גירוי נישות תאי גזע והתחדשות רקמות בעור עכבר על ידי פוטוגנרציה תלוית פרוטופורפירין IX ניתנת להחלפה של מיני חמצן תגובתי באתרם

המתודולוגיה שלנו היא הראשונה שמספקת כלי ניסיוני אמין לגרימת הפעלה חולפת של זן חמצן תגובתי אנדוגני או ייצור ROS ברקמה in vivo. המתודולוגיה שלנו מספקת הליך חזק, ידידותי למשתמש ולא פולשני המניב ייצור עקבי של רמות ROS מגרות פיזיולוגיות בעור בעצם באמצעות מקור אור אדום. מכיוון שהאינדוקציה הפיזיולוגית של ROS בעור משיגה את צרכי גזע הרקמה, יישמנו עוד יותר את המתודולוגיה שלנו לטיפול בהתחדשות העור כולל ריפוי טוב וצמיחת שיער.

ביולוגיה ואיתות ROS הם כיום מוקד מחקר. מגבלה עיקרית לחקירת תפקוד ROS in vivo היא היעדר כלים מתאימים כדי לגרום לייצור ROS אנדוגני מבוקר. המתודולוגיה שלנו ידידותית למשתמש וקלה, אך כל המכשירים, מנורה, עירוי, IS, וכו', צריכים להיות מכוילים כראוי.

קודמנים כימיים קריטיים חייבים להיות טריים ויש לעקוב בקפדנות אחר כל השלבים או הפרוטוקול. כדי לגרום לצמיחת שיער על העור הגבי של עכברים בשלב הטלוגן השני, לאחר אישור חוסר תגובה לרפלקס הדוושה בסביבות היום ה-50 לאחר הלידה C57 שישה עכברים שחורים, השתמש בסכין גילוח וקרם אפילציה כדי להסיר שני אזורי עור עצמאיים זה לצד זה מגב כל עכבר. לאחר מספר דקות, הסר את הקרם עם PBS ורשום את צמיחת זקיקי השיער באמצעות רכישה יומית של תמונות ברזולוציה גבוהה של אזורי העור הגביים המטופלים והביקורת של כל בעל חיים.

כדי לגרום ליצירת נגעי כוויה מדרגה שנייה על עור הגב של עכברים בשלב הטלוגן השני, הסר את השיער מגב העכבר. מחממים מוט פליז בחתך של סנטימטר אחד ל-95 מעלות צלזיוס במים רותחים ומורחים את המוט על האזור המרכזי של עור העכבר למשך חמש שניות. מיד לאחר יצירת הכוויות, יש להזריק לבעלי החיים מיליליטר אחד של תמיסה פיזיולוגית כדי למנוע התייבשות ולאפשר לעכברים להתאושש במשך 24 שעות לפני המשך הטיפול.

ליצירת תאי שמירה המסומנים BrdU או LRCs, יש להזריק לבני 10 או 14 יום המלטה תוך צפקית פעם ביום במשך ארבעה ימים רצופים עם 50 מיליגרם לק"ג משקל גוף של BrdU ב-PBS. לאחר שלב התיוג, אפשר לעכברים להתפתח במשך 50 עד 60 יום לפני החלת הטיפול. כדי לגרום לייצור חולף של מיני חמצן תגובתיים לא קטלניים או רמות ROS בעור העכבר לניתוח צמיחת שיער, לאחר רכישת תמונת צמיחת שיער בסיסית, יש למרוח באופן מקומי כ-25 מיליגרם קרם mALA על אזור העור המגולח הימני ולהניח את החיה בחושך למשך 2.5 שעות.

בתום תקופת הטיפול ברגישות לאור, הסר ביסודיות את כל עודפי הקרם עם PBS ואשר את ייצור PP9 באתרו על ידי ביטוי פלואורסצנטי אדום תחת עירור אור כחול, ולאחר מכן הקרין את כל העור האחורי עם מקור אור אדום מתאים למינון כולל של 2.5 עד 4 ג'אול לסנטימטר מרובע. לאחר מכן אפשרו לעכברים להתאושש על שמיכה חשמלית עם ניטור עד לשכיבה מלאה לפני החזרת בעלי החיים לכלובים שלהם. כדי להפעיל ייצור ROS חולף לריפוי כוויות מדרגה שנייה, יש למרוח כ-25 מיליגרם של קרם mALA לאורך משטח הכוויה הימני וכארבעה מילימטרים של רקמה סמוכה ולהניח את בעלי החיים בחושך למשך 2.5 שעות כפי שהודגם.

לאחר הסרת הקרם, יש להקרין את כל עור הגב ולאפשר לעכברים להתאושש עם ניטור כפי שהודגם. כדי לגרום לייצור ROS חולף בעור הזנב, יש למרוח כ-25 מיליגרם של קרם mALA לאורך כל אזור רקמת הגב של העכברים שטופלו ב-BrdU ולהקרין את העור הגבי של הזנב כפי שהודגם. לאחר המתת חסד של העכברים, קצרו את עור הזנב לזיהוי BrdU.

השתמש באזמל כדי לקצור את הזנב מכל בעל חיים, ואז בצע חתכים אורכיים ישרים וקילף את כל העור כחתיכה אחת מעמוד השדרה. דגרו את חתיכות העור הקלופות בחמישה מילי-מולארי EDTA ו-PBS וחמישה צינורות מיליליטר למשך ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר הפרדה זהירה של יריעות אפידרמיס שלמות מהדרמיס בעזרת מלקחיים. יש לתקן את הרקמות המופרדות בפורמלדהיד 4% ו-PBS למשך 72 שעות לפחות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן סמן את הרקמות הקבועות עם הנוגדנים המצומדים הפלואורסצנטיים המעניינים לפני הדמיית הרקמות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית על פי פרוטוקולים סטנדרטיים לזיהוי וכימות LRCs בכל תנאי ניסוי. להערכה ex vivo של ייצור ROS, לאחר קצירת חלקי עור זנב עכבר כפי שהודגם, דגרו את רקמות הביקורת הלא מטופלות וחמש מילי-מולריות, EDTA ו-PBS בלבד ואת דגימות הטיפול הפוטודינמיות ב-EDTA בתוספת שני מילי-מולארי mALA. לאחר מכן, הוסיפו הידרואתידין לריכוז סופי של 3.2 מיקרו-מולרי לכל קבוצת רקמות ודגרו על כל הדגימות למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.

בסוף הדגירה, השתמש בקצות האצבעות כדי למתוח את דגימות עור הזנב על משטח זכוכית ולהקרין את הרקמות המטופלות ב-636 ננומטר של אור אדום בשטף של 10 ג'אול לסנטימטר רבוע. בתום הטיפול יש להפריד מיד את האפידרמיס מהדרמיס ולקבע את יריעות האפידרמיס בפורמלדהיד 4% ו- PBS למשך 72 שעות לפחות בטמפרטורת החדר. בתום הקיבוע, העריכו את פליטת 2-הידרוקסיטידיום האדום על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות אור ירוק מרגש כדי לאפשר רכישת תמונות באיכות גבוהה.

לזיהוי in vivo של ייצור ROS בעור הגב, מיד לאחר הקרנת אור אדום, יש למרוח 100 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר DH-FDA ו-50% אתנול על כל אזורי העור המטופלים והביקורת. מתן מקומי של מבשר mALA על עור הגב והזנב של העכבר מביא להצטברות משמעותית של פרוטופורפירין IX ברקמה כולה ובאופן ניכר בזקיק השיער כפי שמודגם על ידי הקרינה הוורודה האדמדמה של תרכובת זו תחת עירור אור כחול. הקרנה לאחר מכן של הרקמה המטופלת באור אדום מקדמת ייצור חולף של ROS בתוך הרקמה, במיוחד באזור הבליטה של זקיק השערה.

הפעלת ייצור ROS לא קטלני בעור עכבר in vivo מקדמת עלייה משמעותית במספר ה-LRCs באזור הבליטה של זקיק השיער יומיים לאחר הטיפול הפוטודינמי. יש לציין כי העלייה במספרי ה-LRC היא חולפת, וחוזרת לרמות נורמליות שישה ימים לאחר הטיפול. ייצור ROS חולף מאיץ את ריפוי העור לאחר כוויה מדרגה שנייה.

כימות ההפחתה ההדרגתית של העור הפגוע מדגים את החוסן והמובהקות הסטטיסטית של רקמת תהליך האצת ריפוי הפצע. באופן דומה, רמות ROS לא קטלניות מקדמות מאוד את צמיחת השיער לאחר הגילוח במהלך הטלוגן המתואם השני, שלב שבו זקיק השיער עמיד להגיב לגירויי גדילה. בנוסף, ייצור ROS לאחר טיפולי צילום מצטמצם משמעותית גם על ידי יישום תרכובות נוגדות חמצון.

יש לאשר בקפידה ייצור PP IX באתרו על ידי ביטוי פלואורסצנטי אדום תחת עירור אור כחול. כדי לגרום לייצור ROS, יש לקבוע נכון את הקרינה של מקור האור האדום. לעומת רקמות ומינון אור כולל.

לאחר השראת ROS, ניתן להשתמש בטכניקות ביוכימיות וביולוגיה תאית ומולקולרית עדכניות כדי לנתח דגימות שנאספו ולהעריך את התגובה הפיזיולוגית הדינמית של הרקמה. המתודולוגיה שלנו מספקת כלי רב עוצמה לחקירת ההשפעה הפיזיולוגית של ייצור חולף של ROS אנדוגני ברקמה in vivo. זוהי גישה ניסויית חדשה שעשויה להיות שימושית מאוד עבור חוקרים בתחום איתות ROS.