Name: ב Vivo הדמיה של התמרה יעילות של מיקוד הלב פפטיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: חקור פרוטוקול להערכת יעילות התמרה של פפטידים חודרי תא בדגם עכבר CD1. השיטה משלבת הדמיה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית לאיסוף מקסימלי של נתונים מחיה אחת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.Z. ו K.S.F. נתמכים על ידי האמריקני האיגוד לפיתוח מדען הפרס 17SDG33411180, ועל ידי מענק הוענק תחת האתגר החדשנות פיט (קמצוץ®), באמצעות מכון המדע הקליני ו טרנסלtional באוניברסיטת פיטסבורג.

הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת פיטסבורג אישרה את כל פרוטוקולי החיות שצוינו בפרסום זה לפני התחייבות לניסויים אלה בבעלי חיים.
הערה: פרוטוקול זה מפרט כיצד לבצע מחקרים vivo biodistribution תפלגות לשעבר ניצול הדמיה אופטית לשעבר vivo אופטי ואחריו במחקרים ביולוגיים vivo על ידי הטבעת האיברים בפרפין, הפצת, וביצוע מיקרוסקופ פלורסנט. למרות ש-CTP משמש לדוגמה, ניתן להחיל שיטה זו על כל מזהה התווית של CPP.
1. בהדמיה vivo
<ol><li>לסנתז ctp באמצעות שיטות סינתזה של שלב מוצק9,10 ממתקן סינתזה פפטיד באמצעות חומצות אמינו L-באמצעות שכותרתו N-טרמינוס עם cy 5.5 ו-C-טרמינוס amide-הכתיר עבור יציבות מוגברת. הערה: כל CPPs מסונתז צריך להיות מאופיין באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים ו/או מטריצה בסיוע לייזר/אינון (MALDI) לפני השימוש11.</li>
	<li>הפוך פתרון מניות של 1 מ"מ או 10 מ"מ של CTP ב-diמתיל סולפוקסיד (DMSO), aliquot, ואחסן ב-80 ° c, מוגן באור. הערה: פפטידים מועברים כאבקה ליאופ,. ניתן לאחסן את האבקה לטווח ארוך (6 חודשים-2 שנים) ב-20 ° c, מוגן באור ובתנאים היאלוסקופיים. כאשר מצוטטים ב DMSO ו מאוחסן, מחזורי הקפאת ההפשרה יש להימנע.</li>
	<li>שוקלים ומורדם 6-שבוע בן CD1 עכברים נקבה באמצעות 2 μL/g של משקל רקמות של פתרון קטמין/xylazine (100 mg/ק"ג ו 20 מ"ג/ק"ג xylazine) מנוהל בתוך הפנים (האחוריות) או intraperitoneally (רביע השמאלי התחתון). הערה: יש לרענן את הפתרונות קטמין/xylazine ביום השימוש. אין להשתמש בקטמין/xylazine כראוי ואמצעי אחסון המשמשים לעומת אמצעי אחסון שהושלכו ביומן, כאשר קטמין הוא חומר מבוקר. רמה נאותה של הרדמה תושג 5-7 דקות, כפי שמוערך על ידי חוסר תגובה צביטה בבוהן.</li>
	<li>לחשב 10 מ"ג/ק"ג מינון של Cy 5.5-CTP, לדלל עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) לא יותר מ 200 μL, ולהזריק או באמצעות הזרקת וריד הזנב באמצעות מזרק אינסולין (איור 1א).</li>
	<li>אפשר פפטיד לזרום עבור הזמן שצוין מראש, החל 15 דקות-6 h.</li>
	<li>המתת החסד העכבר באמצעות שיטה גבוהה שיתוף2 שאיפה החברה כפי שצוין על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה ולפתוח את חלל החזה באמצעות מספריים (איור 1B).</li>
	<li>מספריים להשתמש כדי למקם ניק קטן לרוחב, קיר חינם של האטריום הימני ולהזריק 3 מ ל של 10% באגירה מואגור ב-26 המחט G עבור המטרה הכפולה של זלוף תיקון האיברים של העכבר לרוקן את כדוריות הדם האדומות (איור 1ג).</li>
	<li>לנתח את הלב, הריאות, הכבד, הכליות, הטחול, המעי הגדול, המעי הקטן, שלפוחית השתן, השחלות/האשכים, ואת המוח ואת המקום לתוך בארות בודדות של 12 צלחת לvivo הדמיה אופטית לשעבר (איור 1ד).</li>
	<li>הפעל את תוכנת רכישת התמונות ולחץ על לחצן אתחול כדי להכין את המערכת לדגימות דימות. פתח את אשף ההדמיה, בחר את הקרינה הפלואורסצנטית, לאחר מכן לסנן זוג, ולאחר מכן בחר את Cy 5.5 לצבוע מתוך רשימת הצבעים כדי להחיל 580 ננומטר הריגוש ו 620 מסנני פליטה ננומטר. בחר הגדרות ידניות לפרמטרי חשיפה לאחר מכן הגדר את מיקום השלב ל-B, קבע זמן חשיפה לשניה אחת, הגדר את ה-F/stop ל-8, והגדר את האפשרות הקטנה ביותר. הערה: מסנני הפליטה של עירור ישתנו בהתאם לתווית שבשימוש. עירור ופליטה של התווית בשימוש ניתן להזין באופן ידני עבור התוכנה כדי להקצות עירור ומסנני פליטה. ודא שספירות הן בין 600-60000 כדי למנוע רוויה. בהתאם למערכת שבה נעשה שימוש, מיטוב הרכישה האוטומטי עשוי להיות זמין. אם למערכת יש פיצוי כדי להשוות תמונות שנרכשו עם הגדרות שונות, ניתן להשתמש בהגדרות האוטומטיות. אם אין פיצוי זמין, הגדרות יצטרכו להיקבע, לשמור ולהשתמש בעקביות בדגימות.</li>
	<li>כאשר המערכת מאותחלת לחלוטין, מסדרים את אברי העניין בצלחת של 12 ומניחים אותו בתוך חדר ההדמיה האופטי, ומבטיחים שהדגימות מסודרות לפי הצורך בתמונות. בחר רכישה ולאחר מכן בחר מיקום שמירה עבור התמונות. ניתן לכתוב מידע על העכבר לתוך החלון המוקפץ של תוויות תמונה.</li>
	<li>לאחר הדמיה, להסיר את הדגימות מן החדר ולאחסן 10% פורמלין באגירה בתוך אמצעי אחסון לפחות 20 פעמים את נפח הרקמה בבקבוקונים מבחנות עם הגנה קלה בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לכמת את התמונות על ידי הגדרת יחידות כדי קורן יעילות מכן בחירת ההחזר 4x3 והתאמה כדי להתאים כל טוב לתוך ריבוע אחד של ROI באופן שווה, ואחריו לחיצה על מדידה. פתח את הכרטיסיה מדידות של הרשת ROI, בחר ייצוא ושמור את המידות כקובץ. קורות חיים.</li>
</ol>2. היסטולוגיה
הערה: בצע את שלבים 1.1-1.8 כדי להשיג איברים שונים. לחילופין, ניתן להציב את אותם איברים שנוצרו באמצעות התמונה באופן מיידי ולהשתמש בו להצבת המידע המפורט להלן.
<ol><li>אחסן כל איבר בנפרד 10% פורמאלין פוספט באגירה למינימום של 48 h לפני עיבוד עבור היסטולוגיה.</li>
	<li>כאשר האיברים הם קבועים מספיק אחרי 48 h, להעביר את האיברים לעיבוד רקמות והטבעה של קלטות ומקום לתוך מכונת עיבוד רקמות (איור 1E).</li>
	<li>הגדר את מכונת העיבוד כדי ליטול את הרקמה ב 70% אתנול עבור 30 דקות, ואחריו 80% אתנול עבור 30 דקות, 95% אתנול עבור 30 דקות, 95% אתנול עבור 30 דקות, 100% אתנול עבור 15 דקות, 100% אתנול עבור 20 דקות, ולבסוף 100% אתנול עבור 20 דקות.</li>
	<li>נקה את הרקמה ב קסילן 2x, עם 30 דקות עבור כל טיפול קסילן.</li>
	<li>לחדור את הרקמה הנקיה עם פרפין 4x ב 60 ° c עבור 30 דקות עם כל טיפול.</li>
	<li>הטמע פרפין בעזרת תבניות מתכת. ממלאים את העובש בפרפין מותך (שנשמר ב65 ° c), ומעבירים לצלחת קרה. כמו פרפין בתחתית העובש מתחיל לגבש, מניחים את האיבר לתוך פרפין (איור 1F).</li>
	<li>מניחים מחסנית על תווית על גבי העובש כגיבוי ומילוי יתר עם פרפין מותכת. אפשר להתקרר עד שיהיה מוצק. ואז לאחסן את הבלוק ב-20 ° c מקפיא לילה, המאפשר שעווה להתכווץ עוד להסרה קלה של התבניות. הערה: בלוקים יכול כעת להיות מאוחסן ב-RT עם הגנה קלה.</li>
	<li>הכינו אמבטיית מים ב38 ° c עם מים מזוקקים. הגדר את המיקרוטומה עם זווית להב של 6 ° ועובי מקטע של 10 μm.</li>
	<li>הר גושי רקמות ב מיקרוטום ולהתחיל חיתוך עד סעיפים המכילים רקמות מתקבלים. ואז למקם את הפנים בלוקים למטה במים עבור 5 דקות או עד הרקמה ספג כמה לחות (למשל, כאשר קו מתאר לבן דק של הרקמה מופיע בלוק [איור 1g]). הערה: יש להחליף את הלהב בתדירות גבוהה כדי להבטיח את איכות המקטעים.</li>
	<li>מניחים את הרקמה על בלוק קרח שטוח במשך 10 דקות, ואז להחזיר אותו המיקרוטומה בכיוון זהה כמו בשלב 2.9. התחל לקחת סעיפים ואפשר מקטעים חתוכים ליצירת רצועות ארוכות של 6-10 סעיפים כל אחד. התעלם מרצועות פרפין מיטביות עד שרצועת הכלים באיכות גבוהה של אורך מספיק כדי לכסות שקופית מופקת. מיטוב הסדר על ידי התאמת מהירויות חיתוך, לחות רקמות, וטמפרטורת אמבט מים כדי למנוע הטיית או קמטים של מקטעי הרקמה. הערה: סעיפים שיש להם חורים שבהם הרקמה נפלה, קורע את הרקמה, או קמטים וקפלי הדוק ברקמה צריך להיות מושלך.</li>
	<li>בחר בקפידה את רצועת הכלים של איכות הבחירה עם מלקחיים בצד קהה ולצוף על פני השטח של האמבטיה 38 ° c. תנו לסעיפים לשבת על פני השטח עד שהם מסתדרים, ודואגים לא להשאיר אותם יותר מדי זמן כדי למנוע מהפרפין להתפרק ולקרוע את הקטע.</li>
	<li>הצפת המקטעים המשוטחים על פני שקופיות זכוכית נקיות. מניחים את השקופיות בתנור של 65 ° c במשך 30 דקות כדי להמיס את השעווה. הערה: ניתן לאחסן שקופיות אלה ב-RT עם הגנה קלה.</li>
	<li>השאר את השקופיות בתוך קסילן 3x, 10 דקות עבור כל טיפול.</li>
	<li>מימה את הרקמה ב 100% אתנול עבור 5 דקות, ואחריו 95% אתנול עבור 5 דקות, 70% אתנול עבור 5 דקות, 50% אתנול עבור 5 דקות, ולבסוף 1x טריס באגירה מלוחים (TBS) עבור 5 דקות (איור 1H). אפשר לשקופיות להתייבש במשך הלילה. הערה: ניתן לאחסן שקופיות אלה לטווח ארוך ב-RT, כל עוד הן מוגנות באור.</li>
	<li>הר את השקופיות עם coverslips באמצעות 125 μL של התקנת מדיה המכילה 4 ′, 6-diamidino-2-פנילילינדול (DAPI), החללית פלורסנט גרעינית (איור 1I). שקופיות יבשות ללילה בשעה RT, מוגן באור. הערה: ניתן לאחסן שקופיות מיובשות בטווח הארוך ב -4 ° c, מוגן באור.</li>
	<li>שקופיות תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט. הערה: יש להימנע מתמונות רוויות, מאחר שהן אינן שימושיות כמותית. התאמת החשיפה והגדרות הרווח ניתנת להורדת כדי להימנע מרוויה. לטפל להשתמש באותן הגדרות על פני הדגימות להיות לעומת. הימנע הלבנת הרקמה על ידי הגבלת זמני חשיפה.</li>
</ol>

<ol><li>Green, M., Loewenstein, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+functional+domains+of+chemically+synthesized+human+immunodeficiency+virus+tat+trans-activator+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein.</a> Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).</li>
<li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).</li>
<li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+transduction%3A+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li>
<li>Zahid, M., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+penetrating+peptides%3A+therapeutic+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges.</a> Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).</li>
<li>Zahid, M., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+tissue-specific+protein+transduction+domains+using+peptide+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display.</a> Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).</li>
<li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cardiac+specific+protein+transduction+domain+by+in+vivo+biopanning+using+a+M13+phage+peptide+display+library+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice.</a> PLoS One. 5 (8), e12252(2010).</li>
<li>Zahid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Targeting+Peptide%2C+a+Novel+Cardiac+Vector%3A+Studies+in+Bio-Distribution%2C+Imaging+Application%2C+and+Mechanism+of+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction.</a> Biomolecules. 8 (4), E147(2018).</li>
<li>Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+protocols+of+modern+solid+phase+Peptide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis.</a> Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).</li>
<li>Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+peptides+on+solid+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of peptides on solid phase.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).</li>
<li>Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Synthetic+Peptides+by+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).</li>
<li>Arms, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+Limitations+of+Current+Techniques+for+Analyzing+the+Biodistribution+of+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 802(2018).</li>
<li>Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+whole-body+fluorescence+imaging%3A+Review+of+instruments%2C+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).</li>
<li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choose+your+label+wisely%3A+water-soluble+fluorophores+often+interact+with+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649(2014).</li>
<li>McGowan, J. W., Bidwell, G. L. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Ex+Vivo+Whole-organ+Imaging+and+Quantitative+Tissue+Histology+to+Determine+the+Bio-distribution+of+Fluorescently+Labeled+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54987(2016).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
</ol>

M.Z. ופול ד. רובינס (אוניברסיטת מינסוטה, מינסוטה, MN, ארה ב) להחזיק פטנט על השימוש של פפטיד מיקוד הלב כמו וקטור לב (לבלב ספציפי חלבון מיקוד התחום, U.S. פטנטים סדרתי No. 9,249,184). M.Z. משמש גם כקצין מדעי ראשי, והוא במועצת המנהלים של האתחול Vivasc Therapeutics Inc. והוא מחזיק הון עתידי משמעותי בו.

מודלים בעלי חיים חיוניים לפיתוח תרופות טרום-קלינית בכל שלב של התהליך מזיהוי של CPPs הרומן, לימודי biodistribution פצה, מנגנון התמרה, בסופו של דבר בדיקה ליעילות של המטען המועבר באמצעות הרומן הזה CPPs כמו וקטורים. ישנן שיטות רבות המשמשות בשימוש נפוץ כדי להעריך biodistribution פצה כגון היסטולוגיה, הדמיה גרעינית התרופה (הזהיר ו PET), ו vivo אופטי הדמיה12. שיטות הדמיה גרעינית יכול להיות מסורבל בשל הזמינות מוגבלת של בעלי חיים קטנים ומערכות לחיות מחמד, כמו גם את היכולת לייצר radiolabel-מחוות הסמים, אשר דורשים את המומחיות של רדיוכימאי. לעומת זאת, תוויות פלורסנט הם הרבה יותר פשוט והוא יכול להיות חסכוני לעבוד עם. הפרוטוקול המתואר במאמר זה מאפשר ניתוח מהיר של ביוהפצה באמצעות שיטות מרובות. Vivo Ex הדמיה האיבר האופטי האיברים מאפשר השוואה מיידית של זריחה על פני רקמות שונות וקבוצות טיפול והוא יכול לזהות ספיגת איברים וזמן כדי ספיגת שיא באיבר העניין באופן כמותי למחצה. היסטולוגיה רקמות כמותי דורש עיבוד נרחב יותר לטיפול, סעיף, תמונה, ולנתח רקמות, אבל זה מספק יותר נתונים על רמת מיקרוסקופיים והוא טכניקה סטנדרטית הנוכחי. כדאי לציין כי השוואה ישירה, כמותית על פני שתי טכניקות אינו אפשרי, משום שניתן לראות את האוטופלואורסצנטית עם כל טכניקה עבור איברים שונים ואורכי גל עירור משתנה באופן משמעותי.
חלק חשוב בפרוטוקול זה הוא בחירת fluorophore ימינה כדי תווית מועמד CPPs עבור ניסויים. בעיה פוטנציאלית אחת היא החפיפה של ספקטרום, אשר יכול להיות בעייתי כאשר fluorophores מרובים נחוצים. המדיה הפלואורסצנטית DAPI הרכבה ו-Cy 5.5 אין ספקטרום חופפים. עם זאת, עבור יישומים מסוימים שבו fluorophores מרובים נחוצים, הסיכון של חפיפה ספקטרלי צריך להיחשב בזהירות. בהתאם למערכת הנמצאת בשימוש, בחירת fluorophore עשויה להיות מוגבלת. לכן, הידע על יכולות המערכת הוא המפתח. פלורסנט מערכות אופטיות מנוצל הטוב ביותר עם fluorophores הרבה אדום או קרוב אינפרא אדום בשל ספיגת רקמות גבוהות של אורכי גל קצרים13. Fluorophores בטווח של חלבון פלורסנט ירוק משופר יש מגבלה גדולה, כי יש האיבר משמעותי מאוד autoפלואורסצנטי לראות את הגל שלה עירור, במיוחד במוח רקמת הכבד. בהתאם לתנאים של ניסוי, fluorophores כמה הם הטובים ביותר להימנע. כמה מסיסים במים fluorophores אורגני יש אינטראקציה חזקה עם bilayers השומנים, אשר יכול לגרום תוצאות חיוביות שווא. מכאן, נקיטת צעדים כדי לקבוע אם fluorophore יש זיקה חזקה לרקמת העניין הוא רצוי14. גורם נוסף לשקול הוא בחירת השיטה המתאימה של הקונפפור, אשר יכול להיות פרמטר חשוב המשפיע על התוצאות. ניתן לתייג את cpps באמצעות קשר כלשהו בין n-הטרמינוס של הפפטיד לבין קבוצת קרבוקסילי של הצבע כגון cy 5.5-בי. הטיפול צריך להילקח, כי מנגנון התמרה של רוב CPPs אינו מובן בפרוטרוט והקוניוגציה בקצה אחד עשויים להשפיע על מנגנון ספיגת יותר כך מאשר בקצה השני. אפשרות נוספת עבור תיוג CPPs היא דרך biotinylating N-טרמינוס עבור בניינים כדי fluorescently בתווית. באמצעות אסטרטגיה זו יש את הנוחות של מתן אפשרות שונים פלורסנט streptavidin השערים להיות מנוצל. עם זאת, מגבלה אפשרית של אסטרטגיה זו היא שקומפלקס ביוטין-streptavidin הוא מבנה גדול, שעלול להפריע להתמרה.
פלורסנט מערכות דימות אופטי הם אסטרטגיה יעילה ליצירת השוואה של זריחה על פני איברים שונים וטיפולים ביעילות אך אינם מסוגלים לייצר מידה כמותית של ריכוזים מוחלטים ברקמה. זאת בשל השפעות פיזור אור בתוך הרקמה, אשר מורכב עוד יותר על ידי מגוון טבעי בגדלים וצפיפויות רקמות, והבדלים ב vascularity עם פיזור משתנה של זריחה. הרקמה האוטומטית של רקמות יכול להיות גורם גם, בשל התרחשות טבעית מקורות ביוכימיים כגון קולגן, או מקורות תזונתיים כמו כלורופיל במזון13.
היסטולוגיה היא השיטה הנפוצה ביותר למדידת biodistribution והוא עלול לשמש כדי למדוד במדויק ולהשוות ספיגה בין רקמות שונות לאורך זמן. בעיות פיזור אור נמנעים באמצעות שיטה זו מכיוון שכל הרקמות מנות לעובי זהה15. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לכלול מדבקות פלורסנט נוספות החותמות עבור אימונוהיסטוכימיה. למרות התוספת של fluorophore אחר יכול להפוך הדמיה מאתגרת יותר, השימוש בתוויות פלורסנט יכול להיות שימושי עבור לוקליזציה של CPP לתאי תאיים מסוימים, כמו lysosomes או המיטו,. ניתן להשתמש בנוגדן לניסוי מיקרוסקופ ממוקד כדי לקבוע אם המועמד העומד בפני מבנה CPP משתמש במבנה של עניין, שיכול להראות את הפוטנציאל של CPP כסוכן משלוחים. מגבלה אחת של שיטה זו היא כי הכנת שקופיות מדגימות איברים יכול לגזול זמן רב, עבודה אינטנסיבית, ונטייה לטעות אנוש12,15. כאשר שקופיות הדמיה, הטיפול צריך להילקח לא תמונה באותו מיקום יותר מדי זמן כדי למנוע הלבנת. Photobleaching לבנת חלק יהיה בלתי נמנע, בהתאם לרגישות של fluorophore. הטיפול צריך להילקח בכל שלב של פרוטוקול זה כדי להגן על דגימות מאור הסביבה ולאחסן אותם כראוי16. מומלץ לאחסן את השקופיות ב -4 ° c, מוגנות באור, להדמיה עתידית.
קיימות מגוון שיטות זמינות למדידת ההתפלגות הביומלית של מועמד CPP המחייב ציוד מיוחד והוא יכול להפיק תוצאות דומות, למרות שהם עשויים לדרוש תיוג מורכב יותר של CPP. הפרוטוקול המתואר במאמר זה משתמש בשתי שיטות תואמות כדי לייצר ביעילות נתוני הפצה ביולוגיים בהקשר של מערכת חיים, תוך מתן אפשרות לרכישת מידע מעמיק יותר אודות פפטיד הפנמה בתוך תאים מאותה דוגמית, ובכך לחתוך את מספר בעלי החיים הדרושים למחקר על ידי חצי. שיטות אלה שימשו להפקת הנתונים הנ ל, אשר מדגימים כי שתי השיטות יכולות להיות מנוצל באופן רציף באותה חיה, ואת איכות הנתונים שנוצרו על ידי כל אחד. התוצאות שלנו מדגישות גם את חוסר היכולת לתאם ישירות את התוצאות בין שתי הטכניקות באופן כמותי.

קרום פלזמה התא הוא מכשול חדיר למחצה, כי הוא חיוני עבור שלמות התא והישרדות ומשמש כדי לווסת את הפנים של התא על ידי שליטה תנועה של חומרים לתוך התא. למרות שהוא חיוני להישרדות, הוא מציג גם מכשול להעברת מטענים לתא. ב 1988, טרנס activator של תמלול (תאת) חלבון של וירוס הכשל החיסוני האנושי הוכח להיכנס לתאים מתורבתים ולקדם ביטוי גנים נגיפי1,2, עם תחומים האחראים התמרה זה מוגבל ארגינין ו ליזין עשיר 13-אמינו באזור של הסליל השלישי3 אלה היו ובכך נקרא פפטידים חדירה לתא (cpps). זה היה לאחר מכן מחקרים המראים את היכולת של פפטיד תאת לשאת β-גלטוסידאז פונקציונלי לתוך סוגי תאים מרובים4. מאז התיאור הראשוני, מספר הפפטידים חודר התא גדל באופן דרמטי. תחומים אלה התמרה מתרחשות באופן טבעי או פפטידים קצרים, בדרך כלל 6-20 חומצות אמינו ארוכות, כי הם מסוגלים לשאת מטענים פונקציונליים על פני קרום התא. מטענים אלה יכולים לנוע בין פפטידים קטנים אחרים, חלבונים באורך מלא, חומצות גרעין, חלקיקים, חלקיקים נגיפי, מולקולות פלורסנט, רדיואיזוטופים5. CPPs הראשונית תיאר לא היו ספציפיים לתא, עם תאת להיות נלקח על ידי סוגי תאים מרובים ואף לחצות את מכשול המוח בדם4, ומכאן הגבלת הפוטנציאל התרפויטי שלה. על מנת לזהות CPPs ספציפי לתא, החוקרים הננקטות להציג phage ניצול גדול, מסחרית זמין בספריות phage6. העבודה שלנו באמצעות קומבינטורית ב מבחנה vivo phage להציג מתודולוגיה הובילה לזיהוי של CPP בשם מיקוד הלב פפטיד (CTP)7, חומצה 12-אמינו, פפטיד בלתי טבעי (NH2-APולג-cooh) כי מטרות הלב עם ספיגת שיא ב 15 דקות לאחר הזרקה היקפית ורידית8. באמצעות מערכת immunofluorescent לוקליזציה עם actin, סמן תאיים, והדרה של למינציה, סמן ממברנה התא, הראנו כי CTP הוא הפניציטים העכבר לאחר הזרקה ורידית7. בנוסף, אנו מודקות גזע האדם המושרה pluriפוטנטי תאים-הכאתו קרדיוגנול עם CTP בעל תווית כפולה, מתויג עם 6-carboxyfluorבתוך C-טרמינוס ו rhodamine ב שלה N-הטרמינוס דרך הצמדה אסתר זה יכול להיות רק ביקע על ידי מוחק תאיים. הצטברות מהירה של הרודטין למכות קרדיוציטים נצפתה בתוך 15 דקות במיקרוסקופיה מיקרוקלית8.
במאמר זה, אנו מציגים שתי מתודולוגיות בחינם שניתן להשתמש בהן כדי לעקוב אחר התפלגות ביולוגית ולאשר הפנמה ספציפית לרקמות של CPPs באמצעות CPPS כדוגמה. עבור מתודולוגיות אלה, CTP היה מסונתז, מתויג בקביעות ב-N-טרמינוס עם cyanine 5.5 (CY 5.5), ו אמיד-הכתיר ב C-טרמינוס ליציבות פפטיד יותר. שתי המתודולוגיות המשמשות הן במערכות דימות אופטיות vivo ומיקרוסקופית פלורסנט של מקטעי רקמות. שתי השיטות הן מאוד שימושיות בלמידה biodistribution פצה, ספיגה, וחיסול של CPPs בתווית מתויג. היתרון של הערכת biodistribution פצה באמצעות שיטות אלה על אחרים, כגון טומוגרפיה בודדת פוטון (הפסיכומטרית) או פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה (PET), הוא שאין צורך בזמן רדיויניום אינטנסיבית של CPPs לעומת תיוג פלורסנט, אשר קל יחסית ובשימוש שגרתי בכל מתקני סינתזה פפטיד. השימוש ב vivo הדמיה מייצרת במהירות נתונים biodistribution בהקשר של מערכת החיים, תוך הימנעות מספק מידע מעמיק יותר על ספיגת פפטיד ולוקליזציה בתוך תאים באמצעות שימור של פירוט מורפולוגית. פרוטוקול זה ניתן להחיל על מגוון רחב של איברים ורקמות כגון הלב, ריאות, כבד, כליות, מוח, טחול, קיבה, המעי הגס, המעי הדק, שריר השלד, עצם, האשכים/שחלות, ועיניים.

<table><tbody><tr><td>10% פורמלין פוספט חוצץ</td><td>ThermoFisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris Buffered Saline (TBS)ThermoFisher</td><td></td> <td>BP2471-1</td><td></td></tr><tr><td>12 בארות צלחת תרבית תאים</td><td>ThermoFisher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>1x TBS Solution</td><td></td><td></td><td>10x TBS מדולל 1:10 במים נטולי יונים. ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>בקבוקוני נצנוץ 20 מ"ל</td><td>וויטון</td><td>334173</td><td></td></tr><tr><td>26 גרם מחטים</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>28 גרם 0.5 מ"ל מזרקי אינסולין</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל מזרק</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>CD1 עכברים</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>022</td><td>לבקנים בני 6 עד 12 שבועות, עכברים נקבות</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>ThermoFisher</td><td>12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5-CTP-amide</td><td></td><td></td><td>מוכן על ידי סינתזת פפטידים, מצומד עם פלואורופור Cy5.5 ומטוהר באמצעות HPLC. אבקה ליופילית מורכבת מחדש ב-DMSO בריכוז של 10 מ"מ. לאחר הבנייה מחדש, יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn מספריים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 14084-08</td><td></td></tr><tr><td>קטמין HCl 100 מ"ג/מ"ל</td><td>KetaVed</td><td>NDC 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td> <td>קטמין/קסילזין</td><td>קטמין הידרוכלוריד מעורבב עם קסילזין 1:1 לייצור תמיסת מלאי המכילה 50 מ"ג/מ"ל קטמין ו-10 מ"ג/מ"ל קסילזין. תמיסה זו נעשית טרייה לפני כל שימוש.</td></tr><tr><td>Leica RM2235 מיקרוטום סיבובי</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>ThermoFisher</td><td>B9992000TN</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Sigma</td><td>P3808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>פרקין אלמר לומינה S5 IVIS</td><td>פרקין אלמר</td><td>CLS148588</td><td></td></tr><tr><td>מנקה עדשות אופטי נוצץ</td><td>ThermoFisher</td><td>NC0090079</td><td></td></tr><tr><td>עיבוד רקמות/ הטמעת קלטות</td><td>ThermoFisher</td><td>NC9499605</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP מכונת עיבוד</td><td>רקמות-טק</td><td>VIP 5A-F1</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין 20 מ"ג/מ"ל</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>קסילנים</td><td>ThermoFisher</td><td>X5-4</td><td></td></tr></tbody></table>

ב vivo הדמיה של התמרה יעילות של מיקוד הלב פפטיד

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

מאז התיאור הראשוני של תחומים התמרה חלבונים, הידוע גם בשם פפטידים חודר תאים, לפני 25 שנים, יש כבר עניין אינטנסיבי בפיתוח אלה פפטידים, במיוחד תאים ספציפיים, כמו וקטורים הרומן עבור אספקת חומרים האבחון והטיפולי. עבודת העבר שלנו מעורבים תצוגת phage זיהה רומן, לא טבעי המתרחשים, 12 חומצות אמינו-פפטיד ארוך שאנו בעלי שם מיקוד הלב פפטיד (CTP) בשל יכולתה לשנות את רקמת הלב נורמלי בvivo עם ספיגת שיא לראות מעט כמו 15 דקות לאחר הזרקה ורידית. עשינו מחקרים ביולוגיים מפורטים על ידי הזרקת CTP עם שכותרתו fluorophore 5.5, המאפשר לו להסתובב לפרקי זמן שונים, המתת חסד, תיקון, והפצת איברים מרובים ואחריו הדמיה מיקרוסקופית פלורסנט. בפרסום זה, אנו מתארים תהליכים אלה, כמו גם הדמיה vivo ex של איברים שנקטפו באמצעות מערכת הדמיה vivo בפרוטרוט. אנו מספקים מתודולוגיות ושיטות מפורטות לצורך התמרה ומחקרים ביולוגיים באמצעות CTP כדוגמה.

באמצעות פרוטוקול זה, התייחסו שלושה עכברים עם מינון 10 מ"ג/ק"ג של Cy 5.5-CTP דרך הזרקה רטרו מסלולית (איור 1א). לאחר שהוא מאפשר פפטיד להסתובב 15 דקות, העכברים הורדמים באמצעות חדר CO2 , החזה נפתח דרך חתך האונה החציוני, האטריום הימני היה עצור, ואת העכברים זלוף קבוע באמצעות 3 מ ל 10% פוספט באגירה (איור 1B, ג). לאחר קיבעון, הלב, הריאות, כבד, כליות, טחול, ואת המוח היו גזור וסידר בצלחת 12 הבאר עבור הדמיה פלורסנט vivo אופטי ex (איור 1D ואיור 2א). שלושה עכברים שליטה עם זריקות לא היו גם מוכן, גזור, בתמונה (איור 1b-D ואיור 2ב). הנתונים הפלואורסצנטית שנרכשו עבור כל קבוצה של איברים ניתן להשוות בשל ספירות להיות המרה ליעילות קורן, יחידת הזריחה היחסית של תוכנת ההדמיה. ניתן לכמת נתונים אלה כדי להניב הן תמונות איכותיות והן נתונים כמותיים עבור כל איבר הנדון (איור 2ג) על פני נקודות זמן שונות עבור לימודי הפצה ביולוגית. הקרינה האוטומטית של איברים שונים בתגובה אורכי גל עירור שונים מוצג באיור 3A-E. אורכי גל עירור קצר יותר, כגון חלבון פלורסנט ירוק משופר (EGFP), משויכים לניאון גבוהה יותר, במיוחד בכבד ובמוח, מאשר באדום הרחוק (Cy 5.5) או בסמוך אינפרא אדום (Cy7) עירור אורכי גל (איור 3). איברי הדימות תוקנו ב-10% פוספט באגירה מפוספאט בשעה RT למינימום של 48 h, ואחריו העברה לעיבוד רקמות והטמעה של קלטות (איור 1E). האברים עובדו והוקמו במכונת עיבוד רקמות, הממוקמות בתבניות מלאות בפרפין, קפואות בשלב של 20 ° c ואוחסנו במשך הלילה ב-20 ° צ' (איור 1F). הדגימות היו מנות (איור 1G) וטיפל בחילופי פתרונות כדי לחדש את הרקמה (איור 1H). השקופיות המוכנות נטענו לאחר מכן עם מדיום הרכבה DAPI (איור 1I). לאחר ייבוש, בדרך כלל בן לילה, השקופיות היו תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט. תמונות מייצגות של כל איבר מעכבר מוצגים באיור 4א. התמונות מאיברים שונים נרכשו באמצעות הגדרות זהות כדי לאפשר השוואה בין עכברים, כדי לאפשר כימות (איור 4ב).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig1.jpg"> איור 1: קצירת איברים של העכבר עבור הדמיה פלורסנט vivo אופטי לשעבר והשחרים. (א) סוג העכבר הפראי הזריקרטרו-אורקובאלי עם ctp-cy 5.5. (ב) העכבר לגזור עם החזה נפתח, הימני פרוזדור שנכרת, עבור קיבוע זלוף. (ג) לב שהוזרק עם 3 מ ל של 10% של פוראלין פוספט באגירה עבור קיבעון הפרזיה של החיה. (ד) איברי הריבית שנקטפו ומסודרים בצלחת 12 היטב עבור דימות אופטי פלורסנט. (E) הלב נטען לתוך קלטת ומעובד באמצעות מעבד רקמות. (ו) לב המוטבע בפרפין. (ז) שמתי לב במיקרוטומה. (ח) שקופיות מסוימות בסדרה של חילופי פתרונות. (I) סעיפים הנטענים עם שמיכות באמצעות dapi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig2v2.jpg"> איור 2: תמונות מייצגות מאיברים שטופלו ושליטה. (א) איברים של עכבר שטופלו עם 10 מ"ג/ק"ג Ctp-cy 5.5. (ב) איברים מעכבר שליטה ללא מטופל. (ג) קוונפיקציה של קרינה פלואורסצנטית עבור כל קבוצה של איברים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig3v2.jpg"> איור 3: איברי העכבר מטופל התמונה על הפליטה עירור שונים גל כדי להדגים כיצד אורכי גל ארוכים יותר לייצר פלואורסצנטית אוטומטי פחות. (א) Cy7 -740-790. (ב) cy 5.5: 660-710. (ג) Cy5: 620-670. (ד) Cy3: 520-570. (E) egfp: 480-520. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig4.jpg"> איור 4: התמרה של הלב, הריאות, הכבד והכליה לאחר הזרקה בתוך ורידי עכברים. עכברים סוג פראי הוזרק עם 10 מ"ג/ק"ג של Cy 5.5-CTP, או פפטיד אקראית (RAN-Cy 5.5), ו מורדמים בנקודות הזמן המצוין. (א) שיא של רקמת הלב נראה ב 15 דקות עם ירידה יציבה בזריחה לאורך זמן. ספיגת נימים כמה היה ציין בריאות עם התמרה חזקה בכבד, כמו גם על נימי הכליה בכליות, האחרון רומז מנגנון כליות של הפרשה. (ב) כימות של עוצמת פלורסנט מראה באופן משמעותי ספיגת לב מוגברת של ctp-cy 5.5 מעל רן-cy 5.5. סרגל קנה מידה = 500 μm. דמות זו שונתה מ-Zahid ואח '8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

אנו מתארים פרוטוקולים עבור הערכת מידת התמרה על ידי תאי-חודר פפטידים ניצול מערכות הדמיה vivo ex ולאחר מכן הטבעה פרפין, ומיקרוסקופית פלורסנט קונפוקלית וקד באמצעות מיקוד הלב פפטיד כדוגמה. בפרוטוקול שלנו, בעל חיים יחיד יכול לשמש לרכישת שני סוגים של הערכת הדמיה של אותם איברים, ובכך לחתוך את מספר בעלי החיים הדרושים ללימודים על ידי חצי.

ב Vivo הדמיה של התמרה יעילות של מיקוד הלב פפטיד

Since the initial description of protein transduction domains, also known as cell penetrating peptides, over 25 years ago, there has been intense interest ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו לעקוב אחר הפצה ביולוגית ולאשר את ההפנמה הספציפית לרקמות של פפטיד של עניין באמצעות שתי מתודולוגיות נפרדות אך משלימות. אנו יכולים להשתמש בפרוטוקול זה כדי למקסם את הנתונים המתקבלים מבעל חיים יחיד ולרכוש נתוני הדמיה פלואורסצנטיים כמותיים. בנוסף, אנו יכולים להשיג תמונות מיקרוסקופ איכותיות.לאחר רכישת C-terminus שלב מוצק מסונתז C-terminus כובע CTPs עם N-terminus שכותרתו עם Cy5.5 ממתקן סינתזה פפטיד, להפוך אחד או 10 מילימולר פתרון מלאי aliquot של CTP ב דימתיל סולפוקסיד לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. ביום הניסוי, לטעון מנה של 10 מיליגרם לקילוגרם של Cy5.5 CTP ב 200 microliters של PBS לתוך מזרק אינסולין. שקלו עכבר והעבירו את הפפטיד דרך הווריד לעכבר ה-CD1 הנשי בן ששת השבועות.אפשר לפפטיד לזרום לתקופת הזמן הניסיונית שצוינה מראש לפני המתת חסד של העכבר באמצעות תא CO2 בעל זרימה גבוהה ושימוש במספריים כדי לפתוח את חלל החזה ולהפוך חתך קטן בקיר החופשי בצדדים של ה אטריום הנכון. השתמש מזרק חמישה מיליליטר מצויד מחט מד 26 כדי לתבונן שלושה מיליליטר של 10% אוגר פורמלין פוספט דרך איפקס החדר השמאלי כדי לתקן את הרקמות כדי לשטוף את כל תאי הדם האדומים. לאחר מכן לאסוף את הלב, הריאות, הכבד, הכליות, הטחול, המעי הגס והקטנה, שלפוחית השתן, השחלות או האשכים, ואת המוח לתוך בארות בודדות של צלחת 12 באר עבור הדמיה אופטית לשעבר ויוו.להדמיית in vivo של התמונות שהותנו ב- CTP, הפעל את תוכנת רכישת התמונה ולחץ על אתחול כדי להכין את המערכת להדמיה. פתח את אשף ההדמיה ובחר זוג פלואורסצנטיות וסינון. לחץ על שמות, צבעים, ציאניד ו- Cy5 כדי להגדיר את פרמטרי העירור וההפחתה.ולחצו על 'הגדרות ידניות' כדי להגדיר את החשיפה לשנייה אחת, את החיבור ל-Small, את ה-F/Stop לשמונה ואת שדה התצוגה ל-15 ס"מ. לחץ על רכוש והגדר את התיקיה שבה יש לשמור את הדוגמאות. הוסיפו את המידע הניסיוני המתאים בחלון 'עריכת תוויות תמונה' ולחצו על הלחצן 'אשר'. התמונה שנרכשה תופיע.הגדר את היחידות ליעילות קורנת. לחצו פעמיים על התמונה ולחצו על 'תיקונים' ו'חיסור רקע פלואורסצנטי מסתגל'. התאם את הסף כדי לכסות רק את איברי העניין בסגול.לחלופין, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר חתוך אזור כדי לצייר תיבה המכילה את כל הדוגמאות המעניין. כאשר כל התמונות נרכשו, להעביר את הדגימות לתוך בקבוקונים scintillation המכיל 10% אוגר פורמלין פוספט בנפח של לפחות 20 פעמים מזה של הרקמה ולאחסן את הרקמות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור לפחות 48 שעות. כדי לכמת את התמונות, הגדר את היחידות ליעילות קורנת ואת אזור העניין לארבע על שלוש.התאם את אזור תיבת הריבית כדי לכסות באופן שווה את כל הבארים ולחץ על מדידת אזורים מעניינים. לאחר מכן לחצו על 'אזור רשת של מדידות עניין' כדי להתאים לתאי אזור העניין ולחצו על 'ייצוא' לשמירת הנתונים בקובץ טקסט או CSV. כאשר האיברים קבועים מספיק לאחר מינימום של 48 שעות, להעביר את הדגימות לתוך עיבוד רקמות הטבעה קלטות לטעון את הקלטות לתוך מכונת עיבוד רקמות.הגדר את המעבד לייבש את הרקמה עם אתנול כפי שצוין, ואחריו ניקוי עם שני טיפולים קסילן 30 דקות עירוי פרפין עם ארבעה 30 דקות טיפולים פרפין. לאחר הטיפול האחרון בפרפין, הסר את הרקמות ממכונת העיבוד. מניחים את הרקמות בתבניות מתכת בודדות ומרווים כל עובש בפרפין מותך.מניחים את התבניות על צלחת קרה. כאשר הפרפין בתחתית התבנית מתחיל להתגבש, מניחים את האיברים בפרפין. כאשר כל האיברים הונחו, מניחים קלטת מסומנת על גבי התבנית כגיבוי וממילוי יתר של התבניות בפרפין מותך.אפשר לפרפין להתקרר עד מוצק לפני אחסון בלוקים במינוס 20 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, להקים microtome עם זווית להב של שש מעלות ועובי קטע של 10 מיקרומטר ולהעלות את בלוקי הרקמה לתוך microtome. התחל לחתוך עד חלקים המכילים את הרקמה מתקבלים למקם את הבלוקים עם הפנים כלפי מטה באמבט מים מזוקק 38 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות או עד הרקמה ספגה קצת לחות.כאשר קו מתאר לבן דק של הרקמה מופיע בבלוק, מניחים את הרקמה על גוש קרח שטוח במשך 10 דקות לפני החזרתה למיקרוטום באותו כיוון שבו הוא היה טעון זה לזה. התחל להשיג פרוסות המאפשרות למקטעים חתוכים ליצור סרטים ארוכים של שישה עד עשרה מקטעים כל אחד. כדי להבטיח רכישת מקטע רקמות מוצלחת, שמור על הבלוק hydrated.החזר את הבלוק לקרח אם איכות המקטע ירודה או אם מתחיל לרדת. השלך סרטי פרפין תת-אופטימליים עד להפקת רצועת כלים באיכות גבוהה באורך מספיק כדי לכסות שקופית. השתמש בקצה קהה כדי להעביר סרטים איכותיים לתוך אמבט מים 38 מעלות צלזיוס ולתת את החלקים לשבת על פני השטח של המים מזוקקים עד שהם פשוט להחליק החוצה.לצוף את החלקים שטוחים על פני השטח של מגלשת זכוכית נקייה ולהמיס את השעווה בתנור 65 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. כדי deparaffinize את השקופיות, לטפל בדגימות שלוש פעמים עם קצילן במשך 10 דקות לטיפול. לאחר הטיפול האחרון קסילן, rehydrate את הרקמות עם חמש דקות יורד טבילות אתנול כפי שצוין, ואחריו טבילה של חמש דקות מלוחים טריס-buffered.לאחר מתן אפשרות לשקופיות להתייבש בן לילה, הר את החלקים עם כיסויים ו- 125 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה בתוספת DAPI וייבש את השקופיות בן לילה המוגנות מפני אור לפני הדמיה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר קיבעון, הלב, הריאות, הכבד, הכליות, הטחול והמוח מבעלי חיים ניסיוניים ושליטה מסודרים בצלחת של 12 באר להדמיה פלואורסצננטית אופטית לשעבר של vivo. עם המרת הספירות ליעילות קורנת, ניתן לכמת את נתוני הפלואורסצנטיות עבור כל קבוצה של איברים.חשוב לציין שאיברים שונים מפגינים פלואורסצנטיות אוטומטית בתגובה לאורכי גל שונים של בעירור. אורכי גל קצרים יותר של העירור כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר קשורים לרמות גבוהות יותר של פלואורסצנטיות אוטומטית במיוחד בכבד ובמוח מאשר אורכי גל של בעירור אדום או כמעט אינפרא אדום. קיבעון פורמלין והטבעת פרפין של מקטעי רקמות מכל איבר מאפשר ניתוח immunofluorochemical של סמני תאים מעניינים, כמו גם כימות של תאים חיסוניים או סטרומה של עניין בתוך כל רקמה.התאם את הגדרות ההדמיה כדי למנוע רוויה ועקוב אחר ההגדרות שלך ולאחר מכן החל את אותן הגדרות רכישה על דוגמאות אחרות באותו ניסוי לקבלת עקביות ודיוק. אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע גם על מקטעי הרקמות אם פפטיד חודר לתאים מועמד מתעניין במבנה או בחלבון מעניין.

in-vivo-imaging-transduction-efficiencies-cardiac-targeting

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הזרקת intramyocardial מלעורית מונחה אקו מייצגת שיטה יעילה, אמינה, וניתן למקד עבור המשלוח של סוכני העברת גנים או תאים לתוך הלב העכברי. בעקבות הצעדים המפורטים בפרוטוקול זה, המפעיל יכול להיות מוכשר במהירות בטכניקה תכליתית, פולשנית זו.

הזרקת Transthoracic Intramyocardial אולטרסאונד מונחה בעכברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה של הדמיית תאים חיים באמצעות קרדיומיוציטים ראשוניים של חולדות לאחר התמרה לנטיוויראלית ואדנוויראלית באמצעות מיקרוסקופ דיסק מסתובב קונפוקלי. זה מאפשר תצפיות מפורטות על תהליכים תאיים בקרדיומיוציטים חיים.

ההדמיה של תא חי של ראשוני cardiomyocytes ילודים החולדה בעקבות adenoviral וlentiviral התמרה באמצעות דיסק מסתובב confocal מיקרוסקופית

כאן אנו מציגים פרוטוקול תאים התמונה להביע קולטנים 1a סוג אנגיוטנסין-tagged חלבון פלואורסצנטי ירוק במהלך אנדוציטוזה ביוזמת טיפול אנגיוטנסין II. טכניקה זו כוללת lysosomes תיוג עם סמן פלואורסצנטי שני, ולאחר מכן ניצול תוכנה לנתח את שיתוף הלוקליזציה של הקולטן ליזוזום בשלושה ממדים לאורך זמן.

הדמיה של תא חי ו 3D הניתוח של אנגיוטנסין קולטן סוג סחר 1a בתאי הכליה טרנספקציה אדם העוברי באמצעות מיקרוסקופ Confocal

אסטרטגיות טיפוליות הרומן של רפואה רגנרטיבית הלב דורשים מקיף ומפורט הלימודים במודלים של בעלי חיים פרה גדולה לפני שהם יכולים להיחשב לשימוש בבני אדם. כאן, נדגים שיטה הזרקת intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ניגודיות מלעורית בארנבים, וזה יקר עבור בדיקת יעילותם של טיפולים חדשניים כאלה השערות.

הזרקת Intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ניגודיות מלעורית ואספקה תא בדגם פרה גדולה

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בעכברים. תחת הרדמה, הלבבות העכבר היו מוחצן בחלל הבין-צלעי הרביעי. לאחר מכן, adenoviruses גנים ספציפיים קידוד הוזרקו מזרק לתוך שריר הלב, ואחריו מדידה ביטוי חלבון באמצעות הדמיה ויוו ומערביות כתם ניתוח.

שיטה פשוטה ויעילה In Vivo מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב באמצעות הזרקת Intramyocardial בעכברים

שינויים מורפולוגיים מתרחשים בתאי החיסון החיסונית התגובה בעקבות ההפעלה ולקדם שינויים בגיוס הסלולר. ניצול 2-פוטון הדמיה בשילוב עם חלבון מהונדס בצורה גנטית לפיברוסט-1 (FSP1)-יצור; tdTomato פלומפולט-stop-floxed (tb/tb) קו העכבר הירוק fluorescently מתויג ליפופוליל-fitc, אנחנו יכולים להדגים ספיגה ספציפית מאוד של ליפופוליד בפיברוהכדורים ושינויים מורפולוגיים ב vivo.

ב Vivo שני צבעים 2-פוטון הדמיה של תאי כתב שתייגת גנטית בעור

פרוטוקול זה מציג דרך פשוטה וקוהרנטית לupregulate גן של עניין באמצעות modRNA לאחר אוטם שריר הלב בעכברים.

משלוח mRNA שונה במודל לעכבר אוטם שריר הלב

טיפול גנטי בשריר הלב למחלות לב איסכמיות טומן בחובו הבטחה גדולה לטיפולים עתידיים. כאן, אנו מציגים מודל חייתי גדול להערכת היעילות של ריפוי גנטי בלב איסכמי.

מודל בעלי חיים גדולים להערכת יעילות הטיפול הגנטי בלב איסכמי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש שיטות למתן חומרים טיפוליים קרדיואקטיביים במודל חזירי. נקבת החזיר קיבלה טיפול באמצעות: (1) הוראקוטומיה והזרקה טרנס-אפיקרדיאלית, (2) הזרקה טרנסאנדוקרדיאלית מבוססת צנתר, או (3) עירוי תוך ורידי באמצעות מיני-משאבה אוסמוטית של ורידים ג'וגולריים.

מתן טיפולים קרדיואקטיביים במודל אוטם שריר הלב חזירי

זקיק שיער הוא האיבר המורכב ביותר של העור המכילה ריבוי של סוגי תאים. הזקיק עובר אופניים קבוע דרך החיים של האורגניזם, כולל צמיחה resorption עם צמיחה תלויה בתאי גזע מסוים. המיקוד של זקיק ידי גנים בתאי גזע כדי לשנות את המאפיינים שלה, ובמיוחד את האופי של השערה הוא דן. זקיק שיער מערכות אספקת מתוארים, כגון ליפוזומים ו וקטורים ויראליים עבור ריפוי גנטי. האופי של זקיק השיער תאים גזע נדון, בפרט, pluripotency שלה.

ביטוי ממוקד של ה-GFP ב זקיק השיער באמצעות אקס התמרה Vivo ויראלי

חקור פרוטוקול להערכת יעילות התמרה של פפטידים חודרי תא בדגם עכבר CD1. השיטה משלבת הדמיה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית לאיסוף מקסימלי של נתונים מחיה אחת.

ב Vivo הדמיה של התמרה יעילות של מיקוד הלב פפטיד

גלה סרטונים נוספים