Name: בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: למדו לבודד פיברובלסטים ומיופיברובלסטים מלבות עכברים פגועים ובריאים באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי ומבחני RT-PCR. שיטה זו מאפשרת אפיון אוכלוסיות תאים טהורות לחקר תיקון פצעים ופיברוזיס לבבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות ד ר איבו Kalajzic עבור העכברים αSMA-GFP. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המוסדות הלאומיים לבריאות (NIH) תחת הפרס מספר R01GM118300 (האס), המכון הלאומי להדמיה ביו-רפואית וביוהנדסה של NIH תחת הפרס מספר R21EB019509 (P.P.Y.), ומענק פיתוח המדען של איגוד הלב האמריקני תחת הפרס מספר 17SDG33630187 (אס). מנתח זרימה cy, בוצעו ב-VUMC זרימה Cy, משאב משותף אשר נתמך על ידי מרכז הסרטן של ואנדרבילט Ingram (P30 CA68485) ואת מחלת העיכול ואנדרבילט מרכז המחקר (DK058404).

<ol><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Cardiac+Fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li>
<li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction%3A+From+Inflammation+to+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt1%2Fbetacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li>
<li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+myocardial+infarction%3A+a+role+in+inflammation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li>
<li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((View+from+the+heart%3A+cardiac+fibroblasts+in+development%2C+scarring+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li>
<li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li>
<li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Fibrosis%3A+The+Fibroblast+Awakens%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts%3A+implications+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li>
<li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+fibroblasts+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li>
<li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li>
<li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li>
<li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+fibroblast%3A+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li>
<li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts%3A+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

פיברותקיעות הם קבוצה הטרודוגני של תאים, מזוהה על ידי קבוצה מגוונת של סמנים. סמני החלבון ששימשו לזיהוי פיברוהטיים הם discoidin לקולטן תחום 2 (DDR2), fibronectin, vimentin, קולגן אני ו III, ו Thy115,16,17,18,19,20. בעוד vimentin נעשה שימוש כדי לזהות השקט השקטים ביותר, חלבון פיברוביסט, חלבונים ספציפיים αSMA, ו-קרום הגוף הוכחו לז...

פיברותקיעות לב, תאים של מוצא mesenchymal, לשחק תפקיד משמעותי בשמירה על הולכה חשמלית וכוחות מכניים בלב בנוסף תחזוקה של אדריכלות לב במהלך הומאוסטזיס1. בעקבות פציעה, תאים אלה מופעלים, להרחיב, ולייצר מטריצה החילוץ (ECM) חלבונים2. מחקרים רבים קדם קליניים חשפו פיברומופיצוצים כמו הרגולטורים הסלולר קריטי השומרים על השלמות המבנית של הלב הפצוע3 , כמו גם התאים העיקריים אפקטור אחראי על ייצור לא מסומנת והפקדת חלבונים ecm, וכתוצאה מכך היווצרות צלקת נוקשה אי ספיקת לב4. פיברותקיעות הם קבוצה הטרודוגני של תאים, מה שהופך אותו מאתגר לנתח את הפונקציה שלהם מתמנת מפני מאפיינים מסתגלת pro-פיברוטיק. לאחרונה, הטרוגניות תפקודית של שני תת שונים בפיברוהפיצוץ בעקבות פציעה שריר הלב הוגדרו, המציין את האפשרות של בידוד שונים סוגי הפיצוץ בפיברומות ולימוד תפקידם בפצע ריפוי5.
קבלת האוכלוסייה טהור פיברוהפיצוץ הוא חיוני בתיחום התפקיד הפונקציונלי שלהם בתיקון פיברוזיס. עם זאת, הנוכחות של סמנים מרובים פיברומסט המכירים סוגי תאים אחרים להפוך אותו מאתגר לבודד את האוכלוסייה טהור באופן משמעותי הפיברובלסט6. מספר מחקרים אלגנטיים המציאו דרכים חכמות כדי לבודד פיברוהכדורים מפני שריר הלב נפצע ופצע. השיטה הפופולרית ביותר ומבוססת היטב של העשרת הגידולים היא דרך הדבקה סלקטיבית בעקבות עיכול הרקמה האנזימטית7.
בנוסף, מיון תא מופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS) של פיברותקיעות מבוסס על משטח תאים אנטיגנים שתוארו בהצלחה8. במחקר, בעקבות העיכול האנזימטי, התאים המסנכטיים ממוינים כשושלת שלילית (לין: Ter119-CD45-CD31-) וgp38-חיובי (gp38+)מלבבות העכבר. Gp38+ ve תאים אושרו להיות פיברופיצוצים מבוסס על שיתוף הביטוי שלהם של col1α1 וסמנים mesenchymal אחרים. למרות שרוב העיכול הרקמות מושלם לאחר שהוא מבתר את החדר בצלחת פטרי, מחקר שנערך לאחרונה חקר את השימוש במחט האנזים הישיר של החדר השמאלי כדי לבודד מיוציטים ולא מיאלוציטים אשר כוללים פיברופיצוצים9. במקרה זה בודלו באמצעות הדבקה סלקטיבית.
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד וההעשרה של הפיברותקיעות בשלוש שיטות. הראשונה היא שיטה מבוססת הכוללת הדבקה סלקטיבית של פיברומטיות בעקבות העיכול האנזימטי. השיטה השנייה משמש בעיקר בידוד פציעה המושרה אלפא שרירים המבטא מיופיברופיצוצים. השיטה השלישית כוללת רציפים, דלדול מגנטי של השעיית תאי לב אנזימים מתעכלים של תאי המטפאות ואנדותל. בעקבות דלדול, פיברותקיעות/מיופיברופיצוצים מבודדים מבוסס על נוכחות של אנטיגן MEFSK4 באמצעות חרוזים מגנטיים. לאחרונה, MEFSK4 תוארה כאנטיגן נוכח על השקט כמו גם הפעלת פיברותקיעות, מה שהופך אותו סמן מתאים לזיהוי פיברוהפיצוץ ובידוד. כמובן, לכל השיטות המתוארות כאן יש מגבלות ייחודיות. לכן מומלץ מאוד לבדוק את הטוהר של אוכלוסיית התאים המבודדים באמצעות ניתוח זרימה, כתמים, וכמותי למחצה-PCR בזמן אמת. עם זאת, ניתן להרחיב את המתודולוגיות הללו, וניתן להוסיף סמנים נוספים כדי שלא לכלול אוכלוסיות מזהם אחרות לפני ניצול הפיברוהפיצוץ ואוכלוסיות מיופיברומות לניסויים מכריעים.

<table><tbody><tr><td><ריאגנטים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנטי פטרייתי (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9528</td><td></td></tr><tr><td>בקר סריום אלבומין (BSA)</td><td>Sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ציטראט בופר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תערובת קולגנאז (Liberase Blendzyme 3 TH)</td><td>Roche Applied Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDI מים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מי</td><td></td><td></td><td></td>DI</tr><tr><td>DMEM-F12 עם טכנולוגיות L-גלוטמין ו-HEPES</td><td>Life</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I(20U/mL)</td><td>BioRad</td><td></td> 7326828-Dulbecco's <td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Sas (dPBS) ללא Ca2+ ו-Mg2+</td><td>Gibco</td><td>13190-144</td><td></td></tr><tr><td>חוסם אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FC 70% (מטוהר אנטי עכבר CD16/CD32)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>10% סרום</td><td></td><td></td><td></td>עיזים</tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) עם Ca2+ ו-Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-Ci</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Henseleit אבקת חיץ</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>מיקופלזמה מניעתית (פלסמוצין)</td> <td>Invivogen</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר 15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10x מאגר ליזה של תאי דם אדומים</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>מדיה</td><td></td> <td>הרכבה באיטיות</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF ובטא;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כתם כחול טריפן (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>קולגן</td><td></td><td></td><td></td> חולדה מסוג 1</tr><tr><td><חזק>נוגדנים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7AAD (מלאי: תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל ב-DMSO)</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>דילול A1310</td><td>= 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>CD45-APC</td><td>BD Bioscience</td><td>559864</td><td>דילול = 1:200; RRID = AB_398672</td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>BD Bioscience</td><td>553373</td><td>דילול = 1:200; RRID = AB_394819</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>דילול = 1:250; RRID = AB_394816</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD</td><td>553076</td><td>דילול = 1:250; RRID = AB_394606</td></tr><tr><td>COL 1&alpha; 1</td><td>MD Bioproducts</td><td>203002</td><td>דילול = 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>צבע רפאים סגול 510 (ניסוח: 1 uL/בדיקה ב-DMSO)</td><td>דילול Tonbo Biosciences</td><td>13-0870</td><td>= 1:1000; RRID =</td></tr> <tr><td>עיזים נגד עכבר Alexa Fluor 488</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A11029</td><td>דילול = 1:200; RRID = AB_138404</td></tr><tr><td>עז נגד ארנב-Cy3</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>דילול = 1:200; RRID = AB_2795952</td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנבות-FITC</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td><td>711-165-152</td><td>דילול = 1:200; RRID = AB_2307443</td></tr><tr><td>עיזים נגד חולדות Alexa Fluor 488</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A11006</td><td>דילול = 1:200; RRID = AB_2534074</td></tr><tr><td>עיזים נגד חולדות Alexa Fluor 647</td> דילול <td>Thermo-Fisher</td><td>A21247</td><td>= 1:200; RRID = AB_141778</td></tr><tr><td>פריוסטין</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC67233</td><td>דילול = 1:100; RRID = AB_2166650</td></tr><tr><td>דילול Vimentin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2258</td><td>= 1:200; RRID = AB_261856</td></tr><tr><td>&אלפא;-אקטין שריר חלק (&alpha;SMA)</td><td>דילול סיגמא אולדריץ'</td><td>A2547</td><td>= 1:1000; RRID = AB_476701</td></tr><tr><td>חלבון ספציפי לפיברובלסטים 1 (FSP1)</td><td>Millipore 07-2274</td><td>07-2274</td><td>דילול = 1:100; RRID = AB_10807552</td></tr><tr><td>CD45 חרוזים מגנטיים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>CD31 חרוזים מגנטיים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-087-418</td><td></td></tr><tr><td>תאים נגד הזנה-APC (MEFSK4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-900</td><td>דילול = 1:100; RRID = AB_2660619</td></tr><tr><td>חרוזים נגד APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>עכברוש IgG-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-103-034</td><td>דילול = 1:100; RRID = AB_2661598</td></tr><tr><td>חמור נגד חולדות Alexa Fluor405</td><td>Abcam</td><td>ab175670</td><td>דילול = 1:100</td></tr><tr><td>anti-AN2/NG2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-455</td><td>דילול = 1:11; RRID = AB_2651235</td></tr><tr><td><חזק>חומרים אחרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 ומיקרו; m פילטר</td><td>תרמו מדעי</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחת תרבית תאים</td><td>קורנינג</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל</td><td>פיפט פישרברנד</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>40 ומיקרו; m מסננת תאים</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6 בארות צלחת</td><td>קורנינג</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>צינורות ציטומטריה זרימה</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נדנדה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>להב קצה יחיד</td><td>PAL</td><td>62-0177</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-&alpha;SMA מדווח עכברים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS מפריד שדה</td><td></td><td></td><td></td>מגנטי</tr><tr><td>MACS הפרדת עמודה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיסויי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qaigen Rneasy מיני ערכת</td><td>Qaigen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>אמביון RNAqueous מיקרו בידוד מוחלט ערכת</td><td>אמביון</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>48 בארות צלחת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30G מחט</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 מכונת ציטומטריה זרימת לייזר (BD LSRFortessa)</td> <td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 זרימת לייזר מכונת ציטומטריה (BD FACSAria III)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Data Acquisition Software (BD FACSDiva Software v8.0a)</td>BD <td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

פיברוזיס של הלב בתגובה לפציעה היא תגובה פיזיולוגית לריפוי הפצע. המאמצים נעשו כדי ללמוד ולמקד את סוגי בפיברוהפיצוץ המרכך פיברוזיס. עם זאת, מחקר פיברולפיצוץ כבר הפריע בשל חוסר של סמנים מקובלים בגידולים המקובלים לזהות שקט כמו גם הפעלת פיברופיצוצים. פיברותקיעות הם אוכלוסיית תאים הטרוגניים, מה שמקשה עליהם לבודד ולאפיין. הפרוטוקול המוצג מתאר שלוש שיטות שונות להעשיר את הגידולים השונים והמייופיברוונים מלבבות העכבר הפצועים. באמצעות פרוטוקול רגיל ואמין כדי לבודד הפיברוכדורים יאפשר לימוד תפקידם הומאוסטזיס כמו גם פיברוזיס אפנון.

מערכת זרימה להפגנת בידוד מיופיברופיצוץ באמצעות עכברים αSMA-GFP לבבות שלא נפגעו הראו לא ניתן לגילוי בתאי הαSMA-gfp במודל העכבר העיתונאי; מכאן, הם שימשו להקמת שער לאות הרקע של הערוץ GFP לאחר פיצוי (איור 2). αSMA+ תאים ממוינים בהתבסס על נוכחות של ביטוי gfp מן החדר השמאלי פצועים 10 ימים אחרי MI. אחוז קטן של אנדותל (GFP +/cd31 + תאים; SD = 3.8% ± 0.0164; n = 5) והמטפיאה (GFP +/cd45 + תאים; SD = 3.18% ± 0.0112; n = 5) התאים הביעו גם GFP בליבם הפגוע αSMA-GF...

קבלת אוכלוסייה טהורה של פיברותקיעות חיונית כדי ללמוד את תפקידם בתיקון פצעים פיברוזיס. המתואר כאן היא שיטה מפורטת כדי לבודד את הפיברוכדורים ומיוריסותליות מלבבות העכבר שנפגעו ונפצעו ולאחר מכן אפיון הטוהר והפונקציונליות שלהם על ידי immunofluorescence RTPCR, מיון תאים בסיוע פלואורסצנטית, ו התכווצות ג'ל לקולגן.

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לבודד הן אוכלוסיות פיברובלסט המופעלות על ידי הרה-קיפאון והן אוכלוסיות פיברובלסט המופעלות על ידי פציעות עם טוהר משמעותי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הגמישות שלה לאלתור. לזרימה, כמו גם בידוד מבוסס חרוזים, ניתן לשלב נוגדנים נגד תאים מזהמים כדי להוציא אותם מתאים היעד המבודדים.טכניקה זו משמשת בעיקר לבידוד פיברובלסט לבבי. עם זאת, זה יכול להיות מנוצל כדי לבודד fibroblasts מרקמות אחרות. הפגנה של הליך זה תהיה מילינג מלצר, מתמחה לתואר ראשון, ודיוויד באייר, עוזר מחקר מהמעבדה שלי.כדי להכין צלחת שש בארות לאחסון שישה לבבות במהלך הניתוח, מחלקים שני מיליליטר של KHB קר לתוך כל באר, ומ מניחים את הצלחת על קרח. לרסס את הגוף עם 70% אתנול. כוון אותו כך שהצד הגחון יעמוד מול הניסוי.הצמד את התוספות כדי למנוע הפרעות. מבלי ל פירסינג הכבד, לחתוך לפתוח את עור הבטן ואת השריר. חותכים אנכית לכיוון עצם החזה, בזהירות לפתוח את בית החזה מבלי ל פירסינג הלב.לאחר מכן, להמשיך לחתוך דרך בית החזה כדי לחשוף את הלב. באמצעות מדפים, בעדינות להרים את הלב מהחזה, חיתוך כל ריאה או רקמה עודפת מחובר בצד החיצוני של הלב. הפרד את החדר השמאלי.עבור כל ניתוח, מניחים את החדר באר נפרדת של צלחת שש בארות. ראשית, להשתמש במקלפים כדי לסחוט שוב ושוב להתסיס את החדר ב KHB כדי להסיר דם עודף. מעבירים את החדר לצלחת נקייה, סטרילית, 10 ס"מ מרובע.לאחר מכן, באמצעות להב חד קצוות, במהירות טחון החדר לחתיכות קטנות. מוסיפים מיליליטר אחד של קוקטייל עיכול קולגן, וממשיכים לכרסם. כאשר החלקים קטנים מספיק כדי לעבור עם מיקרופיקט מיליליטר אחד, להעביר אותם צינור חרוט 50 מיליליטר.לשטוף את הצלחת פעמיים עם שני מיליליטר של קוקטייל, ולהעביר את לשטוף לצינור. דגירה הצינור במשך 30 דקות, ושימוש חוזר בתאים כמתואר בכתב היד באמצעות פיפט חמישה מיליליטר. לאחר ההמשך הראשוני, דגירה התאים במשך 15 דקות, ולהשתמש שוב באמצעות פיפטה 10 מיליליטר.לאחר מכן, מניחים מסננת תאים 40 מיקרומטר על גבי צינור חרוט חדש, 50 מיליליטר, וראש מסננת על ידי הרטבת אותו עם אחד עד שני מיליליטר של KHB. הוסיפו 25 מיליליטר של KHB להשעיית העיכול, והוסיפו שימוש חוזר. לסנן את ההשעיה דרך מסננת, החלפת מסננת לפי הצורך.צנטריפוגה לסינון ב 400 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את על-טבעי, ולהשתמש מחדש את גלולה 1x RBC מאגר lysis באמצעות חמישה מיליליטר של חיץ לכל לב. לאחר הדגירה המתלה במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה ההשעיה ב 400 פעמים g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.הסר את supernatant, ולאחר מכן תן שוב את גלולה במיליליטר אחד של KHB. לאחר מכן, להוסיף תשעה מיליליטר של KHB להשעיה. סנן את ההשעיה דרך מסננת תאי 40 מיקרומטר לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר.צנטריפוגה הצינור חרוט ב 400 פעמים g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, להסיר את supernatant, ולתלות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של מדיה fibroblast או PBS. לאחר שנקבע מספר התא, ניתן לבודד פיברובלסטים מההשעיה בשלוש שיטות שונות המתוארות בכתב היד.כדי להתחיל בבידוד על ידי ציפוי דיפרנציאלי, הכינו צלחת של שש בארות על ידי הוספת שני מיליליטר של מדיה פיברובלסט לכל באר. מערבל את הצלחת כדי לכסות את תחתיות באר. אם תאי הלב של העכבר מושעים ב- PBS, צנטריפוגה ו- resuspend אותם במיליליטר אחד של מדיה fibroblast לכל לב.הוסף מיליליטר אחד של השעיית תא, המקבילה של לב אחד, לכל באר. מערבלים את הצלחת כדי להפיץ תאים באופן שווה. הוסף אחד עד שני מיליליטר נוספים של מדיה fibroblast לבא עבור נפח כולל של עד ארבעה מיליליטר לבא.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. מכיוון שהפיברובלסטים ידבקו באופן סלקטיבי בארות, הם יכולים להיות מבודדים על ידי הסרה והשמטה של התקשורת. לשטוף את התאים המצורפים הנותרים עם שני מיליליטר של PBS, ולאחר מכן להוסיף שניים עד ארבעה מיליליטר של מדיה פיברובלסט סטרילי לכל באר.דגירה ב 37 מעלות עד confluent, שינוי התקשורת כל יומיים עד ארבעה ימים. כדי להתחיל את התיוג המגנטי וההפרדה של תאים hematopoietic חיובי CD45, צנטריפוגה השעיה של תאי לב העכבר ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי, ולחץ מחדש על גלולת התא במיליליטר אחד של מאגר שיווי משקל.לספור את התאים באמצעות מד חמוציט. לאחר צנטריפוגה של התאים שוב, תן שימוש חוזר לכדור התא במאגר שיווי משקל. הוסיפו חרוזים מגנטיים חיוביים ל-CD45, וערבבו היטב.דגירה לפחות 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים על ידי הוספת חיץ שיווי משקל צנטריפוגה ב 500 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את העל-טבעי וספיר את התאים באמצעות מד חמוציטים.תן את גלולת החיץ במאגר שיווי משקל. העבר את ההשעיה דרך מסנן של 40 מיקרומטר כדי למנוע מצבור תאים לסתימת עמודת ההפרדה. לאחר מכן, מקם עמודת הפרדה בשדה המגנטי של מפריד מתאים, וצייד את העמודה בשלושה מיליליטר לפחות של PBS.יוצקים את ההשעיה התא דרך העמוד, ולאסוף את זרימה דרך, אשר יכיל את התאים unlabeled, בצינור חרוט 15 מיליליטר. לשטוף את העמוד שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של חיץ שיווי משקל, ולשלב את לשטוף עם זרימה דרך. הסר את העמודה מהמפריד והצב את העמודה על צינור חרוט של 15 מיליליטר.כדי להפוך את התאים החיוביים ל- CD45 המסומנים בתווית CD45, צנרת חמישה מיליליטר של מאגר שיווי משקל לתוך העמודה וצניחת העמודה בחוזקה. צנטריפוגה הצינור של eluent ואת הצינור של זרימה דרך ב 500 פעמים g. לספור את התאים באמצעות מד חמוציט.כדי להשלים את הבידוד, בצע את הפרוטוקולים בכתב היד עבור תאי ה אנדותל חיוביים CD31 ו FIbroblasts חיובי MEFSK4, הדומים לפרוטוקול עבור תאים חיוביים CD45. מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות בוצע בתאים בודדים המבודדים מלבבות עכבר אלפא-SMA-GFP בעקבות אוטם שריר הלב. ערכת גתים מייצגת מדגימה תאים חיוביים ל- GFP המבטאים במשותף CD31, CD45 או AN2.בלבבות העכבר הפצועים, אחוז קטן של תאי אנדותל ותאים hematopoietic לידי ביטוי GFP. עם זאת, תאים שליליים/שליליים/CD45-GFP לא בטאו AN2, סמן פריציטי. תאים חיוביים GFP ביטא אלפא-SMA, קולגן אחד אלפא אחד, פריוסטין, ו vimentin.פיברובלסטים לא פצועים מבודדים על ידי הידבקות סלקטיבית הביעו וימנטין אך לא הפגינו ביטוי של אלפא-SMA, פריוסטין או קולגן אחד אלפא אחד. הן פיברובלסטים לא פצועים והן פיברובלסטים מופעלים הביעו את האנטיגן MEFSK4. שני פיברובלסטים לא מוצדקים, מבודדים על ידי הידבקות סלקטיבית, ומיופיברובלסטים, מבודדים וממוינים מעכברי אלפא-SMA-GFP, הפגינו יכולת להידבק בקולגן.חשוב לטחון את הרקמה ביסודיות לפני הדגירה. לפני הפרדה מבוססת חרוזים, חשוב להעביר את ההשעיה דרך מסנן 40 מיקרומטר כדי למנוע צבירות תאים. התאים המטוהרים בשיטה זו יכולים להיות מטוהרים עוד יותר באמצעות חרוזים מגנטיים הקשורים לנוגדנים ספציפיים לפוריסט כדי להבטיח רמה גבוהה של טוהר.עם הזמינות של נוגדנים חדשים חרוזים תרכובת, כמו גם עכברים מהומשים כתב, אפשר להשתמש בטכניקות אלה כדי לבודד וללמוד אוכלוסיות תאיות נפרדות, לא רק fibroblasts.

isolation-characterization-adult-cardiac-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Myocytes לב למבוגרים הם תאים ראשוניים, כי יכול להיות מבודד לבבות בעלי חיים מתורבתים במשך כמה ימים. במהלך תקופה זו תרבות העברת גנים adenoviral ניתן להשתמש בהם כדי להביע biosensors מקודדים גנטית (GEBs) או חלבונים היתוך ניאון. שתי הגישות לאפשר חקירות הסלולר באמצעות מיקרוסקופיה confocal.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

סוגי התאים הדבקים העיקריים שמקורם בשריר אנושי הם תאים מיוגניים ופיברובלסטים. כאן, אוכלוסיות התאים מועשרות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי המבוסס על אנטיגן CD56. תיוג חיסוני לאחר מכן עם נוגדנים ספציפיים ושימוש בטכניקות ניתוח תמונה מאפשר כימות של מאפיינים ציטופלזמיים וגרעיניים בתאים בודדים.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תרביות ראשוניות של תאי סטרומה בוושט עכבריים ואנושיים עם פנוטיפ מיופיברובלסטים. לתאים מתורבתים יש מורפולוגיה בצורת ציר, מבטאים α-SMA ווימנטין, וחסרים סמני פני תא אפיתל, המטופויאטי ואנדותל. ניתן להשתמש בתאי סטרומה מאופיינים במחקרים פונקציונליים של אינטראקציות אפיתל-סטרומליות.

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

התנהגות פיברובלסטים עומדת בבסיס ספקטרום של ישויות קליניות, אך הן נשארות מאופיינות בצורה גרועה, בעיקר בשל ההטרוגניות הטבועה בהן. מחקר פיברובלסטים מסורתי מסתמך על מניפולציה במבחנה, המסווה התנהגות פיברובלסטים in vivo. אנו מתארים פרוטוקול מבוסס FACS לבידוד פיברובלסטים של עור עכבר שאינו דורש תרבית תאים.

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

כמה פרוטוקולים פותחו ותיארו לבידוד של סוגי תאים לב שונים של הלב חולדה. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של איכות גבוהה תאים מרכזיים של תאים לב (cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת, הפחתת עלויות הניסוי.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

כאן, אנו מציגים עבור בידוד של טיפוח של עכברים בוגרים חדרית cardiomyocytes (ARVC) פרוטוקול. ניתן להשתמש ARVC מבודד לטיפוח לטווח הקצר ולטווח הארוך. בידוד של טיפוח של ARVC יכול לשחק תפקיד מפתח בפיתוח משטרי הטיפול החדש למחלות לב.

בידוד, טיפוח של עכברים בוגרים Cardiomyocytes

כאן, אנו מתארים הליך ממוטבת, המבוססים על Langendorff על בידודו של תא בודד cardiomyocytes פרפור ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר. תקנה ידנית בלחץ intraluminal של חללים לב מיושם להניב המתאימים עירור-התכווצות-מצמד לימודי תקין מבחינה פונקציונלית נייטרלים.

בידוד של פרפור Cardiomyocytes ממודל עכברוש מטבוליות הקשורות תסמונת באי ספיקת לב עם שבריר פליטה משומר

אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את הפיברוטים הראשוניים העיקריים באופן קל, מהיר ואמין, performable על ידי למתחילים (למשל, סטודנטים). הליך זה משלב את העיכול ברקמה אנזימטית ועצבנות מכנית עם גלי אולטרה סאונד כדי להשיג פיברוהטיות ראשונית. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לדרישות נסיוניות ספציפיות (לדוגמה, רקמת אדם).

אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

שיטה מעודנת של ניקוי רקמות פותחה והוחלה על לב העכבר הבוגר. שיטה זו נועדה לנקות רקמת לב צפופה ו autofluorescent, תוך שמירה על פלואורסצנטיות פיברובלסט שכותרתו המיוחסת לאסטרטגיה כתב גנטי.

ניקוי רקמות מבוסס בהירות מעודן עבור ארגון פיברובלסט תלת מימדי בלבבות עכבר בריאים ופצועים

למדו לבודד פיברובלסטים ומיופיברובלסטים מלבות עכברים פגועים ובריאים באמצעות מיון תאים פלואורסצנטי ומבחני RT-PCR. שיטה זו מאפשרת אפיון אוכלוסיות תאים טהורות לחקר תיקון פצעים ופיברוזיס לבבי.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

גלה סרטונים נוספים