מצאנו כי אירועי אקסוציטוזיס מקובצים גם באזורים לא דביקים, מה שמצביע על כך שמולקולות הדבקה אינן המבנים היחידים שיכולים לגרום לנקודות חמות של הפרשה בממברנה פלזמה. אף על פי כן, הדבקת תאים אכן שפרו את התקבצות האשכולות. באופן עקבי, הניתוח שלנו זיהה אזורים מועשרים של אקסוציטוזיס שהיו ממוקמים בגבול בין האזורים הדביקים ולא דבקים.

<table><tbody><tr><td>Chamlide תא מגנטי</td><td>Chamlide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr>בדיקות מולקולריות<td>פיברינוגן</td><td>, Invitrogen</td><td>F35200</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין פלזמה בקר</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>hTert RPE1 קו תאים</td><td>https://www.atcc.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td> <td>n/a</td><td>נכתב על ידי W. Rasband, NIH/NIMH</td></tr><tr><td>JetPRIME מגיב טרנספקציה</td><td>Polyplus</td><td>114-07</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Photomask</td><td>Delta Mask Delta Mask</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG פתרונות</td><td>משטח PLL</td><td>(20)-g [3.5]- PEG(2)</td><td></td></tr><tr><td>R תוכנה</td><td>https://www.r-project.org/</td> <td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין (TrypLE Express 1X)</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>תנור אוזון UV</td><td>Jelight Company Inc</td><td>342-220</td><td></td></tr><tr><td>VAMP7-pHFפלורין פלסמיד</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>הפניה לנייר: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 דצמבר 5; 283(49):34365-73. doi: 10.1074/JBC. M804587200. תפקיד HRB באנדוציטוזיס תלוי קלתרין. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.</td></tr></tbody></table>

כימות פרמטרים spatiotemporal של אקסוציטוזיס תאי בתאים micropatterned

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

הדמיה חיה של pHluorin מתויג מסיס N-ethylmaleimide-רגיש-גורם חיבור חלבון REceptor (v-SNARE) Vesicle הקשורים קרום חלבון 7 (VAMP7) על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) היא דרך פשוטה לחקור הפרשה מהתא lysosomal. ניצול של תרבות התא על משטחים micropatterned כדי לנרמל את צורת התא, מגוון רחב של כלים סטטיסטיים הועסקו כדי לבצע ניתוח מרחבי של דפוסי הפרשה. באמצעות פונקציית K של ריפלי ומבחן סטטיסטי המבוסס על מרחק השכן הקרוב ביותר (NND), אישרנו כי הפרשה מlysosomes אינה תהליך אקראי, אבל מראה קיבוץ באשכולות משמעותי. שימו לב, הניתוח שלנו גילה כי אירועי אקסוציטוזיס מקובצים גם באזורים שאינם הדבקה, המציין כי מולקולות הדבקה אינן המבנים היחידים שיכולים לגרום לנקודות חמות הפרשה על קרום הפלזמה. ובכל זאת, מצאנו שהדבקת תאים משפרת את התקבצות האשכולות. בנוסף לאזורים דביקים ולא דביקים מוגדרים במדויק, הגיאומטריה המעגלית של מיקרו-פטרנים אלה מאפשרת שימוש בקואורדינטות קוטביות, ומפשטת את הניתוחים. השתמשנו הערכת צפיפות ליבה (KDE) ואת פונקציית ההתפלגות המצטברת על קואורדינטות קוטביות של אירועי אקסוציטוזיס כדי לזהות אזורים מועשרים של אקסוציטוזיס. בתאי מיקרו-פטרן בצורת טבעת, התקבצות אירעה בגבול בין האזורים הדביקים לאזורים שאינם דביקים. הניתוח שלנו ממחיש כיצד ניתן להשתמש בכלים סטטיסטיים כדי לחקור הפצות מרחביות של תהליכים ביולוגיים מגוונים.

המאפיינים spatiotemporal של אירועי אקסוציטוזיס נותחו lysosomes חזותי על ידי VAMP7-pHluorin10,,11 בתאי hTert-RPE1. hTert-RPE1 תאים הם תאים לא טרנספורמיים לאמץ היטב micropatterning, שימשו בהרחבה במחקרים מבוססימיקרו-פטרן קודמים 4,14. VAMP7 הוא lysomal v-SNARE15 כי היה מתויג עם pHluorin סופר ecliptic ב N-terminus שלה והוא ממוקם בלומן של הליזו. בתוך התא, הגשוש pHluorin היה מרווה על ידי ...

הדמיה חיה של אקסוציטוזיס ליזומלי על תאים מיקרו-פטרניים מאפשרת כימות מרחבית של תהליך זה. נורמליזציה מורפולוגית באמצעות מיקרו-פטרנים היא כלי יוצא מן הכלל לחשיפת כללים כלליים לגבי ההפצה המרחבית של תהליכים סלולריים.

כימות פרמטרים Spatiotemporal של אקסוציטוזיס תאי בתאים Micropatterned

Live imaging of the pHluorin tagged Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associated membrane protein 7 ...

פרוטוקול זה מדגים כיצד לחקור הפרשת תאים באמצעות הדמיה חיה על ידי מיקרוסקופיית TOF ומספק כלים לזיהוי אירועי קיבוץ באשכולות או אזורים של פעילות גבוהה. באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים ליצור תרבות תאים על משטחים micropattern לנרמל חלוקת תאים ובכך להקל על הטווחים המיוחדים של אירועי הפרשה. תאים מפרישים מגוון של מקרומולקולים המ ממלאים תפקידים חשובים בוויסות המערכת החיסונית.בסרטן, הפרשה ללא פיקוח משפיעה על שחרורם של אנזימים פרוטאוליטיים המאפשרים פלישה. כימות הפרשה יאפשר לנו להבין טוב יותר הפרשה מושפלת בסרטן ותהליכים דינמיים אחרים כגון הצגת אנטיגן. למרות פרוטוקול ההדמיה והניתוח שלנו הוא פשוט, זה דורש את הדור של תאים בודדים כי הם התפשטו היטב על פיסת micropattern.בסרטון זה, נדגים כיצד לתרבת תאים על כיסויי מיקרופטרן וכיצד לדמיין ולנתח אירועי הפרשה באמצעות כלים סטטיסטיים מרחביים. כדי להכין כיסויים עבור micropatterning, להפעיל אתנול מעוקר 25 מילימטר קוטר כיסויי זכוכית תחת אור אולטרה סגול עמוק במשך חמש דקות. בעוד הכיסויים מופעלים, להוסיף טיפה אחת 30 microliter של פוליאתילן שתל פוליאתילן גליקול לכל כיסוי על פיסת סרט פרפין בתוך תא לח.בסוף ההפעלה, מניחים את הכיסויים המופעלים בצד המשטח אל הטיפות ומכסים את התא הלח עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את הכיסויים פעמיים במים מזוקקים. בזמן שהכיסויים מתייבשים, שטפו מסכת צילום קוורץ פעם אחת עם מים מזוקקים ופעם אחת עם אלכוהול.יבש את מסכת הצילום עם זרימת אוויר מסוננת ולחשוף את הצד מצופה כרום מסכת צילום עד אור אולטרה סגול עמוק במשך חמש דקות. בסוף התאורה, מוסיפים טיפת מים של 10 מיקרוליטר על הצד מצופה הכרום של כל מסכת צילום ומניחים את צד הפוליאתילן גליקול של כל כיסוי על כל טיפת מים. לאחר הסרת כל מים עודפים, מניחים כיסוי הסרט מעל המגלשות, כדי למנוע התייבשות.חשוף את הצדדים הצפויים שאינם כרום של מסכות התמונה לאור אולטרה סגול עמוק במשך חמש דקות נוספות לפני הוספת מים עודפים למסכות הצילום כדי להסיר את הכיסויים. שלב זה יפיק את הטבעות המיקרופטרן על פני השטח. ואז להדגיר את הכיסויים בתווית חלבון מטריצה חוץ תאית על סרט פרפין בתא לח במשך שעה אחת מתחת למכסה המנוע לזרימה למינארית.עבור זריעת תא על פני השטח micropattern מוכן, בסוף הדגירה, למקם את הכיסויים לתוך צד micropattern מחזיק כיסוי מגנטי למעלה מיד להוסיף דפוס בינוני כדי coverslips. לאחר הוספת החותם, יש לשתק את הכיסויים עם ההתקן המגנטי לפני מילוי מחזיק הכיסויים במדיום תבנית נוסף. ואז לסגור את המחזיק עם מכסה זכוכית.כאשר התאים מוכנים, להוסיף 5 פעמים 10 כדי 5 של תאי אפיתל פיגמנט מונצח מונצחים transffected לתאי אפיתל כדי coverslips ו דגירה התאים במחזיק במשך 10 דקות באינקובטור תרבות התא. בסוף הדגירה, השתמש פיפטה אחת כדי לשאוף את המדיום הישן תוך שימוש פיפטה שנייה לשטוף את התאים חמש פעמים עם מדיום טרי לכל לשטוף כדי להסיר את התאים שאינם מחוברים וכל סרום חזיר עוברי שיורית. לאחר הכביסה האחרונה, להחזיר את המחזיק לאנקובטור במשך שלוש שעות כדי לאפשר התפשטות תא מלא.כדי לדמיין אירועי אקסוציטוזיס, מקם את מחזיק הכיסוי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת, וחפש תא המבטא VAMP7-pHluorin המתפשט במלואו. לשנות את הזווית של הלייזר עד זווית פלואורסצנטיות השתקפות פנימית הכוללת המאפשרת הדמיה של VAMP7-pHluorin אקסוציטוזיס אירועים הוא הגיע ולבצע רכישה של חמש דקות בתדר התואם את קצב exocytosis ואת ציר הזמן. כדי להשיג את קואורדינטות אקסוציטוזיס, לפתוח את הסרט אירוע אקסוציטוזיס שנרכש בפיג'י ולזהות באופן ידני את אירועי אקסוציטוזיס על ידי הופעת אות בהיר המתפשט החוצה.השתמש בכלי הנקודה כדי לסמן את מרכז אירוע האקסוציטוזיס ולהשתמש לנתח ולמדוד כדי למדוד את x ו y-קואורדינטות, כמו גם את קואורדינטת הזמן. שמור את המידות של תא אחד בקובץ טקסט אחד. פתח קובץ טקסט בגיליון אלקטרוני והסר את כל העמודות מלבד הפרוסה x וקואורדינטות y.לאחר מכן, השתמש בכלי הסגלגל ולמדוד כדי למדוד את המרכז ואת הקוטר כדי לקבל את x ו y-קואורדינטות ואת הקוטר של Feret של כל תא. שמור את המידות של כל התאים בקובץ טקסט אחד. פתח את קובץ הטקסט בגיליון אלקטרוני והסר את כל העמודות בקואורדינטות x ו- y וקוטר של Feret.לאחר מכן הוסיפו את מדידת הרדיוס עבור כל תא, ולאחר מכן השגו את הרדיוס מקוטר הפראט עבור כל תא. השתמש בכלי הקו הישר כדי למדוד את עובי טבעת המיקרופטרן של כל תא. שמור מדידה זו עבור כל התאים בקובץ טקסט אחד ולאחר מכן חלק את אורך ההיתוך ברדיוס התא כדי לחשב את אורך ההיתוך המנורמל.לניתוח מרחבי של תא יחיד, התקן תחילה את החבילה של RStudio וטען את החבילה ב- RStudio. הפעל את החבילה באמצעות הפונקציה ESA. ממשק משתמש ייפתח ולאחר מכן בחר את הספריה עבור קבצי ערכת הנתונים TXT ומדריך נתונים עבור התוויות הפלט.הסקריפט יתחיל ויבצע באופן אוטומטי את הניתוח, ויספק קובצי PDF של החלקות המתאימות וקבצי TXT המכילים את התוצאות המספריות. בתוך התא, הרצפה בבדיקה הוא מרווה על ידי ה- pH הנמוך של lysosome, אבל במהלך אקסוציטוזיס, pHluorin מתחיל לפלוט אות כמו pH עולה עקב שחרור פרוטון. אות pHluorin מפגין שיא במהלך אקסוציטוזיס המייצג את השחרור המהיר של פרוטונים ליזוזומליים, ואחריו ריקבון אות אקספוננציאלי המייצג את הדיפוזיה הדו-מימדית של הגשוש בממברנה של הפלזמה.בדרך כלל, תאי אפיתל מונצחים מונצחים של רשתית אנושית מדגימים פעילות הפרשת ליזומלית חשובה עם קצב אקסוציטוזיס ממוצע של 0.28 הרץ. ניתן לדמיין את ההתפלגות הדו-מימדית של אקסוציטוזיס על ידי הערכת צפיפות הקרנל כדי לחשוף הבדלים בצפיפות המקומית. קיימות שלוש סטיות אפשריות מ אקראיות מרחבית מוחלטת: קיבוץ באשכולות, פיזור או תערובת של קיבוץ באשכולות ופיזור.ניתן להשתמש בפונקציית K של ריפלי כדי להעריך את הסטיות האלה. שימו לב, אירועי אקסוציטוזיס באזור שאינו דבק מקובצים גם הם ומצביעים על כך שמולקולות הידבקות אינן המבנים היחידים המניעים נקודות חמות הפרשתיות בממברנות פלזמה. התוויית ההיסטוגרמה של אירועי אקסוציטוזיס על פי המודולוס לתא מייצג מגלה שיא סביב הגבול בין האזורים הדביקים ולא דבקים.ניתוח מזווג מראה כי צפיפות פני השטח נמוכה יותר באזור ההיצמדות מאשר באזור שאינו הידבקות, פוטנציאל בשל ירידה חזקה של אקסוציטוזיס בפריפריה התא. שילוב הידבקות תאים במיקרופטרנים עם ניתוח סטטיסטי מקל על היכולת לאתר במדויק עד כמה תהליכים תאיים מורכבים כגון הפרשה מוסדרים בחלל. דרושה עבודה עתידית נוספת כדי לקבוע איזה מנגנון מולקולרי עומד בבסיס קיבוץ האשכולות של פעילות הפרשה.

quantifying-spatiotemporal-parameters-cellular-exocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Micropatterns דבק כי לנרמל ארכיטקטורה הסלולרי יכול לשמש כדי להגביר את הרגישות של זיהוי של השפעות התרופה, לשפר reproducibility ולפשט רכישת התמונה ניתוח אוטומטי. טכנולוגיה זו ייהנו סמים / siRNA מבחני המיון, שבוצעה על התרבות תומך קונבנציונלי התא וכתוצאה מכך סובל השתנות התא אל התא מוגזמת.

ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

מקור: Pioli, R., et al., דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימיות רציפה. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השיטה של לכידת תאי Escherichia coli (E. coli) בודדים מתויגים פלואורסצנטית במלכודות מיקרופלואידיות באמצעות תרחיף נטול פחמן וזרימה מבוקרת, ואחריו תוספת חומרים מזינים כדי לעורר צמיחה והדמיה פלואורסצנטית של מיקרו-מושבות.

דפוס מיקרופלואידית ומעקב מבוסס פלואורסצנטי של צמיחת חיידקים חד-תאיים

שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

המטרה של הפרוטוקול הנוכחי הייתה לפתח שיטה שתאפשר ניתוח הגנומי תפקודי של הפרשת תא פיטום. הפרוטוקול מבוסס על הערכה כמותית של שחרורו של גן כתב ניאון cotrasfected עם הגן של עניין וזמן אמת ניתוחים של המורפולוגיה של גרגר ההפרשה.

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis

תקשורת בין-תאית היא קריטית לשליטה בפעילות פיזיולוגית שונות בתוך ומחוץ לתא. מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידת טבע מרחב ובזמן של הפרשות תא בודדות. כדי להשיג זאת, גישה רב תחומית המשלבת משמשת nanoplasmonic ללא תווית חישה עם הדמיה תא חי.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

מתח osmotic משפיע אקסוציטוזה ואת כמות הנוירוטרנסמיטר שפורסמו במהלך תהליך זה. נדגים כיצד שילוב שיטות אלקטרוכימיות יחד עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של לחץ אוסמוטי חוץ-תאית על פעילות אקסוציטוזה, שלפוחית quantal בגודל כמות הנוירוטרנסמיטר משוחרר במהלך אקסוציטוזה.

ניטור השפעת Osmotic הלחץ על שלפוחית הפרשה, אקסוציטוזה

השיטה המוצגת כאן משתמשת במיקרוגרף יחד עם הדמיה כמותית לחשיפת הארגון המרחבי בתוך תרבויות היונקים. הטכניקה היא קלה להקים מעבדה סטנדרטית בביולוגיה התא והוא מציע מערכת צייתן לחקור מבחנה בפריפרייה.

מיפוי הארגון המרחבי של תאי היונקים באמצעות מיקרודפוסים והדמיה כמותית

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים הניסיוניים של בדיקה מתפשטת של תא המבוססת על מיקרוסקופיה של תאים חיים. אנו מספקים כלי חישובי קוד פתוח עבור פילוח משוחד של תאים בעלי תווית פלואורסצנטית וניתוח כמותי של דינמיקת lamellipodia במהלך התפשטות התא.

ניתוח כמותי של דינמיקת קצה התא במהלך הפצת תאים

פיתחנו תוכנת ראייה ממוחשבת אוטומטית לזיהוי אירועים אקסוציאטיים המסומנים על ידי בדיקות פלואורסצנטיות רגישות ל- pH. כאן, אנו מדגימים את השימוש בממשק משתמש גרפי ו- RStudio כדי לזהות אירועי היתוך, לנתח ולהציג פרמטרים spatiotemporal של היתוך, ולסווג אירועים למצבי היתוך נפרדים.

זיהוי וניתוח אוטומטיים של אקסוציאטוזיס

ניתוח תזוזה ריבועית ממוצעת (iMSD) שמקורו בהדמיה מיושם על מקרופינוזומים כדי להדגיש את האופי הפנימי שלהם המתפתח בזמן במונחים של תכונות מבניות ודינמיות. לאחר מכן משווים את המקרופינוזומים לגרגירי הפרשת האינסולין (ISGs) כהתייחסות למבנים תת-תאיים בעלי תכונות מבניות/דינמיות ממוצעות של אינווריאנטים בזמן.

בדיקת תכונות מבניות ודינמיות של ננו-מבנים תת-תאיים של סחר בבני אדם על-ידי ספקטרוסקופיית תנודות מרחביות-טמפורליות

פרוטוקול זה נועד למדוד את הפרמטרים הדינמיים (בליטות, נסיגה, קפלים) של בליטות בקצה של תאים מתפשטים.

מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

חקור כימות ספטיו-טמפורלי של אקסוציטוזיס ליזוזומלי בתאי אפיתל פיגמנט רטינלי באמצעות מיקרוסקופיית TOF. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של דינמיקת הפרשה בתאים ויישומיה במחקר סרטן וחיסון.

כימות פרמטרים Spatiotemporal של אקסוציטוזיס תאי בתאים Micropatterned

גלה סרטונים נוספים