Name: חיתוך ולבבות חזיר מקולף בתנאים פיסיולוגיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: למדו לחתוך ולגדול שכבות רקמת לב חזיר בתנאים פיזיולוגיים למשך שישה ימים. שיטה זו מאפשרת בדיקת יעילות טיפולי אי-ספיקת לב והערכת רעילות לבית חריפה במודל חזוי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TMAM נתמך על ידי NIH מענק P30GM127607 ואיגוד הלב האמריקאי המענק 16SDG29950012. RB נתמכת על ידי P01HL78825 ו-UM1HL113530.

כל נוהלי החיות היו בהתאם להנחיות המוסדיים של אוניברסיטת לואיוויל ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש.
1. הכנה לפריסה (יום אחד לפני החיתוך)
<ol><li>הכנת מיקרוטומה הרוטטת
	<ol>
<li>הניחו את הלהב הקרמי לתוך המחזיק בו באמצעות הצעדים הבאים: לאחר הסרת הלהב בזהירות, הצב את הקצה החד תחילה בחריץ של כלי הלהב. אז, להתאים את הלהב לתוך המחזיק על ידי התרופפות שני ברגים על זרועותיו של המחזיק ולהחליק את הלהב תחת כל מכונת כביסה ולדחוף אותו בחוזקה על העצירות האחוריות. הדק את הברגים כדי לאבטח את הלהב. הערה: אין לחזק יותר מדי את הברגים.</li>
		<li>כיול הלהב באמצעות פרוטוקול הכיול והכלים בהתאם לפרוטוקול היצרן. הערה: בקצרה, כדי להקל על יישור הלהב באמצעות ציר הנסיעות וכלה בהפחתת החידוד של הציר Z, המיקרוטומה הרוטטת משתמשת בהתקן כיול מתקפל. כאשר התקן הכיול מחובר לתוך המכשיר שנוכחותו תזוהה באופן אוטומטי, והמיקרוטומה הרוטטת תיקח שליטה בהתאמת משרעת והגדרות התדר של הלהב לסדר גודל המאפשר התאמה מיטבית של שגיאת יישור הלהב.<ol>
<li>לחץ על לחצן פרוסה כדי להתחיל את תהליך היישור שיגרום להזזת הלהב באופן אוטומטי כך שהקצה החדשני יהיה במצב אופטימלי יחסית להתקן הכיול להערכת היישור המיטבית. בצע את ההוראות שעל המסך כדי לבצע התאמות ללהב באמצעות המברג שסופק כדי להבטיח שיישור Z יהיה בטווח של 1 μm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הטבו את האמבט הפנימי ואת כל חלקי המתכת של המיקרוטומה הרוטטת.</li>
	</ol></li>
	<li>אוטוקלב מגשי מתכת גדולים (עבור איסוף הפרוסות לספוג את הצלחת גירוי חשמלי מכסה), כל מיכלי זכוכית, להבי מלבן רגיל, מלקחיים, מספריים, מדפסת תזמון חגורה (לחתוך אותם לתוך 6 חלקים רחבים), שיבות מתכת 5 L של מים מזוקקים כפולים (ddH2O).</li>
	<li>לחטא צנצנת 1 L, 1 500 mL ומגש פלסטיק אחד ללב באתרו ובפרזיה מבחנה עם הפתרון הקרדיופיחה.</li>
	<li>הכינו 2 ליטר של התמיסה. "
	<ol>
<li>עבור 1 L של הפתרון של הפרוסות, מערבבים 3 g/L 2, 3-butanedione מונוקסימי (BDM), 140 מ"מ הנאל (8.18 g), 6 מ"מ KCl (0.447 g), 10 מ"מ D-גלוקוז (1.86 g), 10 מ"מ HEPES (2.38 g), 1 מ"מ MgCl2 (1 mL של 1 m פתרון), 1.8 Mm cacl2 (1.8 ml של 1 m פתרון), עד 1 L של ddh2O. להתאים את ה-PH ל7.40 באמצעות naoh. לאחר מכן, סנן את הפתרון באמצעות 1,000 mL, 0.22 μm, מערכת לסנן ואקום/אחסון ולאחסן ב 4 ° c בלילה.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו 4 ליטר של התמיסה הקרדיוליסטית.
	<ol>
<li>עבור 1 L של הפתרון cardioplegic, לערבב 110 מ"מ הנאל (6.43 g), 1.2 mM CaCl2 (1.2 mL של 1 M פתרון), 16 מ"מ kcl (1.19 g), 16 מ"מ mgcl2 (3.25 g), 10 מ"מ נחקו3 (0.84 g), 1 U/mL הפארין, עד 1 L של Ddh2O. כוונן את ה-pH ל7.40 באמצעות naoh. לאחר מכן, סנן את הפתרון באמצעות 1,000 mL, 0.22 μm, מערכת לסנן ואקום/אחסון ולאחסן ב 4 ° c בלילה. הערה: הוסיפו 1,000 U/L הפארין בפתרון קרדיו, היום של החיתוך (ראה שלב 2.1).</li>
	</ol></li>
	<li>טרי להכין 500 mL של התרבות הבינונית בבקבוק המקורי בקבינט אבטחה טיחות: לערבב בינוני 199, 1x אינסולין-העברת-סלניום (שלה) תוספת, 10% סרום העובר העוברי (fbs), 5 ng/ml כלי הצמיחה אנדותל (מעבד), 10 ng/ml fbs-basic, 2x אנטיביוטי-antimycotic מסנן לעקר דרך מערכת 0.22 μm, מסנן ואקום/אחסון ולאחסן ב 4 ° c בלילה. הערה: אין לכוונן את ה-pH, להוסיף לפני השימוש ב-, ולאחר FGF.</li>
	<li>הכינו 4% לוחיות ג'ל באגר.
	<ol>
<li>הוסף 200 mL של העיקור ddH2O ב 500 מ"ל בקבוקון מעוקר. שוקלים 8 גר' של התעורר, ובעדינות לשפוך לתוך הבקבוקון. מרתיחים עבור 2 דקות במיקרוגל, ואז קריר עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>יוצקים 25 מ ל בכל צלחת פטרי 100 מ"מ בקבינט אבטחה טיחות (להכין 6 מנות) ולחכות 1 h כדי לגבש. לאחר מכן, לאטום את הצלחות עם סרט פרפין, לעטוף בניילון נקי, ולאחסן ב 4 ° c.</li>
	</ol></li>
	<li>להכין 4 L של 70% אתנול על ידי דילול האתנול 200-הוכחה מוחלטת באופן אוטומטי ddH2O.</li>
	<li>להכין 2x אנטיביוטי-antimycotic ב העיקור ddh2o: מערבבים 980 mL של העיקור ddh2o עם 20 מ ל של אנטיביוטי-antimycotic תחת הקבינט אבטחה טיחות.</li>
</ol>2. לב חזיר Perfusion
<ol><li>הוסף 1 מ ל של הפארין 1,000 U/mL לכל 1 L של הפתרון הקרדיופיחה. . שמור על הפתרון בקרח הערה: לפחות 3 יש צורך בפרזיה ושימור הלב במהלך ההעברה לחדר התרבות של הרקמה.</li>
	<li>לקחת את הפריטים הבאים לחדר ניתוח חזיר: אחד קרח גדול דלי מלא קרח, מתכת אחת המגש מעוקר (לשמור על דלי קרח עבור perfusion לב), אחד מעוקר 500 mL צנצנת, אחד לצנצנת 1 L (כדי להעביר את הלב בחזרה הפתרון לחדר תרבות הרקמה , על הקרח), ומגש פלסטיק אחד מעוקר מלא קרח (כדי לשמור על הפתרון הקרדיואופאלי על הקרח).</li>
	<li>להכין מערכת ההיתוך לב באתרו המכיל הקפאה 3-כיוון, מזרק 60 mL, 18 G פרפר המחט הצינור, ואת צינורות הרחבה למאגר הפתרון cardioplegic.</li>
	<li>שאיפה חזיר הזכר יורקשייר (2-3-חודש בן, 20 על 25 ק ג) הראשון עם הזרקת השרירים של קטמין (20 מ"ג/ק"ג)/xylazine (2 מ"ג/ק"ג) קוקטייל. לאשר הרדמה נכונה על ידי אובדן של מתח הלסת. ואז, להעביר את החזיר לחדר הניתוח, צנרור ולאוורר מכנית את הריאות כפי שתוארה בעבר14.</li>
	<li>שמירה על הרדמה עם (1.5-2%) איזופלוריין.</li>
	<li>הנח את החיה בתנוחה הצדדית הימנית וגלח את הפרווה מאזור החזה. נקה את העור עם לשפשף אלכוהול, ואז לחטא את האתר כירורגי עם 10% (w/v) povidone-פתרון יוד.</li>
	<li>פתח את החזה על ידי חתך האונה השמאלי השמאלית באמצעותth אזמל בחלל האינטרקוסטל 4, ולהשתמש במפסק החזה בין הצלעות כדי להחזיק את החזה פתוח לחשוף את הלב. הערה: השתמש בכל המכשירים הציריליים עבור הליך זה.</li>
	<li>הכנס את קטטר המחט פרפר לתוך האטריום השמאלי ולתקן את המחט עם סגירת מחרוזת הארנק. לאחר הזרקה ורידי של מינון מנת הפבית (100 U/kg), להתחיל לעשות את הלב באתרו עם 500 mL של פתרון קרדיו, קר הקרח הקרה (כדי להאט את קצב הלב) דרך צנתר שמאל פרפור.</li>
	<li>מורדם בצורה עמוקה את. החזיר עם 5% מלוריאן בזריזות את הלב מהחזה. עם מספריים כירורגיים בעזרת צינורית של אבי העורקים והפעלת הלב במבחנה עם עוד 1 L של התמיסה הקרה קרדיופיחה (100 mL/min) כדי לרוקן את הדם של vascuלטורה.</li>
	<li>לאחר הפרזיה לב, יש לשמור את הלב בצנצנת 1 L מלאה בתמיסת כבישה קרה ולשמור על קרח במהלך ההעברה לחדר התרבות של הרקמה.</li>
</ol>3. חותך רקמת לב חזיר
<ol><li>להגדיר את האמבטיה רקמה על הרטט, להוסיף קרח למעיל הקירור באמבט רקמות, ואז להוסיף את הפתרון של Tyrode לתוך האמבטיה רקמה. הגדרת כד פלסטיק 1 L כדי לאסוף את הסילוק של קרח נמס מן המעיל לקירור רקמת הרקמה.</li>
	<li>מתחת לארון הבטיחות, העבירו את לב החזיר למגש המכיל 1 ל' של התמיסה הקרה.</li>
	<li>מנתחים את הלב כדי לבודד את החדר השמאלי באמצעות מנתחים סטרילי לשליפה. ואז, לחתוך את החדר השמאלי לתוך בלוקים של 1-2 ס מ3 כל אחד באמצעות להבים מלבן תער. השתמש בחתיכה אחת לחיתוך ולשמור את החלקים הנותרים בצינור 50 mL בתמיסה הקרה של טירכב על קרח לחיתוך מאוחר יותר, במידת הצורך. הערה: עסה את הרקמה לפני החיתוך בידיים, במיוחד אם זהו הבלוק השני. עיסוי מסייע לשחזר את התצורה הנכונה של סיבי השריר ומונע כל נוקשות בתוך בלוק הלב.</li>
	<li>הוסף 1-2 טיפות של דבק רקמות (טבלה של חומרים) על מחזיק דגימת מתכת ולתקוע פיסת 4% אגר בלוק עם שטח של כ 1 ס מ2.</li>
	<li>הוסיפו 1-2 טיפות. של דבק רקמות באגר</li>
	<li>לתקוע את בלוק הלב לאגר עם צד הלב האפילידיום הפונה למטה על דבק רקמות ולוודא שהוא שטוח ככל האפשר. ואז, להעביר את מחזיק הרקמה עם בלוק הלב למיקומה באמבט הפרוסות של הרטט.</li>
	<li>הצמד את צינור החמצן לאמבט הפרוסות ולמגש המתכת המלא בתמיסה של טירודה לאיסוף הפרוסות (אמבט טירודה מחמצן). לאחר מכן, להוסיף 40 יקרומטר תא מכשירי במגש מתכת כדי לאסוף את הפרוסות לאחר חיתוך.</li>
	<li>התאמת מיקום הפרוסות
	<ol>
<li>באמצעות תוכנת ההפעלה והרטט של לוח המחוונים, התאם את גובה הלהב/דגימה. בחר את לחצן הגובה ובצע את ההוראות שעל המסך כדי לכוונן את הגובה. באופן אידיאלי, יש את הלהב קרוב לראש הרקמה אבל מתחת לשרירי הלסת ולוודא שיש נוזל המכסה את הרקמה ואת הלהב לפני החיתוך.</li>
		<li>התאם היכן להתחיל לחתוך את הרקמה על-ידי בחירת הלחצן מראש . לחץ על כפתור פרוסה ולהגדיל את המהירות באמצעות הכפתור כדי להזיז את הלהב לכיוון קצה הרקמה. לאחר מכן, הקש על פרוסה שוב כדי להפסיק ולחץ על הלחצן מראש כדי לבטל את התהליך.</li>
		<li>להתאים את הפרמטרים גזירה: מהירות מראש = 0.03 מ"מ/s, תדר רטט = 80 Hz, ו משרעת הרטט אופקי = 2 מ"מ. לאחר מכן, התחל בחיתוך על-ידי בחירה בלחצן פרוסה .</li>
		<li>תן את הרטט הפרוסות עד שהוא מגיע לסוף הרקמה, אך לפני שהוא פוגע בקצה האחורי של מחזיק הדגימה. בשלב זה, הקש שוב על חתוך כדי להפסיק. להכות את כפתור ההחזרה כדי לחזור למיקום ההתחלה.</li>
		<li>בחרו ' חזרה אוטומטית ' (לחיצה פעמיים) שתאפשר למיקרוטומה הרוטטת לחזור באופן אוטומטי על תהליך הפריסה עד 99 פעמים.</li>
	</ol></li>
	<li>איסוף פרוסות
	<ol>
<li>המתן עד שפרוסות הן באורך מלא ונראות טוב (לאחר שעברו את שכבות השריר הפטובות), ולאחר מכן התחילו לאסוף את הפרוסות.</li>
		<li>לאסוף את הפרוסות באמצעות פיפטה פלסטיק פסטר ממולא הפתרון של Tyrode הקרים כדי לתפוס בעדינות את הרקמה מהאמבטיה. במקרה הצורך, השתמש מלקחיים ומספריים האביב כדי לנתק את הפרוסה מבלוק הלב אם הרקמה עדיין מחוברת.</li>
		<li>להעביר את הפרוסה לתוך מסננת תא אחד באמבטיה של Tyrode מחמצן (ראה שלב 3.7) ולהשתמש בנוזל הצינורות הפלסטיק פסטר כדי לקבל את הרקמה לשכב שטוח על אחד מהניידים התא, ולאחר מכן להוסיף מנקה מתכת על גבי להחזיק את הרקמה למטה. הערה: הפרוסות צריך להיות מודלפחות עבור 1 h בפתרון של Tyrode לפני העיבוד (זה עבור BDM כדי להרגיע את הרקמה).</li>
	</ol></li>
</ol>4. שבבי פרוסות לב
<ol><li>
הכנת הפרוסות לתרבות
	<ol>
<li>חתוך את הפרוסה מהקצוות כדי למנוע קצוות לא אחידים. אז, להדביק אותו משני הקצוות של פוליאוריטן מעוקר 6 מ"מ מדפסת רחב חגורה תזמון עם חוטי מתכת מוטבע באמצעות דבק רקמת.</li>
		<li>העבר את פרוסות הלב הנתמכות ל-6 לוחות היטב המכילים 6 מ ל של התרבות הבינונית בכל באר.</li>
		<li>מניחים את מכסה לוחית הגירוי (טבלת חומרים) בחלק העליון של 6 הצלחות היטב ומחברים את המכסה לגירוי חשמלי של תרבות התא (טבלת חומרים). כוונן את הגירוי לחשמל כדי לגרות את פרוסות הלב ב-10 V, 1.2 Hz ברציפות כל הזמן. הערה: לאחר חיבור הגירוי, פרוסות הלב יתחילו לפעום, ותנועה זו תהיה ברורה מבחינה חזותית.</li>
		<li>העבירו את הלוחות לאינקובטור ושמרו על 37 ° c עם מחולל לחות ו-5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שינוי תרבות בינונית 3 x ליום ולהוסיף 6 מ ל של התרבות בינונית לכל טוב במהלך כל שינוי המדיה. הערה: בינונית תרבותית במשך 5 דקות לפני כל שינוי במדיה. יש לשנות בינונית לפחות 1x ליום; זה בסדר בסופי שבוע אם צריך. יומיים של רק שינוי אחד במדיה ביום הוא המקסימום שנבדק.</li>
	<li>
שנה את כיסוי לוחית הגירוי מדי יום כדי למנוע שחרור חלקיקי גרפיט רעילים במדיום התרבותי (בדרך כלל במהלך שינוי המדיה באמצע היום).
	<ol>
<li>הסר את מכסה לוחית הגירוי מתוך צלחת התרבות והכנס את תקע הקצף הלבן שבו המכסה מתחבר לכבל של הגירוי החשמלי של תרבות התא, כדי למנוע נזק למים למעגל החשמלי.</li>
		<li>מניחים את כיסוי הצלחת באמבטיה של מים אוטומטיים עם 2x אנטיביוטי-antimycotic. שמור אותו באמבטיה זו (כלומר, אמבטיה שטיפה) בלילה.</li>
		<li>למחרת, הזיזו את כיסוי הצלחת לאמבט אתנול של 70% עבור 5-15 דקות עד טהרים. הרעד הנוזלי הרבה יותר מהמכשיר לפני החלפת האמבטיות.</li>
		<li>ואז, להעביר את כיסוי הצלחת לאמבטיה השלישי והאחרון (כלומר, לנקות אמבטיה), אשר מורכב מים אוטוקלבים ו-2x אנטיבקטריאלי-antimycotic, כדי לשטוף את כל עקבות אתנול שנותרו.</li>
		<li>לאחר שטיפה את כיסוי הצלחת באמבטיה נקייה, להשתמש נקי מוך לנגב (מרוסס עם אתנול) כדי לייבש את כל המים השאריות על חלקי פלסטיק, לאחר מכן להסיר את פיסת קצף לבן מקום בזהירות לכסות את הצלחת בחזרה על צלחת התרבות. הערה: אין לגעת באלקטרודות גרפיט שחורים שנכנסים לתוך הבאר, כמו המכשיר לא יהיה יותר סטרילי.</li>
		<li>באמצעות מלקחיים סטרילי, לוודא את הרקמה היא במרכז הבאר כך כיסוי הצלחת לא לגעת ברקמה. ודא כי הצד המעוקל של כיסוי הצלחת מתאים עם הצד הזוויתי של הצלחת וכי פינות מרובעות קו למעלה. הערה: כדי למזער את הזיהום של מכסה לוחית גירוי, לשמור אותם נקי וריק לוחית 6 לאחר סיום הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בצע ביצוע של שיטת MTT, מדידות סידן והערכות הפונקציה על פרוסות לב חזיר טרי (יום 0), ואחרי 6 ימים בתרבות לפי Ou et al.13.</li>
</ol>

<ol><li>Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-marketing+withdrawal+of+462+medicinal+products+because+of+adverse+drug+reactions%3A+a+systematic+review+of+the+world+literature%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature.</a> BMC Medicine. 14, 10(2016).</li>
<li>Fermini, B., Fossa, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+drug-induced+QT+interval+prolongation+on+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).</li>
<li>Moslehi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+Toxic+Effects+of+Targeted+Cancer+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).</li>
<li>Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+maturation+phases+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).</li>
<li>Ronaldson-Bouchard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+of+human+cardiac+tissue+grown+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells.</a> Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+fibroblast+differentiated+states+underlie+scar+formation+in+the+infarcted+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart.</a> Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).</li>
<li>Kretzschmar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+proliferative+cells+and+their+progeny+in+damaged+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).</li>
<li>Perbellini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+cardiac+fibroblasts+using+myocardial+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices.</a> Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li>
<li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices%3A+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798(2016).</li>
<li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li>
<li>Jones, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NHLBI-sponsored+Consortium+for+preclinicAl+assESsment+of+cARdioprotective+therapies+%28CAESAR%29%3A+a+new+paradigm+for+rigorous%2C+accurate%2C+and+reproducible+evaluation+of+putative+infarct-sparing+interventions+in+mice%2C+rabbits%2C+and+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs.</a> Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).</li>
<li>Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+pig+heart%3A+comparisons+with+normal+human+cardiac+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure.</a> Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).</li>
<li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 117(2019).</li>
<li>Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+the+effects+of+fetal+bovine+serum+versus+horse+serum+on+growth+and+differentiation+of+primary+equine+bronchial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts.</a> BMC Veterinary Research. 10, 119(2014).</li>
<li>Vuorenpaa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+vitro+cardiovascular+constructs+composed+of+vascular-like+networks+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).</li>
<li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 2168(2019).</li>
</ol>

לגברת ההון העצמי בטאיה Therapeutics. המחברים האחרים מדווחים שאין התנגשויות.

כאן אנו מתארים את פרוטוקול וידאו מפורט עבור השיטה שפורסמה לאחרונה עבור תפוקה בינונית פשוטה (תהליכים עד 48 פרוסות/התקן) שיטה המאפשרת תרבות של פרוסות לב חזיר לתקופה ארוכה מספיק כדי לבדוק את הקרדיולקסיניטי החריפה13. התנאים המוצעים מחקים את הסביבה של הלב, כולל תדירות של גירוי חשמלי, זמינות תזונתי וחמצון לסירוגין. אנו מייחסים את הכדאיות הממושכת של פרוסות הלב בתרבות הביותית שלנו ומעוררת את ההתמקדות שלנו בשחזור התנאים הפיזיולוגיים שחוו הלב השלם. קונספט זה נתמך על ידי הנתונים שלנו מראה כי גירוי חשמלי בלבד...

שיטת התרופות הנגרמת היא גורם מרכזי לגמילה משוק1. בעשור האחרון של המאהה -20, שמונה תרופות ללא לב וכלי דם הונסוגו מן השוק כתוצאה מכך מוות פתאומי בשל הפרעות קצב הלב2. בנוסף, מספר טיפולים נגד סרטן (בעוד במקרים רבים יעיל) יכול להוביל לכמה אפקטים cardiotoxic כולל שריר הלב הפרעות קצב. לדוגמה, הן מסורתיות (למשל, פחם וקרינה) ו ממוקד (g., trastuzumab) טיפולים סרטן השד יכול לגרום לסיבוכים לב וכלי דם בקבוצת משנה של חולים3. שיתוף פעולה קרוב בין קרדיולוגים ו אונקולוגים (באמצעות השדה המתעוררים של "סיבולת לב ריאה") עזר להפוך את הסיבוכים האלה לניהול להבטיח כי חולים יכולים להיות מטופלים ביעילות2. פחות ברור הם השפעות לב וכלי דם של סוכנים חדשים, כולל Her2 ו PI3K מעכבי, במיוחד כאשר הטיפולים משמשים בשילוב. לכן, יש צורך הולך וגדל אסטרטגיות ההקרנה הקדם קלינית עבור רעלים קרדיווסטיים הקשורים המתעוררים נגד סרטן טיפולים לפני ניסויים קליניים אנושיים. חוסר הזמינות של מערכות התרבות לרקמת הלב האנושית כי הוא פונקציונלי מבחינה מבנית עבור יותר מ -24 h הוא גורם מגביל עבור בדיקות הקרדיולוקסיטי אמין. לכן, יש צורך דחוף לפתח מערכת אמינה עבור רקמת לב האדם culturing בתנאים פיזיולוגיים לבדיקת רעילות לסמים.
המהלך האחרון לקראת השימוש של האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע-הקרדיוציטים (היפנוטית-CMs) בבדיקות קרדיולוקסיטי סיפקה פתרון חלקי לטיפול בבעיה זו; עם זאת, הטבע בוגר של היפנוsc-CMs ואובדן שלמות רקמות בהשוואה לטבע רב-תאי של רקמת הלב הם מגבלות גדולות של טכנולוגיה זו4. מחקר שנערך לאחרונה התגבר באופן חלקי על מגבלה זו באמצעות הייצור של רקמות לב מ-היפרsc-CMs על הידרוג ' לים והוא החזיק אותם לעלייה הדרגתית גירוי חשמלי לאורך זמן5. עם זאת, התכונות האלקטרו-מכאני שלהם לא השיגו את הבגרות הנתפסת בשריר הלב האנושי המבוגר. יתר על כן, רקמת הלב הוא מורכב יותר מבחינה מבנית, להיות מורכב מסוגי תאים שונים כולל תאים אנדותל, נוירונים וסוגים שונים של מסטרומה פיברותקיעות מקושרים יחד עם תערובת ספציפית מאוד של חלבונים מטריתאיים מטריצות6. הטרוגניות הזאת של אוכלוסיית התאים הבלתי-קרדיוציט7,8,9 בליבו של היונקים הגדולים הוא מכשול משמעותי ברקמת לב מידול באמצעות סוגי תאים נפרדים. מגבלות גדולות אלה מדגישות את החשיבות של פיתוח שיטות להפיכת התרבות של רקמת לב שלמה למחקרים אופטימליים הכרוכים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים של הלב5.
מודל מבטיח של שריר הלב. האנושי ללא פגע טכנולוגיה זו מספקת גישה למערכת מלאה 3D הרב-תאיים הדומה לרקמת הלב האנושי אשר יכול באופן מהימן לשקף את התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים של שריר הלב האנושי. עם זאת, השימוש שלו כבר מוגבל באופן חמור על ידי התקופה הקצרה של הכדאיות בתרבות, אשר לא להאריך מעבר 24 h באמצעות הפרוטוקולים החזקים ביותר שדווחו עד 201810,11,12. מגבלה זו הייתה בשל גורמים מרובים, לרבות השימוש בממשק נוזלי האוויר לתרבות הפרוסות, והשימוש במדיום תרבותי פשוט שאינו תומך בדרישות האנרגטיות הגבוהות של רקמת הלב. פיתחנו לאחרונה מערכת תרבות מתחת לגוף, אשר מסוגלת לספק גירוי חשמלי רציף ואופטימיזציה של רכיבי מדיה התרבות כדי לשמור פרוסות רקמות לב קיימא עד 6 ימים13. זו מערכת התרבות יש את הפוטנציאל להיות האדם ניבוי חזק במודל באתרו עבור בדיקות קרדיולקסיטיות חריפה כדי לסגור את הפער בין תוצאות בדיקה קלינית קליני. במאמר הנוכחי, אנו מפרט את הפרוטוקול לחיתוך ולתפירה של פרוסות הלב באמצעות לב חזיר כדוגמה. אותו תהליך מוחל על לבבות אנושיים, כלבים, כבשים או חתולים. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מקווים להפיץ את הטכנולוגיה למעבדות אחרות בקהילה המדעית.

<table><tbody><tr><td>1,000 מ"ל, 0.22 ומיקרו; m, מערכות מסנן/אחסון ואקום</td><td>VWR</td><td>28199-812</td><td></td></tr><tr><td>2,3-בוטנדיון מונוקסימה (BDM)</td> <td>פישר</td><td>AC150375000</td><td></td></tr><tr><td>500 מ"ל, 0.22 ומיקרו; m, מערכות מסנן/אחסון ואקום</td><td>VWR</td><td>28199-788</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי צלחת C 6 בארות (כיסוי צלחת גירוי חשמלי)</td> <td>Ion Optix</td><td>CLD6WFC</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>פישר</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>ביוליין ארה"ב</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>תרמו אנטיביוטי-אנטי-פטרייתי</td><td></td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>C-Pace EM ( </td><td>Ion-Optix</td><td>CEP100</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>להבי קרמיקה לרטט Microtome</td><td>Campden Instruments</td><td>7550-1-C</td><td></td></tr><tr><td>Cooley Chest Retractor</td><td>Millennium Surgical</td><td>63-G5623</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>פישר</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>אזמל חד פעמי #20</td><td>Biologyproducts.com</td><td>DS20X</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאי פלקון, סטרילי, קורנינג</td><td>VWR</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו</td><td>A3160502</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים Graefe</td><td>Fisher</td><td>NC9475675</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl BLUE דבק רקמות</td><td>Amazon</td><td></td><td><a href="https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/" target="_blank">https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/</a></td></tr><tr><td>Iris מספריים קפיצים</td><td>פישר</td><td>NC9019530</td><td></td></tr><tr><td>איריס מספריים</td> <td>ישריםFisher</td><td>731210</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>ITS תוסף מדיה נוזלית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146-5ML</td><td></td></tr><tr><td>קטמין HCl (500 מ"ג/10 מ"ל)</td> <td>West-Ward</td><td>NDC 0143-9508</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl2)</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Mayo מספריים כירורגיים</td> <td>SuperCutAROSurgical Instruments Corporation</td><td>AROSuperCut&trade; 07.164.17</td><td></td></tr><tr><td>בינוני 199, מלחי ארל</td><td>תרמו</td><td>11-150-059</td><td></td></tr><tr><td>ווסת חמצן</td> מיכלי חמצן <td>Praxair</td><td></td><td></td></tr> -פיפטות <tr><td>פסטר מפלסטיק</td><td></td> של Praxair <td></td> פישר 13-711-48 <td></td></tr><tr><td></td><td></td> אשלגן כלורי (KCl) פישר <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AC193780010 רצועת תזמון מדפסת</td><td>Amazon</td><td></td><td><a href="https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/" target="_blank">https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/</a></td></tr><tr><td>להבי מלבן גילוח</td><td>פישר</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי FGF בסיסי</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr>מו"פ<td>VEGF אנושי רקומביננטי</td><td> D Systems</td><td>293-VE-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>אזמל נשלף</td><td>פישר</td><td>22-079-716</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaHCO<תת>3)</td><td>פישר</td><td>AC217125000</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>פישר</td><td>AC327300010</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום רוטט</td><td>מכשירי קמפדן</td><td>7000 SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td>קסילזין הידרוכלוריד (100 מ"ג/מ"ל)</td><td>אספקה וטרינרית של הרטלנד</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

חיתוך ולבבות חזיר מקולף בתנאים פיסיולוגיים

Slicing and Culturing Pig Hearts under Physiological Conditions

תרופות הרומן הרבות להיכשל במחקרים קליניים בשל תופעות לוואי cardiotoxic כמו כיום זמין מחוץ לתחום במודלים בעלי חיים vivo לחזות התחייבויות לב האדם, פוזות נטל רב מיליארד דולר על תעשיית התרופות. לפיכך, יש צורך רפואי ברחבי העולם לגישות טובות יותר כדי לזהות קרדיולוקסיניטי סמים לפני התחייבות יקר זמן רב ' הראשון במבחנים של האדם. כיום, רק תאים לב בלתי מפותחים (האדם המושרה ביותר בתאי גזע הנגרמת על ידי מערכת החייאה) משמשים כדי לבדוק יעילות טיפולית רעילות הסמים כפי שהם היחידים בתאי הלב האנושיים שיכולים להיות מתורבתים לתקופות ממושכות נדרש כדי לבדוק את יעילות הסמים ואת הרעילות. עם זאת, סוג תא בודד אינו יכול לשכפל את הפנוטיפ של רקמת הלב 3D מורכבת אשר נוצרת של סוגי תאים מרובים. וחשוב מכך, השפעת הסמים צריכה להיבדק על הקרדיוציטים מבוגרים, שיש להם מאפיינים שונים ותגובות רעילות בהשוואה ל-היפנוסק-CMs בלתי-מפותח. הפרוסות של לב האדם מהווה מודל מבטיח של שריר הלב האנושי ללא פגע. טכנולוגיה זו מספקת גישה למערכת מסחר מלאה המחקה את רקמת הלב האנושית ומשקפת את התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים של שריר הלב האנושי. לאחרונה, באמצעות אופטימיזציה של רכיבי מדיה התרבות ותנאי התרבות לכלול גירוי חשמלי רציף ב 1.2 Hz ו חמצן לסירוגין של מדיום התרבות, פיתחנו התקנה חדשה של מערכת התרבות אשר שומרת על יכולת הקיום והפונקציונליות של פרוסות לב של אדם וחזיר למשך 6 ימים בתרבות. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מפרט את השיטה לחיתוך לב חזיר מקולף כדוגמה. אותו פרוטוקול משמש גם לפרוסות תרבות מלבבות אנושיים, כלבים, כבשים או חתולים. זו מערכת התרבות יש את הפוטנציאל להיות האדם ניבוי חזק במודל באתרו עבור בדיקות קרדיולקסיטיות חריפה הסוגרת את הפער בין תוצאות בדיקה קלינית קליני.

באמצעות ממריץ מסחרי של תרבות התא הזמין מסחרית כי יכול להכיל שמונה 6 צלחות היטב בבת אחת, אנו לחיקוי של למבוגרים את הסביבה הלב על ידי גרימת גירוי חשמלי בתדר הפיזיולוגי (1.2 Hz), והוקרן עבור רכיבים בינוניים בסיסיים כדי להאריך את המשך של פרוסות לב של חזיר פונקציונלי בתרבות13. מאז לבבות חזיר ובני אדם דומים בגודל ואנטומיה15, פיתחנו לב ביואידיי מערכת התרבות הפרוסה באמצעות לבבות חזיר ולאחר מכן אימות אותו בפרוסות לב האדם. כאן, המפורט את הפרוטוקול לפר...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחתוך את רקמת הלב והתרבות בתנאים פיסיולוגיים במשך 6 ימים. מערכת זו של התרבות יכול לשמש פלטפורמה לבדיקת היעילות של אי ספיקת לב הרומן therapeutics, כמו גם בדיקות אמינות של הקרדיוקרדיטיות חריפה במודל לב תלת-ממדי.

Many novel drugs fail in clinical studies due to cardiotoxic side effects as the currently available in vitro assays and in vivo animal models poorly ...

פרוטוקול זה הוא עבור חיתוך ו culturing רקמת הלב קטעים במשך שישה ימים תחת תנאים פיזיולוגיים אשר ניתן להשתמש בהם עבור בדיקות רעילות לב חריפה, כמו גם בדיקת היעילות של טיפולים אי ספיקת לב. מערכת תרבות זו יש פוטנציאל להיות אדם חיזוי רב עוצמה במודל situ לבדיקות רעילות לב חריפה כי סוגר את הפער בין תוצאות בדיקות פרה קליניות קליניות. הדגמת ההליכים תהיה צ'ינגהוי קו, מנהל מעבדה מהמעבדה שלנו.כדי להשיג פרוסות רקמת לב חזיר, ראשית להוסיף קרח ז'קט קירור אמבטיה רקמה של רטט ולהוסיף פתרון Tyrode לאמבטיה. השתמש בצנצנת פלסטיק של ליטר אחד כדי לאסוף את נגר הקרח המומס ממעיל הקירור של אמבט הרקמות ולהעביר את לב החזיר למגש המכיל ליטר אחד של תמיסת קרדיו-plegic קרה טרייה בארון biosafety. השתמש אזמלים סטריליים נשלפים לנתח את הלב כדי לבודד את החדר השמאלי ולהשתמש סכיני גילוח מלבניים לחתוך את החדר השמאלי לתוך אחד עד שני קוביות סנטימטר בלוקים.מניחים בצד בלוק רקמה אחד לחיתוך ומניחים את חתיכות בלוק הרקמה הנותרות לתוך צינור 50 מיליליטר של פתרון טירודה קר על קרח. לעסות בעדינות את בלוק הרקמה השמור ולהוסיף אחת עד שתי טיפות של דבק רקמות למחזיק דגימת המתכת של הרטט. תקע חתיכה של בלוק 4%agar עם שטח פנים של כ סנטימטר מרובע אחד להדביק ולהוסיף אחת עד שתי טיפות של דבק רקמה אגר.חבר את בלוק הלב לצד אפיקארדיום לב אגר למטה עם הרקמה שטוחה נגד המחזיק ככל האפשר ולהמקם את מחזיק הרקמה עם בלוק הלב לתוך האמבטיה חיתוך של הרטט. זה חיוני כדי לתקוע את בלוק הלב אל אגר עם הצד אפיארדיום לב פונה כלפי מטה על דבק הרקמה כדי לוודא את הרקמה היא שטוחה ככל האפשר. לאחר מכן חבר את צינור החמצן לאמבט החותך ואת מגש המתכת המלא בתסכת טירודה והצב 40 מסנני תאים מיקרומטר על מגש המתכת כדי לאסוף את חלקי רקמת הלב כפי שהם פרוסים.השתמש בתוכנת ההפעלה vibratome כדי להתאים את גובה הלהב ואת המדגם, כך הלהב קרוב לראש הרקמה אבל מתחת לשרירים papillary ונוזל מכסה את הרקמה ואת הלהב. בחר מראש כדי להתאים היכן להתחיל חיתוך הרקמה. לחץ על פרוסה כדי להגביר את המהירות ולהשתמש ידית כדי להזיז את הלהב לכיוון קצה הרקמה.לחץ שוב על פרוסה כדי לעצור ולהתקדם כדי לבטל את הפעלת התהליך. לאחר מכן להתאים את הפרמטרים חיתוך כפי שצוין ולחץ על פרוסה כדי להתחיל לחתוך את הרקמה. כאשר הלהב מגיע לקצה הרקמה אך לפני שהוא פוגע בקצה מחזיק הדגימה, לחץ שוב על פרוסה כדי לעצור ולחץ לחזור למצב ההתחלה.כאשר הפרוסות מגיעות לאורך מלא נראה באיכות טובה, להשתמש פיפטה פסטר פלסטיק מלא פתרון טירודה קר לאסוף בעדינות את הרקמה מהאמבטיה באמצעות מדפים ומספריים האביב כדי לנטרל את הפרוסה מהלב לפי הצורך. מניחים כל פרוסה שנאסף מסננת תא יחיד באמבט Tyrode מחומצן ולהשתמש בתסגם פיפטה ללחוץ על הרקמה על פני מסננת התא. ואז למקם מכונת כביסה מתכת על החלק העליון של הרקמה להחזיק אותו.לאחר שעה אחת לפחות בתסרון Tyrode מחומצן, לקצץ את החלק החיצוני של כל פרוסה כדי להסיר את כל הקצוות אחידים להדביק את הקצה של כל פרוסה על חתיכה ברוחב שישה מילימטר של חגורת תזמון מדפסת פוליאוריתן מעוקרת עם חוטי מתכת מוטבעים. מניחים את פרוסות הלב הנתמכות לתוך שש בארות צלחות המכילות שישה מיליליטר של תרבות בינונית לבא ולהשתמש ממטרים סטריליים כדי לוודא כי הרקמה היא במרכז באר. יש לדאוג כי כיסוי הצלחת לא לגעת ברקמה ולה מניח את הצלחת על צלחת התרבות, כך הצד המעוקל של כיסוי הצלחת תואם עם הצד הזוויתי של הצלחת ואת הפינות המרובעות בשורה.מניחים את הפרוסות לתוך 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור. החלף את על-טבעי התרבות בשישה מיליליטר של תרבות מחומצנת טרייה שלוש פעמים ביום. חבר את הכיסוי לגירוי החשמלי של תרבות התאים והתאם את המגרר כדי לספק באופן רציף 10 וולט חשמל ותדר הרץ 1.2 לפרוסות הלב.לאחר חיבור הגירוי, פרוסות הלב יתחילו לפעום. כל יום במהלך שינוי התקשורת בצהריים, להחליף את כיסוי צלחת גירוי מצלחת התרבות כדי למנוע שחרור של חלקיקי גרפיט רעילים לתוך מדיום התרבות. הכנס את תקע הקצף הלבן שבו הכיסוי המשמש מתחבר לכבל עבור מגרה חשמלי תרבות התא כדי למנוע נזקי מים למעגל החשמלי ולמקם את כיסוי הצלחת לתוך אמבטיה של מים autoclaved בתוספת 2X אנטיביוטי / אנטימיקוטי.למחרת, לטהר את כיסוי הצלחת באמבט אתנול 70% במשך חמש עד 15 דקות לפני העברת הכיסוי לתוך אמבט מים autoclaved טרי בתוספת אנטיביוטיקה 2X / antimycotic במשך שלוש דקות. לאחר שטיפה של כיסוי הצלחת, השתמשו בניגוב נקי ללא מוך מרוסס באתנול כדי להסיר את כל שאריות המים מחלקי הפלסטיק ולהסיר את תקע הקצף הלבן. לאחר מכן העטיפה מוכנה להצבה חזרה לצלחת התרבות.באמצעות התקנה זו תרבות ביומימטית חדשה כפי שהודגם, הכדאיות פרוסות לב חזיר נשמר במשך שישה ימים כפי שהוערך על ידי MTT assay. בששת הימים הראשונים, בדומה לתגובות שנצפו לפרוסות לב טריות, אין ארעי סידן ספונטניים בתוך לב החזיר פרוסת קרדיומיוציטים. הקרדיומיוציטים הגיבו לגירוי חשמלי ובטא-אדרנרגי חיצוני.בנוסף, הכוח מתכווץ ותגובות isoproterenol נשמרו בתרבות פרוסת הלב עד שישה ימים דומים לזה שנצפה פרוסות לב טריות. ניתן לבצע מספר הערכות מבניות ותפקודיות על פרוסות הלב, כולל בדיקות כדאיות MTT, כשל חיסוני, מיקרוסקופ אלקטרונים, מדידות סידן ארעיות, הערכות תפקודית מתכווצים, הערכות מטבוליות וניתוח. אנו משתמשים כעת במערכת תרבות זו כדי לבדוק את רעילות לב חריפה ויעילות של תרופות וטיפולים גנטיים של עניין חזיר ופרוסות לב אנושי.

slicing-and-culturing-pig-hearts-under-physiological-conditions

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

במאמר זה תיארנו את הדרך טיפוסי לבודד תרבות עכברוש מבוגר myocytes לב. Collagenase ו פרוטאז משמשים לעכל לבודד myocytes יחיד. Myocytes תרבותי לעקוב בפרוטוקול זה לעמוד בדרישות הניסוי ביותר.

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

סרטון זה מדגים הליך מבוסס ויברטומים ליצירת חלקים דקים במיוחד של לב חזיר. פרוסות הרקמה המוכנות ניתנות לתרבית ומשמשות כמערכות מודל לבדיקות פרמקולוגיות.

יצירת פרוסות חדריות חזיריות: טכניקה מבוססת ויברטומים להכנת פרוסות דקות במיוחד של רקמת לב חזיר

בסרטון זה, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב לחילוץ הלב ממודל חזירי להשתלת לב.

כריתת לב חזירית: פרוטוקול לחילוץ לב חזירי להשתלת לב

סרטון זה מתאר טכניקה אקס-סיטו לשימור לב חזירי מבודד על ידי ניקובו בתמיסת פרפוזט עשירה בחומרים מזינים מחומצנים. הטכניקה מאפשרת הערכה מקיפה של ביצועי הלב בתנאים פיזיולוגיים.

זילוח לב Ex Situ: טכניקה לשימור תפקוד לב חזירי מבודד

כמה פרוטוקולים פותחו ותיארו לבידוד של סוגי תאים לב שונים של הלב חולדה. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של איכות גבוהה תאים מרכזיים של תאים לב (cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת, הפחתת עלויות הניסוי.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות חדר קיימא מעכברים בוגרים ושימוש שלהם עבור הקלטות אלקטרודה פעולה פוטנציאליים חדים. אלה תכשירים תאיים לספק השתמר in vivo כמו מבנה רקמות, מה שהופך אותם מודל יקר עבור מחקרים אלקטרו-פרמקולוגיים במבחנה .

מורין קצר ציר הלב ואת פרוסות הלב עבור מחקרים אלקטרו

מטרת מחקר זה הייתה ליצור שיטה לחקירת דינמיקה קרדיולוגית באמצעות מודל בעלי חיים טרנסלבותית. הגישה הניסיונית המתוארת משלבת אופקרדיוגרפיה כפולה בשילוב עם מחקר אלקטרולוגי להערכת פעילות החשמל במודל לב פורצין מבודד, שלם.

אופקרדיוגרפיה ולימודי אלקטרופיזיולוגיה של לשעבר Vivo נגדורף

פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור הנחת פרוסות לב של האדם לניסויים פרה-קליניים ופרטים השימוש במיפוי אופטי עבור הקלטת מתח טרנסממברניות ואותות סידן תאיים בו מפרוסות אלה.

מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

מוצג כאן פרוטוקול לשימור התכווצות כלי הדם של רקמת הריאה המורינית PCLS, וכתוצאה מכך תמונה תלת ממדית מתוחכמת של כלי הדם הריאתי ודרכי הנשימה, אשר ניתן לשמר עד 10 ימים כי הוא רגיש הליכים רבים.

פרוסות ריאות חתוכות מדויקות ככלי יעיל למבנה כלי הריאות Ex vivo ולמחקרי התכווצות

טיפול גנטי בשריר הלב למחלות לב איסכמיות טומן בחובו הבטחה גדולה לטיפולים עתידיים. כאן, אנו מציגים מודל חייתי גדול להערכת היעילות של ריפוי גנטי בלב איסכמי.

מודל בעלי חיים גדולים להערכת יעילות הטיפול הגנטי בלב איסכמי

למדו לחתוך ולגדול שכבות רקמת לב חזיר בתנאים פיזיולוגיים למשך שישה ימים. שיטה זו מאפשרת בדיקת יעילות טיפולי אי-ספיקת לב והערכת רעילות לבית חריפה במודל חזוי.

חיתוך ולבבות חזיר מקולף בתנאים פיסיולוגיים

גלה סרטונים נוספים