הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

חלבונים המייצרים תאים סינתטיים מציעים פלטפורמה רב-תכליתית לחקר מקורות החיים, כמו גם טיפולים סינתטיים מבוססי תאים לאספקת תרופות מתקדמות. שיטה זו היא פשוטה ובמחיר סביר עבור ביטוי RNA וחלבון והוא יכול להיות מיושם לייצור חלבון טיפולי באתר ישירות בתוך הגוף. המערכות יכולות לשמש לטיפול במגוון רחב של מחלות ממחלות מטבוליות והחלפת חלבונים לסרטן ואולי גם לסוכרת.

פרוטוקול מרובה שלבים זה כולל נקודת עצירה מוגדרת. בעת ביצועו בפעם הראשונה, מומלץ לחלק את העבודה על פני מספר ימים. הפרוטוקול לייצור תאים סינתטיים מתחיל בהכנת ליססאט S30-T7 נטול תאים.

לאחר מכן, השומנים הממברנה ותוכנון התזונתי התאי מוכנים לדמות את הסביבה הפנימית ולתמוך בייצור חלבונים. השלב האחרון הוא הכנת התאים הסינתטיים עצמם. הכינו תרבויות מתנע כפולות בבקבוקי ארלנפייר 100 מיליליטר.

לכל בקבוקון, להוסיף חמישה מיליליטר של מדיה LB בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין לחסן עם מושבת E.coli אחת. לגדל את התרבות לילה בשייקר אינקובטור הרצפה ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להכין שני בקבוקים ארלנזיר מבולבל ליטר המכיל 500 מיליליטר של מדיה TB בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין.

לחסן כל בקבוק שני ליטר עם תרבות המתנע חמישה מיליליטר. מניחים את הבקבוקים בשייקר ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס. לפקח על התרבויות מעת לעת באמצעות ספקטרופוטומטר ולהגדיל את התרבויות עד OD600 בין 0.8 ואחד.

כדי לגרום לביטוי פולימראז T7 RNA, להוסיף לכל בקבוק שלושה מיליליטר של 100 מילימולר IPTG להגיע 0.6 מילימולר. המשך לגדל את התרבויות עד OD600 הוא כארבעה. לאחר שהתרבויות מגיעות לצפיפות האופטית הרצויה, מעבירים את ההשעיה מכל בקבוק ארלנפייר לשני צינורות צנטריפוגה מעוקרים 250 מיליליטר.

צנטריפוגה הצינורות ב 7, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השלך את העל-טבעי. יש להשתמש שוב בכל גלולה ב-250 מיליליטר של חיץ ליזאט S30 קר באמצעות ערבוב במידת הרצוי.

צנטריפוגה ב 7, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את כל הכדורים יחד ב-15 מיליליטר של חיץ ליאזט S30 קר. סנן את ההשעיה באמצעות רפידות גזה.

לפני שתמשיך לשלב הבא, מראש את הטיפים 1.5 בקבוקונים מיליליטר כי יהיה צורך לאחסון lysate. הומוגניזציה של ההשעיה פעמיים. השתמש בלחץ עבודה של 15,000 PSI עם לחץ אוויר של ארבעה ברים לשבריג תאים.

לאסוף את הומוגנית. הוסף 100 microliters של 0.1 DTT טוחן לכל 10 מיליליטר של ההשעיה הומוגנית. צנטריפוגה ההשעיה ב 24, 700 פעמים גרם ב 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

DTT וכלורופורם מסווגים כמרגיזים ומזיקים ולכן יש לטפל בהם בזהירות. כלורופורם המשמש מאוחר יותר בפרוטוקול חייב לשמש באזור עם מיצוי אדים. כדי לשמר את פעילות ה-lysate, בצע את השלב במהירות.

מניחים 200 aliquots microliter של על טבעי בקבוקונים מקוררים מראש מיד לצלם להקפיא אותם עם חנקן נוזלי. לאחסן את הבקבוקונים ב 80 מעלות צלזיוס שלילי לשימוש עתידי. בנפרד להמיס POPC וכולסטרול בכלורופורם כל לריכוז סופי של 100 מיליגרם למיליליטר.

וורטקס כל בקבוקון בנפרד. שלב את הרכיבים בבקבוקון זכוכית שני מיליליטר. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של תוסף הכולסטרול-כלורופורם, 50 מיקרוליטרים של פתרון POPC-כלורופורם ו-500 מיקרוליטרים של שמן מינרלי.

מערבולת הבקבוקון, ואז כדי להתאדות את הכלורופורם, לחמם אותו במשך כשעה ב 80 מעלות צלזיוס במכסה המנוע כימי. לפני תחילת שלב ייצור התא הסינתטי, הכינו את הפתרונות החיצוניים, הקדם-פנימיים וההזנה כמתואר בכתב היד. לאחר מכן מניחים 1.2 מיליליטר של הפתרון החיצוני בצינור 15 מיליליטר לאט להוסיף שכבה של 500 microliters של שומנים בשמן פתרון מן בקבוקון הזכוכית הראשון.

דגירה הצינור בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. כדי לסיים את הכנת הפתרון הפנימי, יש לערבב על הקרח לנפח סופי של 100 מיקרוליטרים על-ידי הוספת ליאזט S30-T7 ופלסמיד DNA. הוסף 100 microliters של הפתרון הפנימי עם lysate ו plasmid לבקבוקון זכוכית שני מיליליטר השני עם 500 microliters של תמיסת שומנים בשמן.

פיפטה למעלה ולמטה במרץ לדקה אחת ולאחר מכן מערבולת לדקה נוספת ברמה חמש. לאחר דגירה אמולסיה וכתוצאה מכך במשך 10 דקות על קרח כתוש, לאט להוסיף את אמולסיה על גבי שלב השמן בצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור במשך 10 דקות ב 100 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס.

ואז צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 400 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס. עד סוף הצנטריפוגה, גלולה צריכה להיות ניתנת לצפייה בתחתית הצינור. כדי לחלץ את גלולה, תחילה להסיר את שכבת השמן העודף.

לאחר מכן, לטעון קצה פיפטה גזוז עם כ 400 microliters של פתרון החיצוני ולהשתמש טיפ פיפטה כדי לאסוף את גלולה, שחרור הפתרון החיצוני כמו קצה פיפטה עובר דרך שלב השמן. לנגב את קצה פיפטה ולהעביר את גלולה לצינור נקי 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה גלולה במשך 10 דקות ב 1, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס.

הסר את supernatant ו resuspend גלולה ב 100 microliters של פתרון האכלה. לביטוי חלבון, הדגירה את ההשעיה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס בלי לרעוד. פלסמידים המבטאים את המודל חלבון sfGFP ורניה לוציפראז הוכנסו סינתזת חלבון ללא תאים, תגובות בתפזורת CFPS, ותאים סינתטיים.

ייצור החלבון הוערך במספר שיטות. ניתוח כתם מערבי זיהה ייצור sfGFP His6 הן בתגובות בתפזורת CFPS והן בתוך תאים סינתטיים. SfGFP מטוהרים His6 שימש כבקרה חיובית.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ברייטפילד ומסנן GFP מראים תאים סינתטיים המייצרים sfGFP. ציטומטריית זרימה שימשה לניתוח sfGFP המייצר תאים סינתטיים. חישוב אוכלוסיית התאים הסינתטיים הפעילה התבסס על סף עוצמת הפלואורסצנטיות sfGFP שהוגדר על ידי דגימת ה- DNA השלילית המיוצגת על ידי ההיסטוגרמה האדומה.

עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של sfGFP המייצרת תאים סינתטיים חושבה מאוכלוסיית התאים הסינתטיים הפעילה ונורמלה לדגימה השלילית של הדנ"א. התפלגות הקוטר של התאים הסינתטיים הפעילים חושבה בהתבסס על אות sfGFP. פעילות רנילה לוציפראז כומתה במדידות זוהרות.

שיטה זו היא רב-תכליתית מאוד והוא יכול להיות אופטימיזציה עבור חלבונים היעד שונים על ידי שינוי מקור ליט, הרכב השומנים וריכוזי פתרון פנימי. ניתוח FACS של תאים סינתטיים המייצרים חלבון סמן פלואורסצנטי יכול להתבצע כדי לספק ערך כמותי של שבר של תאים סינתטיים פעילים. ניתוח כתם מערבי ימדד את ייצור החלבון.