Name: מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: חקור את שיטת TRAP לבידוד RNA באיכות גבוהה מסוגי תאים ספציפיים בצמחים. טכניקה זו מאפשרת חקר תהליכי התפתחות שורשים ותקשורת בין תאים ברזולוציה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

היינו רוצים להודות ז ' אן קלוד וואלזר של המרכז גיוון גנטי ציריך עבור ייעוץ מומחה מכריע בשלב מוקדם של פרויקט זה. העבודה במעבדה ורמר נתמך על ידי מענק מפרופסור SNF (PP00P3_157524) ו R' צייד ציוד מענק (316030_164086) מן הקרן הלאומית המדע השוויצרי (SNF) הוענק JEMV.

. למחברים אין מה לגלות

אימות תבנית הלוקליזציה של RPL18 חיוני כדי למנוע פרשנות של נתונים מכל ניסוי השמנה היא תבנית הביטוי הנכון של יחידת המשנה הריבוזומתית המתויג. לכן, שילוב של GFP כמו תג אפירופה ל RPL18 מאוד באלגנטיות מאפשר אימות של דפוס הביטוי הרצוי ברציפות, מתחת השבר polysome מן הרקמה אותה. גישות פולשנית יותר כדי להבטיח דפוסי היזם הנכון הם ואחריו jiao ו mayerowitz 2010, אשר דורש כתמים גאס ו טיאן et al. 2019 המסתמכת חיסוני עם אנטי דגל נוגדנים58,59.
<p class="jo...

מונע על ידי יישום הגוברת של טכניקות רצף הדור הבא, רזולוציה מרחבית בביולוגיה התפתחותית יכול להיות מוגבר. מחקרים עכשוויים מכוונים לניתוח רקמות למטה לסוגי תאים מיוחדים, אם לא ברמה אחת של תא1,2,3,4. למטרה זו, שפע של שיטות שונות המציאו במשך 50 השנים האחרונות (ראה איור 1a)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
כלים רבים במדעי הצמח הינם עיבודים של טכניקות שהיו חלוץ במחקר בעלי חיים. זה לא המקרה לשיטה שאנו מציגים בפרוטרוט כאן. ב 2005, מצויד ברקע חזק בתרגום חלבון, מעבדה ביילי Serres להנדס ריבוזומלי חלבונים עבור האהדה הבאה טיהור16. לפיכך, הם יכולים להימנע מיצירת פרופיל רב פעמי ומעמיק לעבודה, אשר מבוסס על מעבר באמצעות שיפוע של סוכות ושימש להערכת תרגום הריבוזומים מאזשנות ה-60,18. השיטה מאז המכונה ריבולtional טיהור אהדה (מלכודת)16. לאחר לימודי העברה מוצלחים בצמחים, מלכודת היימן ואח ' לבעלי חיים19 ואחרים הרחיבו את היישום שלה ל-20שמרים, דרוסופילה21, קסנפוס22 ו-דג זברה23,24.
למרות השינוי הגנטי של מערכת המודל הוא תנאי מוקדם עבור השמנה, אשר מגביל את היישום שלה מינים הניתנים לטרנספורמציה גנטית, ניתן בו לרתום התנגדות זו כדי למקד את קבוצות המשנה של תאים, כי הם בעלי עניין מיוחד, ובכל זאת קשה מאוד לבודד מן הרקמה בשלמותה/איבר25 (למשל בצמחים, כל התאים מוחזקים במקומם דרך קירות התא היוצרים את הבסיס של שלד הידרוסטטי26. כדי לשחרר תא צמח ממטריקס זה, מדענים יש גם לחתוך פיזית את התא מתוך הרקמה המקיפה שלה דרך לכידת לייזר מיקרוניתוח (LCM)27 או ביצע העיכול אנזימטי של קירות התא28. בין התאים האחרונים, מה שנקרא פרוטואופרציה, האוכלוסייה של העניין היא בעלת תווית בדרך כלל וניתן להפריד באמצעות מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS)7. LCM בדרך כלל דורש מדגם להיות קבוע מוטבע שעווה, אשר בסופו של דבר מתדרדר את האיכות של ה-RNA שלה29. FACS מבוססי שיטות להניב RNA באיכות גבוהה, אבל התהליך של protoplasting עצמו מציג הבדלים ביטוי גנים30 ורקמות עם קירות תא משני שונה ועבה הם לשמצה קשה לטפל. כמו-כן, מניחים על תהליכים התפתחותיים רבים בצמחים להסתמך על אותות מכנית ולכן השלמות של קיר התא היא בעלת חשיבות עליונה31. שתי שיטות, אשר להשתמש בקיצור דרך לעקוף בידוד התא על ידי הפעלה ברמה של נוקלאושני, הם מיון גרעיני המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית (מאווררים) ובידוד של גרעינים מתויג סוגי תאים ספציפיים (שלמות). כמו במלכודת, הם משתמשים ביזמים ספציפיים לסוג תא כדי לסמן גרעינים, שלאחר מכן לקבל מועשר באמצעות מיון או למשוך למטה, בהתאמה8,15. האתגר העיקרי עבור כל הגישות הללו היא לקבל די חומר RNA מקבוצות המשנה של תאים ברקמה. כמו המלכודת לוכדת רק חלק של RNAs הסלולר, אוסף לדוגמה הוא צוואר בקבוק משמעותי. לפיכך, דרושות במיוחד פרוטוקולי הכנה לספריה הרגישים כדי להפיק נתונים באיכות גבוהה מכמויות קלט נמוכות.
מאז הקמתה, המלכודת כבר נעשה שימוש בשילוב עם מיקרו מערכים DNA או, כמו עלויות רצף ירד באופן משמעותי בשנים האחרונות, RNA-seq10,32,33. הרבה שאלות מחקר כבר הובהר כפי שנסקרו בסאבלוק ואח '.34. אנחנו משוכנעים כי דוחות יותר יעברו בשנים הקרובים כמו הטכניקה היא מאוד תכליתי בעת שילוב יזמים שונים כדי למקד סוגי תאים ספציפיים. בסופו של דבר, זה ייעשה גם בדרך inducible, והוא עשוי להיות משולב עם בדיקת תגובת הצמח לגורמי סטרס ביוטיים ובין רבים. בנוסף, כאשר קווים הטרנסגניים יציבה אינם זמינים, מערכות שעירות ביטוי השורש יש גם בהצלחה לבצע מלכודת עגבניות ותרופות35,36.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> איור 1: מתרגם הריבוכמה אהדה (השמנה) משלים את תיק הניתוח "omics". A. הגדלת רמות של דיוק אנליטי, עד תא יחיד או אפילו ברזולוציה subcellular יכול להיות מושגת על ידי שפע של שיטות או שילובים מהם. התוכנית מעניקה סקירה של הכלים הזמינים כעת בתחום הצמח ובעלי החיים. אוסף רקמות ברזולוציה התאית יכול להיות מושגת על ידי פרוטוקולים כמו LCM או FACS, אשר מצמידים לאחר מכן להמרה סטנדרטי או polysome בדיקת פרופיל/translatome. מלכודת ושלמות לשלב לכידת רקמות בידוד RNA כפי שהם מבוססים על התיוג האפיפי. עם זאת, דגימות שלמות רק גרעיני התא ומהווה, לכן, מקרה מיוחד של ניתוח ההמרה. סמל ארנב קטן מסמן שיטות שפותחו לאחרונה בשדה בעלי חיים: בעוד סלאם-itseq ו flura-seq להסתמך על יקוד מטבולית של rnas מחדש עם שינוי אורציל בתאים ביטוי האנזים מאשרני, שקופית-seq עושה שימוש בשקופית זכוכית מצופה עם ברקודים DNA המספקים מידע מיקומני ב הגישה תיוג הקרבה מלווה איפקס-seq כדי לדגום RNAs בתאי subcellular ספציפיים. בעיקר, רזולוציה מוגברת לעתים קרובות דורש את הדור של החומר הטרנסגניים (כוכביות) ושיטות אלה משמשות בעיקר עבור מינים מודל. המלכודת מתאימה במיוחד עבור מדעי הצמח לימודי מעורבים קיר תא (CW) או איתות מכונאי, כמו גם מינים תאים שקשה לשחרר מתוך מטריצה CW שלהם. ב. מפורט שלבי המעבדה הרטובה של הליך המלכודת: השתילים מבטאים חלבון מתויג מסוג gfp בסוגים שונים של תאים (כגון אנדודרסיס שורש) גדלים על מנות פטרי במשך שבעה ימים וחומר שורש שנקטפו על ידי הקפאת ההקפאה. מדגם סה כ בקרת RNA נאסף מתוך תמצית גולמי הומוגניים לפני הפלטינג פסולת באמצעות צנטריפוגה. חרוזים אנטי-GFP מגנטיים נוספים לתמצית נקי לבצע immunoprecipitation. לאחר הדגירה ושלושה צעדים לשטוף, ה-RNA polysome הקשורים (מלכודת/polysome RNA) הוא קיבל ישירות באמצעות כלורופורם פנול-הכלורופורם. LCM: לכידת לייזר מיקרודיסקציה, FACS/אוהדים: תא מופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית/מיון גרעיני, איפקס-seq: שיטה המבוססת על הנדסה ascorbate peroxidase, שלמות: בידוד של גרעינים מתויג סוגי תאים ספציפיים, סלאם-ITseq: thiol (SH)-האלקילציה מקושרת עבור רצף חילוף החומרים של RNA ברקמות, Flura-seq: fluorouracil-התווית ברצף RNA (נוצר עם Biorender.com) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג</a>
המטרה של מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של שיטת TRAP, כדי להדגיש שלבים קריטיים ולספק הדרכה לשיטת הכנה לספריה אפשרית.
ניסוי המלכודת הגנרית יהיה למעשה מורכב השלבים הבאים (ראה גם איור 1B): (1) הכנת חומר הצמח כולל שיבוט של ריבוכמה תיוג בניית, הייצור קו טרנסגניים ובחירה, גדל ו bulking של זרעים, עיקור וציפוי, ומתח יישום/טיפול (אופציונלי) ו לקצור רקמות; (2) אימונופיקציה, כולל המגון רקמות וניקוי של תמצית גסה, שטיפת חרוזים ואימונופיקציה, ולשטוף את הצעדים; (3) הערכת הוצאת רנ א ואיכות; ו (4) הכנה לספרייה.
שורש arabidopsis כבר מערכת מודל ללמוד פיתוח הצמח מאז המבוא שלה כמפעל דגם37,38. כאן, היישום של המלכודת הוא לראווה בהקשר של פיתוח השורש הצמח לרוחב. בצמחים, הצטברות של מערכת השורש כולה מסתמך על ביצוע של תוכנית זו ולכן חשוב מאוד להישרדותו של האורגניזם39. באראידאופזיס, שורשי הצדדיים מקורם ברקמת כלקרום העור השוכנת ליד כלי הדם ולכן הוא כינה את המוט הקרום (xpp; ראה איור 2 ג)40. כמה תאים XPP, אשר נמצאים עמוק בתוך השורש, לרכוש זהות תא מייסד, על גורם הורמונלי מקומי, להתחיל להתרבות על ידי נפיחות וחילוק אנטיליבאלי41. עם זאת, בשל נוכחותם של מטריצת קיר נוקשה התא, תהליך זה מפעילה לחץ מכני על הרקמות הסובבות. בפרט, אנדודראמיס הנמצא במעלה מושפע, כפי שהוא בדרך של ציר צמיחה שורש לרוחב42,43,44. אכן, החדש הקמתה החדשה יהיה צריך לצמוח דרך התאים האנדודרסטיות האלה (איור 2c2) בעוד תאי הקליפה והאפידרמיס הם רק דחפו הצידה הפריבדיום לבסוף לצאת45,46. העבודה האחרונה במעבדה שלנו הראתה כי האנדודרסטיות תורמת באופן פעיל כדי להכיל את השגשוג בקרום הלב. חסימה ממוקדת של איתות הורמונלי אנדועורי מספיק כדי לעכב גם את החלוקה הראשונה מאוד בתאים XPP47. לפיכך, התקשורת האנדוציציסטית מהווה מחסום מוקדם מאוד לפיתוח השורש הרוחבי בערידרופזיס. עם זאת, לא ידוע כיצד מבוצע הוצלב הזה. כדי לפתור את התעלומה הזאת, אנחנו בחרנו את הגישה השמנה-seq כדי למקד את התאים XPP וכלי העורי. כדי להעשיר את התאים בתוכנית השורש לרוחב, אנו לחקה את הגורם ההורמונלי על ידי החלת באופן שונה היישום מערכת הקלה אנלוגי (1-נפלוג חומצה אצטית, NAA)48, אשר באותו זמן מותר לפתור באופן זמני את השלב הראשוני של היווצרות השורש הצדדי.

<table><tbody><tr><td><חזק>עיקור</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה, 13%</td> <td>סיגמא</td><td>71696</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>214-1172/74/75</td><td></td></tr><tr><td>מייבש עם צלחת חרסינה (DURAN)</td><td>Sigma/Merck</td><td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td><td></td></tr><tr><td>EtOH, p.a.</td><td>Honeywell</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>HCl, 37%</td> <td>Roth</td><td>4625.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td><גידול צלחת >חזק + קציר</מלחי ></td><td></td><td></td><td></td>MS חזקים</tr><tr><td>/חזקים, תערובת מלח בסיס, כולל מאגר MES</td><td>צמח אגר Duchefa</td><td>M0254</td><td></td></tr><tr><td>לתרבית תאים</td><td>Applichem/Panreac</td><td>A2111.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>forcepts</td><td>Rubis Switzerland</td><td>5-SA דגם</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fluka</td><td>60370</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-נקבוביות/סרט כירורגי</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>NAA</td><td>Duchefa</td><td>N0903</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי 120x120 מ"מ</td><td>אזמל</td><td></td> 688102 <td></td>גריינר ביו-וואן</tr><tr><td></td><td>רקמות VWR/Swann-Morton</td><td>233-5454</td><td></td></tr><tr><td>, ניטרליות, דו-שכבתיות</td><td></td><td></td><td>כל ספק לבחירתך</td></tr> <tr><td><חזק>משקעים חיסוניים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-חרוזים: gtma-100 GFP-Trap_MA</td><td>Chromotek</td> למשל צינורות צנטריפוגה <td>gtma-100</td><td></td></tr><tr><td>Brij-35</td><td>Sigma</td><td>P1254-500G</td><td></td></tr><tr><td>(בהתאם ל צנטריפוגה)</td><td>בקמן קולטר</td><td>357001</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>Applichem</td><td>C0378-25G</td><td></td></tr><tr><td>כפפות כותנה</td><td>VWR</td><td>113-7355</td><td></td></tr><tr><td>ציקלוהקסימיד, HPLC</td><td>כיתה סיגמא</td><td>01810-1G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>VWR</td><td>E174</td><td>עשויים להיות בעלי זמני אספקה ארוכים</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזרים DUALL 23</td><td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td><td>SCERSP885450-0023 (סט)</td><td>SCERSP885451-0023 עלי בלבד - SCERSP885452-0023 צילינדר בלבד; זמני אספקה ארוכים</td></tr><tr><td>Igepal CA-360</td><td>Sigma</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 hexahydrat</td><td>Roth</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>מרגמה ועלי</td><td>VWR</td><td>470148-960 & 470019-978</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Roche</td><td>10 837 091 001</td><td></td></tr><tr><td>פוליאוקסיאתילן-(10)-טרידצילאתר/PTE</td><td>סיגמא</td><td>P2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא RNase</td><td>Roth</td><td>T143.3</td><td></td></tr><tr><td>RNAZap</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9780/AM9782</td><td>לניקוי משטחים</td></tr><tr><td>Tris, >99.3% </td><td>Roth</td><td>AE15.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>T8787-250 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ml</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol, p.a.</td><td>Sigma</td><td>33539-1L-GL-R</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם, Scharlau בדרגת HPLC</td><td></td><td>CL02181000</td><td></td></tr><tr><td>EtOH, p.a.</td><td>Honeywell</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה בעלי שמירה נמוכה, 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf/Sigma</td><td>Z666548-250EA</td><td>LoBind</td></tr> סט <tr><td>DNase ללא RNase</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol ריאגנט</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td><חזק>הכנת ספרייה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15/50 מ"ל מפריד מגנטי צינור</td><td>Abraxis</td><td>PN 472250</td><td></td></tr><tr><td>AMPure חרוזים</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אינדקס A</td> ערכת אינדקס <td>Illumina</td><td>FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>D</td><td>Illumina</td><td>FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>מגנטים ניאודימיום</td><td>אמזון/אחר</td><td>6 x 1.5 מ"מ טווח: N42 (NdFeB)</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024/1096</td><td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a></td></tr><tr><td>PCR רצועות</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer v4 kit</td><td>Takara Bioscience</td><td>634892</td><td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Instrument ציוד מיוחד לבקרת איכות RNA/DNA</td></tr><tr><td>Tapestation</td><td></td><td>Agilent 4200 Tapestation Instrument</td><td>ציוד מיוחד לבקרת איכות RNA/DNA</td></tr><tr><td>מנתח שברים</td><td>Agilent</td><td>5400 Fragment Analyzer System</td><td>ציוד מיוחד לבקרת איכות RNA/DNA (תפוקה גבוהה)</td></tr><tr><td>LabChip</td><td>PerkinElmer</td><td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td><td>ציוד מיוחד לבקרת איכות RNA/DNA (תפוקה גבוהה)</td></tr><tr><td>Qubit 4 פלואורומטר</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td><td>ציוד מיוחד לקביעת ריכוז RNA/</td></tr><tr><td>DNAqRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA23</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: AGTGAGAATGAA AGAAGAGAAGGG; rev: GTGGCTGCGAAT AATATGAATACC</td></tr><tr><td>GH3.3</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: CAAACCAATCCT CCAAATGAC; rev: ACTTATCCGCAA CCCGACT</td></tr><tr><td>LBD29</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: TCTCCAACA GGTTGTGAAT; rev: AAGGAGCCTTAG TAGTGTCTCCA</td></tr><tr><td>UBC21</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: TGCGACTCAGGG AATCTTCT; rev: TCATCCTTTCTT AGGCATAGCG</td></tr><tr><td>SsoAdvanced אוניברסלי SYBR ירוק</td><td>ביו-רד</td><td>#172-5270</td><td></td></tr><tr><td>iScript Adv cDNA Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>#172-5038</td><td></td></tr><tr><td><שפופרות חזקות>שונות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלקון 15 מ"ל, שפופרות Cellstar</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 מ"ל, Cellstar</td><td>Greiner טיפים</td> לסינון <td>210261</td><td></td>bio-one</tr><tr><td>1 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>TF-1000-R-S</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לסינון 10 ומיקרו; l</td><td>קצות מסנן Axygen</td><td>TF-10-R-S</td><td></td></tr><tr><td>100 ומיקרו; l</td><td>טיפים לסנן Axygen</td><td>TF-100-R-S</td><td></td></tr><tr><td>20 ומיקרו; l</td><td>טיפים לסנן Axygen</td><td>TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; l</td> צינורות מיקרוצנטריפוגה <td>Axygen</td><td>TF-200-R-S</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-100MG</td><td></td></tr><tr><td>חברת ריצוף</td><td>Novogene</td><td></td><td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td></tr></tbody></table>

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

במאמר זה, אנו מעניקים הוראות הידיים על מנת להשיג נתונים טרנסלסיים מסוגים שונים של השורש החדש של שורש השיטה באמצעות הריבותרגום האהדה (השמנה) שיטה ומיטוב רצופות הכנה לספרייה נמוכה.
כחומר מתחיל, אנו מעסיקים קווי צמחים לבטא GFP-tagged חלבון RPL18 באופן ספציפי סוג תא על ידי שימוש ביזמים נאותים. לפני החילוץ והפקת ה-RNA, הרקמה מוקפאת, השומרת על שלמות הרקמה ובמקביל מאפשרת ביצוע מחקרי סדרת זמן ברזולוציה גבוהה. בעיקר, מבנים קיר התא נשארים ללא פגע, אשר הוא חיסרון משמעותי בהליכים חלופיים כגון מיון המופעל על-ידי תאים בעלי קרינה פלואורסצנטית מבוסס הגישה הנשענת על רקמות לבודד אוכלוסיות תאים נפרדות. בנוסף, אין קיבעון רקמות הכרחי כמו לכידת לייזר מבוססי מיקרוניתוח טכניקות, אשר מאפשר RNA באיכות גבוהה לקבל.
עם זאת, דגימה מאוכלוסיות משנה של תאים ורק בידוד polysome הקשורים RNA מגביל באופן חמור תשואות RNA. לכן, יש צורך להחיל שיטות רגישות מספיק לספרייה לרכישת נתונים מוצלחת על-ידי RNA-seq.
השמנה מציעה כלי אידיאלי עבור מחקר הצמח כמו תהליכים התפתחותיים רבים כרוך תאים הקשורים לקיר ומכני איתות. השימוש ביזמים למקד אוכלוסיות תאים ספציפיות הוא גישור הפער בין איבר ורמת תא בודד, כי בתורו סובלים מרזולוציה קטנה או עלויות גבוהות מאוד. כאן, אנו להחיל את המלכודת ללמוד תקשורת תא התא במערך השורש הצדדי.

להערכת איכות, ההליך הנ ל צריך להיות נחקר בשלבים ביניים מספר: אימות תבנית ביטוי בplanta, בקרת איכות של RNA polyזומבית מבודדים כמו גם של ספריות הסופי. רביעיית ה-PCR משתמש בגנים הידועים של סמן יכול, בנוסף, להתבצע כדי לאשר את התגובה למצב הטיפול או כדי לכוונן את התנאים הניסיוניים.
אנליזה קונקלית של התפלגות אותות GFP כדי לבדוק את שני דפוסי ביטוי xpp, ניתחנו שורות homozygous של peltp:: gfp-RPL18 ו pxpp:...

מתרגם הריבוכמה אהדה (מלכודת) מציעה את האפשרות לנתח תוכניות התפתחותיות עם עיבוד מינימלי של איברים ורקמות. הפרוטוקול מניב RNA באיכות גבוהה מתאים המיועדים עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-יחידת משנה ריבוזומבית. כלים לניתוח במורד הזרם, כגון רביעיית-PCR או RNA-seq, חושפים פרופילי ביטויים ספציפיים לסוג תאים.

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

עם TRAP, אנו יכולים לחקור עיבוד התפתחותי ברזולוציה סלולרית. אנו משתמשים ביזמים ספציפיים לתאים כדי לנהוג בתת-יחידה ריבוזומלית מתויגת, משם אנו יכולים לבודד RNA פוליזום. פרוטוקול זה מניב RNA באיכות גבוהה, אך בכמויות מוגבלות מאוד, לכן, שיטות המתמחות בקלט אולטרה נמוך נדרשות כדי לייצר באופן אמין ספריות RNA באיכות גבוהה.TRAP הוא כלי אידיאלי לחקר הצמח, כי תהליכים התפתחותיים רבים מסתמכים על מסלולי איתות הקשורים לקיר התא ומכאני. אנו משתמשים ב- TRAP כדי לחקור תקשורת תאים-תאים במבנה שורשים בין-תאיים. כמו קבלת RNA באיכות טובה הוכיח לא ישר קדימה כפי שציפינו, אנו מקווים כי הוראת וידאו צעד אחר צעד זה יגדיל את ישימות TRAP ולעזור לקדם טכניקה רבת עוצמה זו.כדי לעקר את הקווים הומוזיגיים מופצים, להפיץ פחות מ 300 microliters של זרעים באופן שווה על 12 על ידי 12 ס"מ בריבוע צלחות פטרי, לערום את הכלים על 60 ליטר desiccator. לאחר עיקור גז לילה, תן לגז להתאדות לפני איסוף הזרעים לתוך צינור אחסון 50 מיליליטר. לפני ציפוי, לדלל את הזרעים מעוקרים עם 0.1% אגר כדי לקבל מיליליטר אחד של תערובת זרעים חד-סיבית לכל צלחת.כדי לרכך את תערובת הזרעים, השתמשו במכסי צלחת פטרי מרובעים ליצירת מחזיק תבנית למין לשתילת שלוש שורות זרעים לצלחת, והכנסו צלחות אגר ריקות למחזיק התבנית. מפיצים מיליליטר אחד של הזרעים המוטבעים באופן שווה על שלוש שורות של צלחות. ומ מניחים את הצלחות המעובדות בערימות בזרימה למינארית, עד שהזרעים יבשים.כאשר זרעים נדבקו לפני השטח של אגר, לסגור את המכסים ולאטום כל צלחת עם סרט מיקרופור. לטיפול אקסוגני בשורשי Arabidopsis עם סוכן של עניין, להכין 1.5 עד שני סנטימטר רחב, 10 סנטימטר ארוך, רצועות של נייר טישו. משרים את נייר הרקמה ב-10 מיקרומולרים NAA, ולהשתמש פינצטה כדי להחיל רצועה של נייר טישו על כל שורה של שורשים.לאחר מכן, בעדינות ללחוץ את כל בועות האוויר, ולרוקן את הנוזל העודף מהצלחת, לפני תיוג הצלחת עם הזמן. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, השתמש במקלפים כדי להסיר בזהירות את רצועות נייר הרקמה מכל צלחת מבלי לנתק את השורשים, ולהשתמש בלהב כירורגי כדי לחתוך פעם אחת בכל שורה לאורך צומת שורש הירי, בשבץ נחוש אחד. השתמש פינצטה כדי להחליק לאורך השורשים של כל שורה, כדי לאסוף את השורשים בשלוש חבילות.ולרוקן את השורשים לתוך צינור 50 מיליליטר מלא חנקן נוזלי, להקפאת הצמד. כאשר כל דגימות השורש לכל טיפול נאספו, decant חנקן נוזלי עודף באמצעות מכסה הצינור כדי למנוע את השורשים לשפוך. ומ מניחים את הצינור לתוך כלי עושה, לאחסון 80 מעלות צלזיוס.לטחינת רקמות ולהומוגניזציה, לבשו כפפות כותנה תחת כפפות מעבדה סטנדרטיות, והוסיפו PMSF למאגר מיצוי הפוליסום. רוקנו את דגימת הרקמה לתוך מרגמה המכילה חנקן נוזלי, ולהשתמש עלה מקורר לטחון בזהירות את הרקמות עד שכל החומר מופיע כמו אבקה לבנה. כאשר כל הרקמה כבר הקרקע, להוסיף חמישה מיליליטר של מאגר מיצוי פולאזום לדגימה, במהירות לערבב את שברי רקמה קפואה עם האבקה לפני המאגר קופא.ברגע שניתן להעביר את התערובת, רוקנו את התרסיס לתוך הומוגניזר זכוכית על קרח, ולהשתמש בשני מיליליטר נוספים של חיץ מיצוי פוליוזום כדי לשטוף את המרגמה ואת העלי. לטחון ידנית את תרחיף עד התמצית היא הומוגנית. לאחר מכן, יוצקים את תמצית השורש הגולמי לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר על קרח, ולעבד את המדגם הבא כפי שהוכח.עבור איסוף RNA כולל, העבר 200 אליקוטים מיקרוליטר של כל מדגם גולמי לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים נקיים, מקוררים מראש ומסומנו. כדי להסיר קירות תאים, פסולת, ואברונים גדולים, צנטריפוגה הדגימות ו decant את supernatant לתוך צינורות חרוט טריים, מקורר מראש עבור צנטריפוגה שנייה. בעוד הצינורות מסתובבים, aliquot 60 microliters של חרוזי GFP מגנטיים לכל מדגם, לתוך צינור 1.5 מיליליטר.ולמקום את הצינור על מעמד מגנטי, כדי להקל על הסרה על טבעית. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעמיים במיליליטר אחד של חיץ לשטוף קר לכל לשטוף, ולהשעות מחדש את חרוזים 60 microliters של חיץ לשטוף לכל מדגם. מיד לאחר הצנטריפוגה, decant supernatant פינה לתוך שכותרתו צינורות 15 מיליליטר, ולהוסיף 60 microliters של חרוזים שטף לכל מדגם.לאחר מכן, מניחים את כל הדגימות אופקית לתוך דלי קרח, עבור דגירה של שעתיים עם נדנדה. בסוף הדגירה, לאסוף את חרוזים על מעמד מגנטי על קרח, ולהוסיף PMSF למאגר מיצוי פולים הנותרים. לאחר השלכת supernatants, להוסיף כחמישה מיליליטר של מאגר מיצוי פוליאזום לדגימות, ולהשעות מחדש את חרוזים בתוך הדגימות עם הטיה עדינה.רוק הדגימות במשך 15 דקות על שייקר על קרח, ואחריו שתי שטיפות עם חיץ לשטוף טרי על המגנט, כפי שהודגם. לאחר הכביסה האחרונה, להעביר את הדגימות במיליליטר אחד של חיץ לשטוף, לתוך צינור 1.5 מיליליטר. ולאסוף את חרוזים עוד פעם אחת על הדוכן המגנטי, כדי להסיר את כל העל טבעי.לאחר מכן, מניחים את הצינורות על קרח עד שכל הדגימות עובדו. לתיאום אספקת המעבדה, ראשית, שטפו את כל הציוד לפסולת הכימית. לשטוף את הידיים את המרגמות, העלים וההומוגניזרים בסבון, לפני שטיפת כל מכשיר ביסודיות.לאחר מכן, מניחים את הציוד במיכל בטוח לחום, ואופים את החומרים לילה מעל 220 מעלות צלזיוס. מברישים את כל צינורות הצנטריפוגה נקיים עם חומר ניקוי, לפני הנחת הצינורות על מגש autoclaveable עם שפה מכסה המנוע אדים. יוצקים מיליליטר אחד של דיתיל פירוקרבונט נוזלי וליטר אחד של תותבת מים deionized על הצינורות במשך שלוש עד 18 שעות.לאחר מכן, לאסוף את הפתרון לפני עיקור מגש של צינורות autoclave. כאן, מוצגים צמחים מייצגים עם אותות GFP. כתם נגדי עם יודיד פרופיד מסמן את קווי המתאר של קיר התא.הקווים תואמים לתבנית לוקליזציה של האנדידרמיס, ולקרסיקל הקוטב הקסים. במדידות מייצגות אלה שהתקבלו מ- RNA פוליזיום, רוב הדגימות הראו השפלה מועטה מאוד, עם מספרי שלמות RNA הנעים בין תשעה ל -10. בגרפים אלה, ניתן לראות עקבות של ספריות שהוכנו בהצלחה, המדגישות את החוסן של ההליך, למרות נפחי תגובה מוקלדים.לפני הפקת ערכת נתונים פורשת גנום, TRAP RNA מניסוי פיילוט ניתן לחקור על ידי RTPCR כמותי כדי לאמת את הצלחת הטיפול ו / או את התנאים הניסיוניים, כמו גם את הספציפיות של הרקמה. בניתוח זה, הבדיקה של שלושה גנים מגיבים לאוקסין אישרה אינדוקציה הורמונלית מוצלחת לאחר שעתיים של טיפול. פרופילי גנים ספציפיים לרקמות שאוחזרו מנתוני רצף אישרו את הספציפיות של סוג התא.בצע ייעוץ תרגול טוב כאשר אתה מטפל RNA. לעבוד על ספסל סטרילי, לנקות את הציוד שלך עם פתרון להסרת RNA, ללבוש כפפות מיד לשנות אותם כאשר הם מקבלים מזוהמים. הקפד לטפל כראוי להשליך את כל הכימיקלים והגזים הרעילים ששימשו במהלך ההליך, במיוחד גז כלור פנול-DEPC וחנקן נוזלי.בפורטפוליו של מחקרים אומיים, TRAP תופסת נישה חשובה, וכבר שימשה כדי לענות על שאלות ביולוגיות רבות, במיוחד בביולוגיה התפתחותית, TRAP יש פוטנציאל עצום.

translating-ribosome-affinity-purification-trap-to-investigate

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

שיטה לבידוד סוגי תאים מסוימים של חומר צמחי מודגם. טכניקה זו מעסיקה קווי סמן מהונדס המבטא חלבוני ניאון בסוגי תאים מסוימים, הסלולר דיסוציאציה Fluorescence מיון הופעל תא. בנוסף, ההתקנה גידול מוקמת כאן המאפשרת...

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) מסוגל ללכוד תרגום ספציפי לסוג התא של mRNA. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול TRAP הראשון המוקדש לבידוד mRNA באוכלוסיות תאים נדירות של עוברי דרוזופילה.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

תאית גבישית היא מרכיב חשוב בדופן התא של הצמח. עם זאת, הכימות שלו ברזולוציה סלולרית הוא מאתגר מבחינה טכנית.  כאן, אנו מדווחים על שימוש בטכנולוגיית אור מקוטב וחתכי שורש כדי לקבל מידע על הרכב דופן התא ברזולוציה מרחבית-זמנית.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

אנו מציגים גישה כדי לטהר את הריבוכמה מאוגד-mRNA מתאי כלי הדם (ECs) ישירות במוח העכבר, הריאות ורקמות הלב באמצעות התגית הגנטית ספציפית EC של חלבון פלואורסצנטית ירוק משופר (EGFP) ב ריבוזומים בשילוב עם טיהור RNA .

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

אנו משתמשים בכלי מעבדה פשוטים כדי לבחון את ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA) של Arabidopsis ו- Medicago. העציצים גדלים באופן הידרופוני על גבי רשת ומפוזרים באמצעות מברשת אמנותית כדי לחשוף את ה-RSA. התמונות מצולמות באמצעות סריקה או מצלמה ברזולוציה גבוהה, ולאחר מכן מנותחות באמצעות ImageJ כדי למפות תכונות.

פרוטוקול פשוט למיפוי תכונות ארכיטקטורת מערכת שורש הצמח

ההיתכנות והיעילות של שיטות scRNA-seq בעלות תפוקה גבוהה מבשרות על עידן חד-תאי בחקר צמחים. מוצג כאן הליך חזק ומלא לבידוד סוגי תאי שורש ספציפיים של Arabidopsis thaliana ובנייה וניתוח של ספריית שעתוק לאחר מכן.

בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

תהליך זה עושה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם גרעין מסומן פלואורסצנטי וקו סמן כרומטין ב-Arabidopsis thaliana כדי לתעד בו-זמנית את דינמיקת הגרעין והכרומטין בשורשי הערבידופסיס ולחקור שינויים בדינמיקה אלו בתגובה לרמזים התפתחותיים וסביבתיים.

הדמיה כמותית של תאים חיים של צורת גרעין ודינמיקת כרומטין במהלך ההתפתחות ולחץ סביבתי בשורש Arabidopsis thaliana

חקור את שיטת TRAP לבידוד RNA באיכות גבוהה מסוגי תאים ספציפיים בצמחים. טכניקה זו מאפשרת חקר תהליכי התפתחות שורשים ותקשורת בין תאים ברזולוציה תאית.

מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

גלה סרטונים נוספים