חיבור קוולנטי של מולקולות בודדות לספקטרוסקופיית כוחות מבוססי AFM
16 במרץ 2020
החזקה הקוולנטי של מולקולות בדיקה למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מהווה טכניקה חיונית לחקירת התכונות הפיזיות שלהם. זה מאפשר לנו לקבוע את כוח מתיחה, כוח desorption אורך של פולימרים באמצעות AFM מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה עם היכולת הגבוהה.
ספקטרוסקופיית כוח מולקולה אחת מאפשרת לנו למדוד פרמטרים פיזיקליים המתארים את התכונות המכאניות וההיבקותיות של פולימרים. בעת שימוש בספקטרוסקופיית כוח מבוססת AFM לחקר מולקולות בודדות, חיוני שיהיה פרוטוקול אמין ויעיל לקשירת מולקולות אלה באופן קוולנטי לקצה cantilever AFM. פרוטוקול זה יכול להיות מאומץ פולימרים רבים ושונים ללא קשר לאורך קווי המתאר או הידרופוביות.
כל השלבים צריכים להתבצע ברדס אדים כדי למנוע שאיפה של אדים אורגניים. בנוסף, זכוכית עמידה בפני ממסים, חלוק מעבדה והגנה על העיניים נדרשים. ראשית להשתמש פינצטה נוקה טרי למקם שבבי cantilever AFM בתא הפלזמה.
הפעל את תוכנית ההפעלה של משטח תא הפלזמה על-ידי בחירה באפשרות התחל ולאחר מכן כן. ודא שתהליך הפלזמה פועל כראוי. תהליך פלזמה עם תכולת חמצן גבוהה מראה צבע כחול בהיר.
בעוד תוכנית הפעלת פני השטח מתבצעת, להמיס סילאן-PEG-mal בטולואן כדי לקבל ריכוז של 1.25 מיליגרם למיליליטר. מניחים שלושה מיליליטר של הפתרון בצלחת פטרי שטוחה. לאחר השלמת תהליך הפלזמה, לאוורר את תא הפלזמה על ידי בחירת לאשר ולאחר מכן אוורור.
המשך מיד לשלב הבא על מנת למנוע ספיגת מזהמים. מניחים את הצ'יפס בצלחת פטרי ו דגירה את הצ'יפס במשך שלוש שעות ב 60 מעלות צלזיוס. מוציאים את צלחת פטרי מהתנור ומאפשרים לה להתקרר לפחות 10 דקות.
לאחר מכן, שטפו את הצ'יפס. עבור PEG או קשירה פוליסטירן, לשטוף את השבבים עם toluene שלוש פעמים. עבור כריכת פוליניפאם, יש לשטוף שבבים פעם אחת עםטולואן ופעמיים עם אתנול.
כדי להפחית את ההשפעה של כוחות נימי על cantilever AFM, להטות את השבבים מעט בעת שטיפה. שבבי ה-AFM צריכים להיות שטיפה כראוי כדי להסיר כל עודף של פולימרים פיזיים אשר עשוי להשפיע על הניסוי. יש לבצע שטיפה בזהירות כדי למנוע כל נזק ל- AFM cantilevers.
לבסוף, הכינו לפחות שני שבבים שישמשו כפקדים שלא יעברו חיבור פולימרי קווולנטי. לפקדים לעומת שבבי PEG ופוליסטירן, יש לשטוף פעמיים באתנול ופעם במים. לפקדים לעומת שבבי פוליניפאם, יש לשטוף פעמיים במים.
כדי לבצע התקשרות קוואלנטית של PEG או פוליסטירן, להכין שלושה מיליליטר של פתרון פולימר בטולואן בריכוז של 1.25 מיליגרם למיליליטר. מוסיפים את הפתרון ואת הצ'יפס לצלחת פטרי ו דגירה את הצ'יפס ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה עם PEG או פוליסטירן, אפשרו לשבבים להתקרר במשך 10 דקות.
שוטפים את השבבים פעמיים עםטולואן, פעמיים עם אתנול, ופעם אחת עם מים. כדי לבצע התקשרות קוולנטית של פוליניפאם, להכין שלושה מיליליטר של פתרון פולימר באתנול בריכוז של 1.25 מיליגרם למיליליטר. מוסיפים את הפתרון ואת הצ'יפס לצלחת פטרי ומדרבן את הצ'יפס בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות.
לאחר הדגירה עם פוליניפאם, לשטוף את השבבים פעמיים עם אתנול ופעמיים עם מים. כדי לאחסן את השבבים עד לשימוש בניסוי, מניחים כל שבב בנפרד בצלחת פטרי מיליליטר אחת מלאה במים. שמור את מנות פטרי בארבע מעלות צלזיוס.
ראשית, הכנס את שבב ה-AFM הפונקציונלי למחזיק שבבים. הדבק את המשטח המוכן למחזיק מדגם המתאים למדידות בנוזל. השתמש פיפטה לטבול את השבב במים.
תן את משטח הדגימה לתוך ה-AFM. לטבול את פני השטח מדגם במים. חבר את מחזיק השבבים ל- AFM.
ואז להתקרב השבב למשטח המדגם. השתמש בלוח הסביבתי כדי להגדיר את טמפרטורת היעד ולהחליף את המצב ואת לחצני האפשרויות של המשוב. לאחר מכן תן למערכת לצייד במשך כ -15 דקות.
כדי לקחת עקומת הארכת כוח, התקרב לקצה ה- AFM אל פני השטח ובחר כוח יחיד. העקומה המתקבלת מציגה את ההטיה כנגד מרחק הפיזו כאשר הגישה לפני השטח מוצגת באדום והנסיגה מוצגת בכחול. הרחב את חלק העקומה המייצג את הכניסה של קצה ה- CANTILEVER של AFM לתוך המשטח שמתוחיו.
לביצוע התאמה ליניארית, הגדר סמנים בגישה או בעקומות הנסיגה ובחר עדכן את INVOLS מהתפריט תלוי ההקשר. הערך המתקבל עבור ערך הרגישות האופטית ההופכית של הידית מופיע בחלונית בפינה השמאלית העליונה. לאחר חזרה על הליך זה לפחות חמש פעמים, לחשב ממוצע עבור רגישות מנוף אופטי הפוכה להזין את הממוצע בלוח.
מקם את ה- AFM בגובה של כ- 100 מיקרומטר מעל פני השטח על-ידי בחירת מעבר לפעולה מוקדמת. כדי לקבל יחס אות לרעש משביע רצון עבור ספקטרום הרעש התרמי, הגדר את הספירה הממוצעת ל- 10 לפחות ובחר את רזולוציית התדר הגבוהה ביותר האפשרית. לאחר מכן, רשום את ספקטרום הרעש התרמי על-ידי בחירת לכידת נתונים תרמיים.
כדי להתאים את ספקטרום הרעש התרמי עם פונקציית מתנד הרמונית פשוטה, הרחב את החלק של העקומה המייצג את שיא תהודה הראשון. לאחר מכן בחר אתחל התאמה. לבסוף, מקד את לחצן התאם באמצעות לחצן התאם נתונים תרמיים.
קבוע הכוח המתאים יופיע בלוח. כדי להתחיל לאסוף את הנתונים, הגדר את הפרמטרים עבור הניסוי. הגדר מהירות משיכה למיקרומטר אחד לשנייה וכוח הדק לננו-ננוטון אחד.
התקרבו לקצה ה-AFM אל פני השטח ובחרו כוח אחד כדי לתעד עקומה אחת ולקבוע אם יש להתאים את הפרמטרים כמתואר בכתב היד. בחרו 'מפת F' מהחלונית הראשית. כדי להשיג מפת כוח עם 100 עקומות, הגדר את מספר נקודות הכוח וכפה קווים ל- 10.
התחל להקליט את מפת הכוח על-ידי בחירה באפשרות בצע מפת F. קח עקומות הארכת כוח בצורה דמוית רשת כדי למנוע אפקטים משטח מקומיים כדי ממוצע שטחים שונים. לאחר הניסוי, חזור על קביעת הרגישות האופטית ההופכית של המנוף וקבוע האביב כדי לבדוק את העקביות ואת יציבות המערכת.
פולימרים פוליאפם ו- PEG יחידים היו קשורים באופן קוולנטי לקצה מתכלה AFM בקצה אחד ו physisorbed על פני השטח דו תחמוצת הסיליקון בקצה השני. כדי למדוד התנהגות מתיחה תלוית טמפרטורה, זוהה אירוע מתיחה ברור של מולקולה אחת ואחריו מקסימום סופי בסוף עקומת הארכת הכוח המתאימה. ואז נוצרה עקומת מאסטר אחת לכל טמפרטורה.
עבור PEG, ירידה של כוח מתיחה נצפתה עם עליית הטמפרטורה. עבור פוליניפאם, המגמה ההפוכה נצפתה. ניתן להשתמש בהרס של פוליסטירן מפני השטח של SAM במים כדי לקבוע את כוח ההתפלה ואת האורך.
כאשר חיבור הפולימר הצליח, עקומות הרחבת הכוח הראו מישורים של כוח מתמיד. כל רמה צוידה בעקומה סיגמואידית כדי לקבוע את כוח ההתפלה ואורך ההתפלה. כוחות ההתפלה שנצפו תואמים לערכים שהושגו בעבר.
כאשר יותר מפולימר אחד מחובר קצה cantilever AFM, מפלים של מישורים נצפו עקומות הרחבת כוח. עם שני פולימרים מחוברים, התפלגות דו-מודאלית נמצאה לאורך ההתפלה בעוד כוח ההתפלה הראה התפלגות צרה. קצה מתפקוד AFM cantilever יכול לשמש לכימות תגובת הכוח של מולקולות בודדות בסביבה נוזלית עם גירויים חיצוניים.
השימוש בציוד נקי, ממיסים, טיפים ל-AFM ושטיפת מידע חוזרת ונשנית חשוב מאוד להגיע לרמה גבוהה של ניקיון שיש לאשר לפני הניסויים המבוקרים המתוארים. הפרוטוקולים והנהלים שהוצגו סללו את הדרך להבנה טובה יותר של מערכות פולימר מגיבות גירויים. ניתן להשוות את התוצאות ישירות לסימולציות דינמיות מולקולריות.
סקירה כללית
מאמר זה דן בפרוטוקול לחיבור קוולנטי של מולקולות גשש לקצותיהם של קנטילברים במיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM), דבר החיוני לחקר התכונות הפיזיקליות של פולימרים. שיטה זו מאפשרת מדידה של כוחות מתיחה, כוחות דסורפציה ואורכי פולימרים ברמת הדירות גבוהה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- מדע הפולימרים
רקע
- ספקטרוסקופיה של כוח במולקולה בודדת היא חיונית למדידת תכונות מכניות של פולימרים.
- פרוטוקולים מהימנים לקישור קוולנטי לקנטילברים של AFM נחוצים לצורך מדידות מדויקות.
- אמצעי בטיחות הם קריטיים בעת טיפול בממסים אורגניים.
- טכניקות שטיפה נכונות הן חיוניות למניעת זיהום.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מפורט לחיבור קוולנטי של פולימרים לזרועות AFM.
- הבטחת הדירות במדידת תכונות פיזיקליות של פולימרים.
- הקלה על חקר פולימרים שונים ללא קשר למאפייניהם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפעלה של פני השטח של שבבי קנטיליבר AFM באמצעות תא פלזמה.
- הכנת תמיסות פולימר להיספח קוולנטי.
- פרוטוקולי דגירה ושטיפה להבטחת קישור תקין.
- מדידת עקומות כוח-מתיחה באמצעות AFM.
תוצאות עיקריות
- חיבור קוולנטי מוצלח של PEG, פוליסטירן ו-polynipam לקנטילברים של AFM.
- הוכחת הדירות במדידות כוח.
- מתן שיטה מקיפה להכנה ולשימוש בקנטילברים פונקציונליים של AFM.
- הדגשת החשיבות של שטיפה ושבבי ביקורת בניסויים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר מחקרים מהימנים של תכונות פולימרים באמצעות AFM.
- הכנה וטיפול נאותים הם קריטיים להצלחת הניסויים.
- יישומים עתידיים יכולים להתרחב לסוגים ותצורות שונות של פולימרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
חיבור קוולנטי של מולקולה בודדת מאפשר מדידות ספקטרוסקופיה של כוח הניתנות לשחזור, החיוניות להפחתת סיכונים במועמדים תרופתיים מבוססי פולימרים. גישה זו מספקת נתונים מכניים ואדהסיביים כמותיים התומכים בתיקוף מטרה ובזיהוי מובילים במערכות להולכת תרופות המגיבות לגירויים. על ידי קביעת נקודות ייחוס אמינות למולקולה בודדת, השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בבחירת מודלים פרה-קליניים ובהחלטות תעדוף של פורטפוליו.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של אינטראקציות בין פולימרים לפני שטח כדי להבהיר מנגנוני קישור והרלוונטיות התפקודית של המטרה.
- ערך תפעולי: מספק מאות עקומות כוח-מתיחה ממולקולה אחת, ובכך מפחית את השונות הניסויית ומגביר את מהימנות הנתונים.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות כוחות מתיחה ודסורפציה תחת גירויים מבוקרים, ובכך מספק מידע על קשרי מבנה-תכונה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות של כוח-מתיחה (כוח מתיחה, כוח דסורפציה, אורך) המתאימות לסריקת פולימרים בעלת תוכן גבוה.
- ערך תפעולי: פרוטוקולים סטנדרטיים של חיבור קוולנטי ושטיפה מבטיחים את השחזוריות של הבדיקה בין סוגי פולימרים וסדרות ניסוייות שונות.
- יכולת הרחבה: ניתן לאחסן ולהשתמש שוב בקנטילברים פונקציונליים של AFM, מה שמאפשר פריסה של הפלטפורמה בכל תהליכי הגילוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: ניתן להשוות ישירות נתונים של ספקטרוסקופיית כוחות ממולקולות בודדות לסימולציות של דינמיקה מולקולרית, ובכך לגשר בין קני מידה עבור מידול חזוי.
- מערכות רלוונטיות למחלות: ישיים לפולימרים המגיבים לגירויים (למשל, PEG, PNiPAM) המשמשים למסירת תרופות, ובכך מאפשר הערכה של התנהגות תלוית-טמפרטורה או תלוית-pH.
- הפחתת סיכונים טרום-קלינית: מודד אירועי דסורפציה בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית, ובכך תומך בהחלטות go/no-go לקידום הפורמולציה.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקה ראשונית של פולימרים ועד לבדיקות פורמולציה פרה-קליניות, ומספקת נתונים על תכונות מכניות התורמים לאופטימיזציה של המועמדים המובילים ולהתקדמות מבוססת ניהול סיכונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבחינת היפותזות של היצמדות פולימרים ויציבות מכנית בסביבות נוזליות, ובכך מפחית עמימות מכניסטית.
- סקר: מספק מדידות כוח כמותיות וסטנדרטיות המאפשרות השוואה מהימנה של מועמדי פולימרים מתוך ספריות שונות.
- אנליטיקה: התוצרים כוללים פרמטרים של כוח ואורך הנגזרים מהתאמה סיגמואידית של רמות פלטו, מה שמאפשר השוואה סטטיסטית בין מנות פולימרים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין התנהגות של מולקולה בודדת לבין ביצועי פולימר במסה, ותומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להכין שבבים פונקציונליים במנות, לאחסנם ב-4°C ולהשתמש בהם שוב בפרויקטים שונים, ובכך למקסם את יעילות המשאבים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באינטראקציות בין פולימרים לפני שטח, ובכך מגביר את הביטחון בבדיקות תיקוף של מטרות.
- ערך תפעולי: יכולת שחזור גבוהה באמצעות חיבור קוולנטי מבוקר ושטיפה קפדנית הממזערים תוצאות חיוביות שגויות ורעש ניסיוני.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מבוססת נתונים לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) בבחירת פולימרים, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון של פורמולציות בשלבים מאוחרים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מועמדי פולימרים בהתבסס על פרופילים מכניים ואדהזיביים כמותיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתפעול AFM, טיפול פלזמה במשטחים וטיפול בתמיסות פולימרים.
- נדרשים תא פלזמה, אינקובטור עם בקרת טמפרטורה, כלי זכוכית עמידים בממסים ומכשיר AFM עם יכולת תא נוזלים (liquid-cell).
- נדרש סטנדרטיזציה של פרוטוקולי השטיפה בין הצוותים כדי למנוע ארטיפקטים של כוחות קפילריים וזיהומים.
- יש להתחשב בתנאי קישור ספציפיים לפולימר (למשל, toluene לעומת ethanol, זמן וטמפרטורת אינקובציה) כפי שפורט בפרוטוקול.
- מגבלה מעשית: פרשנות מוצלחת של מולקולה בודדת תלויה בצפיפות משטח נמוכה כדי למנוע רצפים של מספר מולקולות בעקבות הכוח (force traces).
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Surface Activation, Silanization, and PEGylation
3:03
Covalent Polymer Attachment
4:21
Determining the Inverse Optical Lever Sensitivity (InVOLS)
6:13
Determining the AFM Cantilever Force Constant
7:06
Data Collection
8:10
Results: Single-Molecule Stretching and Desorption
9:44
Conclusion
