השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

הפרוטוקול שלנו מקל על הכנת עכברים מהונדסים גנטית בקלות, ביעילות ובמהרות מעברי עכבר תא יחיד. הפרוטוקול שלנו משלב שימוש בעוברים בשלבים חד-תאיים מופשרים בהקפאה ואלקטרופוזיה המאפשרת ייצור מהיר של עכברים מהונדסים גנטית, כולל עכברים מוטנטים ביעילות גבוהה ובקצבי פסיפס נמוכים. עבור הפריה חוץ גופית, להתחיל על ידי סופר ביוץ ארבעה או שמונה שבועות נקבה C57BL/ 6J עכברים באמצעות הזרקה תוך-אישית של 7.5 יחידות בינלאומיות של גונדוטרופין נסיוב סוסה בהריון ואחריו הזרקה תוך-לידתית של 7.5 יחידות בינלאומיות של גונדוטרופין כוריוני אנושי 48 שעות מאוחר יותר.

לאחר מכן, להסיר epididymis cauda ממבוגרים מינית שלושה עד חמישה חודשים זכר C57BL/ 6J עכברים ולהשתמש מחט לנתח כדי לחלץ קרישי זרע. ואז להדק את הקרישים ב 200 טיפת microliter של HTF ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 1.5 שעות עבור קיבוליות. 16 עד 18 שעות לאחר הזרקת גונדוטרופין כוריוני אנושי, לאסוף קומפלקסים cumulus oocyte מן oviducts דגירה המתחמים עם 200 microliters של HTF מכוסה פרפין נוזלי עבור אינקובציה לא יותר משעה באינקובטור תרבות התא.

בסוף הדגירה, מוסיפים אחד עד חמישה מיקרוליטרים של השעיית זרע מגבול מדיום הדגירה לירידה של 200 מיקרוליטר של מתחמי cumulus oocyte ומ מניחים את התרבות המשותף באינקובטור תרבות התא במשך שלוש שעות. בסוף הדגירה, לשטוף את oocytes עם אשלגן בתוספת סימפלקס אופטימיזציה בינוני שלוש פעמים כדי להסיר את כל הזרע הנותרים ותאי קומולוס ולהשתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק את היווצרות pronuclear ואת הציון של עוברי תא אחד. עבור cryopreservation עובר תא אחד, להעביר את העוברים לתוך טיפה טרייה 200 microliter של HTF בתוספת 20% סרום חזיר עוברי עבור אינקובציה של 10 דקות באינקובטור תרבות התא.

בסוף הדגירה, להעביר 20 עד 100 עוברים ל 50 microliters של פתרון אחד דימתיל סולפוקסיד טוחן ולהעביר עד 100 עוברים בחמישה microliters של פתרון לתחתית cryotube. מצננים את העוברים במשך חמש דקות באפס מעלות צלזיוס לפני הוספת 45 מיקרוליטרים של פתרון DAP213 בצד הצינור. לאחר המכסה, לשמור על התאים במשך חמש דקות נוספות באפס מעלות צלזיוס לפני במהירות אחסון הצינור בחנקן נוזלי.

הכינו מיקרוגרם אחד למיקרוליטר של CRISPR RNA ומיקרוגרם אחד למיקרוליטר של tracrRNA במדיום חיוני מינימלי מופחת בסרום. מוסיפים שישה מיקרוליטרים של כל תות RNA ל-42 מיקרוליטרים של חיץ נטול גרעין ומ מניחים את התערובת בתנור יבש למשך שלוש דקות ב-95 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, מקררים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות ומכינים מיקרוגרם אחד למיקרוליטר של חלבון HiFi Cas9 עם מדיום חיוני מינימלי מופחת בסרום.

הוסף שישה מיקרוליטרים של פתרון HiFi Cas9 מדולל לפתרון RNA ולהעביר עד 100 עוברים מופשרים לתוך 25 microliters של פתרון מורכב ribonucleoprotein וכתוצאה מכך שקופית זכוכית אחת שלמה. ואז דגירה עוברים במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. עבור אלקטרופוזיה עוברית, בסוף הדגירה, להגדיר את הפרמטרים electroporator טען את השקופית על אלקטרופורטור.

אלקטרופורציה צריכה להתבצע בתוך שעה אחת של הפשרת עובר כדי להבטיח כי עריכת הגנום מתרחשת לפני השכפול הראשון של DNA ולמנוע פסיפסיזם. לאחר האלקטרופוריה, לשטוף את העוברים שלוש פעמים עם מאגר ביקרבונט Krebs-Ringer שונה שני מדיום בשתי שטיפות עם טיפה של אשלגן בתוספת דיסלקס אופטימיזציה בינוני מכוסה פרפין נוזלי. ואז להחגירה העוברים אשלגן טרי בתוספת מדיום אופטימיזציה סימפלקס באינקובטור תרבות התא בן לילה.

שימוש בשיטת קריו-שימור מותאמת זו לעוברים של תא אחד משפר את קצב ההתפתחות של העוברים המופשרים בהקפאה לשלב שני התאים. בשיטה זו, כל העכברים שנוצרו בניסוי מייצג זה היו לבקן עם עכבר פסיפס אחד בלבד הנושא מעיל עם טלאים לבנים ושחורים. כאן ניתן לראות קטע מייצג של כרומטוגרמה מעכבר לבקן המכיל את אלל M1.

כפי שמודגם, הפרוטוקול יכול ליצור עכברי נוקאאוט ודפיקה עם יעילות גבוהה ותעריפי פסיפס נמוכים. ואכן, צאצאי F1 של צאצאי F0 הומוזיגים הם הטרוזיגים המכילים מוטנט אחד ואלל מסוג פראי אחד ללא מוטציות שונות. זכור כי הביצית המופרית שברירית בשלב של תא אחד.

התוספת של סרום חזיר עוברי מחזקת את העובר. עם זאת, יש לטפל בו בזהירות בכל שלב. שיטה זו יכולה לתרום לניתוח של תפקוד גנים ומחקר במחלות אנושיות על ידי הקלת ייצור מהיר ויעיל יותר של עכברים מהונדסים גנטית.