חיבור קוולנטי של מולקולות בודדות לספקטרוסקופיית כוחות מבוססי AFM
March 16th, 2020
החזקה הקוולנטי של מולקולות בדיקה למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מהווה טכניקה חיונית לחקירת התכונות הפיזיות שלהם. זה מאפשר לנו לקבוע את כוח מתיחה, כוח desorption אורך של פולימרים באמצעות AFM מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה עם היכולת הגבוהה.
ספקטרוסקופיית כוח מולקולה אחת מאפשרת לנו למדוד פרמטרים פיזיקליים המתארים את התכונות המכאניות וההיבקותיות של פולימרים. בעת שימוש בספקטרוסקופיית כוח מבוססת AFM לחקר מולקולות בודדות, חיוני שיהיה פרוטוקול אמין ויעיל לקשירת מולקולות אלה באופן קוולנטי לקצה cantilever AFM. פרוטוקול זה יכול להיות מאומץ פולימרים רבים ושונים ללא קשר לאורך קווי המתאר או הידרופוביות.
כל השלבים צריכים להתבצע ברדס אדים כדי למנוע שאיפה של אדים אורגניים. בנוסף, זכוכית עמידה בפני ממסים, חלוק מעבדה והגנה על העיניים נדרשים. ראשית להשתמש פינצטה נוקה טרי למקם שבבי cantilever AFM בתא הפלזמה.
הפעל את תוכנית ההפעלה של משטח תא הפלזמה על-ידי בחירה באפשרות התחל ולאחר מכן כן. ודא שתהליך הפלזמה פועל כראוי. תהליך פלזמה עם תכולת חמצן גבוהה מראה צבע כחול בהיר.
בעוד תוכנית הפעלת פני השטח מתבצעת, להמיס סילאן-PEG-mal בטולואן כדי לקבל ריכוז של 1.25 מיליגרם למיליליטר. מניחים שלושה מיליליטר של הפתרון בצלחת פטרי שטוחה. לאחר השלמת תהליך הפלזמה, לאוורר את תא הפלזמה על ידי בחירת לאשר ולאחר מכן אוורור.
המשך מיד לשלב הבא על מנת למנוע ספיגת מזהמים. מניחים את הצ'יפס בצלחת פטרי ו דגירה את הצ'יפס במשך שלוש שעות ב 60 מעלות צלזיוס. מוציאים את צלחת פטרי מהתנור ומאפשרים לה להתקרר לפחות 10 דקות.
לאחר מכן, שטפו את הצ'יפס. עבור PEG או קשירה פוליסטירן, לשטוף את השבבים עם toluene שלוש פעמים. עבור כריכת פוליניפאם, יש לשטוף שבבים פעם אחת עםטולואן ופעמיים עם אתנול.
כדי להפחית את ההשפעה של כוחות נימי על cantilever AFM, להטות את השבבים מעט בעת שטיפה. שבבי ה-AFM צריכים להיות שטיפה כראוי כדי להסיר כל עודף של פולימרים פיזיים אשר עשוי להשפיע על הניסוי. יש לבצע שטיפה בזהירות כדי למנוע כל נזק ל- AFM cantilevers.
לבסוף, הכינו לפחות שני שבבים שישמשו כפקדים שלא יעברו חיבור פולימרי קווולנטי. לפקדים לעומת שבבי PEG ופוליסטירן, יש לשטוף פעמיים באתנול ופעם במים. לפקדים לעומת שבבי פוליניפאם, יש לשטוף פעמיים במים.
כדי לבצע התקשרות קוואלנטית של PEG או פוליסטירן, להכין שלושה מיליליטר של פתרון פולימר בטולואן בריכוז של 1.25 מיליגרם למיליליטר. מוסיפים את הפתרון ואת הצ'יפס לצלחת פטרי ו דגירה את הצ'יפס ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה עם PEG או פוליסטירן, אפשרו לשבבים להתקרר במשך 10 דקות.
שוטפים את השבבים פעמיים עםטולואן, פעמיים עם אתנול, ופעם אחת עם מים. כדי לבצע התקשרות קוולנטית של פוליניפאם, להכין שלושה מיליליטר של פתרון פולימר באתנול בריכוז של 1.25 מיליגרם למיליליטר. מוסיפים את הפתרון ואת הצ'יפס לצלחת פטרי ומדרבן את הצ'יפס בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות.
לאחר הדגירה עם פוליניפאם, לשטוף את השבבים פעמיים עם אתנול ופעמיים עם מים. כדי לאחסן את השבבים עד לשימוש בניסוי, מניחים כל שבב בנפרד בצלחת פטרי מיליליטר אחת מלאה במים. שמור את מנות פטרי בארבע מעלות צלזיוס.
ראשית, הכנס את שבב ה-AFM הפונקציונלי למחזיק שבבים. הדבק את המשטח המוכן למחזיק מדגם המתאים למדידות בנוזל. השתמש פיפטה לטבול את השבב במים.
תן את משטח הדגימה לתוך ה-AFM. לטבול את פני השטח מדגם במים. חבר את מחזיק השבבים ל- AFM.
ואז להתקרב השבב למשטח המדגם. השתמש בלוח הסביבתי כדי להגדיר את טמפרטורת היעד ולהחליף את המצב ואת לחצני האפשרויות של המשוב. לאחר מכן תן למערכת לצייד במשך כ -15 דקות.
כדי לקחת עקומת הארכת כוח, התקרב לקצה ה- AFM אל פני השטח ובחר כוח יחיד. העקומה המתקבלת מציגה את ההטיה כנגד מרחק הפיזו כאשר הגישה לפני השטח מוצגת באדום והנסיגה מוצגת בכחול. הרחב את חלק העקומה המייצג את הכניסה של קצה ה- CANTILEVER של AFM לתוך המשטח שמתוחיו.
לביצוע התאמה ליניארית, הגדר סמנים בגישה או בעקומות הנסיגה ובחר עדכן את INVOLS מהתפריט תלוי ההקשר. הערך המתקבל עבור ערך הרגישות האופטית ההופכית של הידית מופיע בחלונית בפינה השמאלית העליונה. לאחר חזרה על הליך זה לפחות חמש פעמים, לחשב ממוצע עבור רגישות מנוף אופטי הפוכה להזין את הממוצע בלוח.
מקם את ה- AFM בגובה של כ- 100 מיקרומטר מעל פני השטח על-ידי בחירת מעבר לפעולה מוקדמת. כדי לקבל יחס אות לרעש משביע רצון עבור ספקטרום הרעש התרמי, הגדר את הספירה הממוצעת ל- 10 לפחות ובחר את רזולוציית התדר הגבוהה ביותר האפשרית. לאחר מכן, רשום את ספקטרום הרעש התרמי על-ידי בחירת לכידת נתונים תרמיים.
כדי להתאים את ספקטרום הרעש התרמי עם פונקציית מתנד הרמונית פשוטה, הרחב את החלק של העקומה המייצג את שיא תהודה הראשון. לאחר מכן בחר אתחל התאמה. לבסוף, מקד את לחצן התאם באמצעות לחצן התאם נתונים תרמיים.
קבוע הכוח המתאים יופיע בלוח. כדי להתחיל לאסוף את הנתונים, הגדר את הפרמטרים עבור הניסוי. הגדר מהירות משיכה למיקרומטר אחד לשנייה וכוח הדק לננו-ננוטון אחד.
התקרבו לקצה ה-AFM אל פני השטח ובחרו כוח אחד כדי לתעד עקומה אחת ולקבוע אם יש להתאים את הפרמטרים כמתואר בכתב היד. בחרו 'מפת F' מהחלונית הראשית. כדי להשיג מפת כוח עם 100 עקומות, הגדר את מספר נקודות הכוח וכפה קווים ל- 10.
התחל להקליט את מפת הכוח על-ידי בחירה באפשרות בצע מפת F. קח עקומות הארכת כוח בצורה דמוית רשת כדי למנוע אפקטים משטח מקומיים כדי ממוצע שטחים שונים. לאחר הניסוי, חזור על קביעת הרגישות האופטית ההופכית של המנוף וקבוע האביב כדי לבדוק את העקביות ואת יציבות המערכת.
פולימרים פוליאפם ו- PEG יחידים היו קשורים באופן קוולנטי לקצה מתכלה AFM בקצה אחד ו physisorbed על פני השטח דו תחמוצת הסיליקון בקצה השני. כדי למדוד התנהגות מתיחה תלוית טמפרטורה, זוהה אירוע מתיחה ברור של מולקולה אחת ואחריו מקסימום סופי בסוף עקומת הארכת הכוח המתאימה. ואז נוצרה עקומת מאסטר אחת לכל טמפרטורה.
עבור PEG, ירידה של כוח מתיחה נצפתה עם עליית הטמפרטורה. עבור פוליניפאם, המגמה ההפוכה נצפתה. ניתן להשתמש בהרס של פוליסטירן מפני השטח של SAM במים כדי לקבוע את כוח ההתפלה ואת האורך.
כאשר חיבור הפולימר הצליח, עקומות הרחבת הכוח הראו מישורים של כוח מתמיד. כל רמה צוידה בעקומה סיגמואידית כדי לקבוע את כוח ההתפלה ואורך ההתפלה. כוחות ההתפלה שנצפו תואמים לערכים שהושגו בעבר.
כאשר יותר מפולימר אחד מחובר קצה cantilever AFM, מפלים של מישורים נצפו עקומות הרחבת כוח. עם שני פולימרים מחוברים, התפלגות דו-מודאלית נמצאה לאורך ההתפלה בעוד כוח ההתפלה הראה התפלגות צרה. קצה מתפקוד AFM cantilever יכול לשמש לכימות תגובת הכוח של מולקולות בודדות בסביבה נוזלית עם גירויים חיצוניים.
השימוש בציוד נקי, ממיסים, טיפים ל-AFM ושטיפת מידע חוזרת ונשנית חשוב מאוד להגיע לרמה גבוהה של ניקיון שיש לאשר לפני הניסויים המבוקרים המתוארים. הפרוטוקולים והנהלים שהוצגו סללו את הדרך להבנה טובה יותר של מערכות פולימר מגיבות גירויים. ניתן להשוות את התוצאות ישירות לסימולציות דינמיות מולקולריות.
סקירה כללית
מאמר זה דן בפרוטוקול להצמדה קוולנטית של מולקולות בדיקה לקצוות מרחיבי כוח אטומי (AFM), שהוא קריטי לחקר התכונות הפיזיקליות של פולימרים. השיטה מאפשרת מדידה של כוחות מתיחה, כוחות ספיחה ואורכי פולימרים עם שיחזוריות גבוהה.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביופיזיקה
- מדע הפולימרים
רקע
- ספקטרוסקופיית כוח מולקולרית יחידה היא חיונית למדידת תכונות מכניות של פולימרים.
- פרוטוקולים אמינים להצמדה קוולנטית למרחיבי AFM נחוצים למדידות מדויקות.
- אמצעי זהירות הם קריטיים בעת טיפול בממסים אורגניים.
- טכניקות שטיפה נאותות חיוניות כדי למנוע זיהום.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט להצמדה קוולנטית של פולימרים למרחיבי AFM.
- להבטיח שיחזוריות במדידת תכונות פיזיקליות של פולימרים.
- לאפשר את המחקר של פולימרים שונים ללא תלות במאפייניהם.
שיטות ששימשו
- הפעלת משטח של רפידות מרחיב AFM באמצעות תא פלזמה.
- הכנת פתרונות פולימר להצמדה קוולנטית.
- פרוטוקולי דגירה ושטיפה להבטחת קשירה נאותה.
- מדידת עקומות הרחבת כוח באמצעות AFM.
תוצאות עיקריות
- הצמדה קוולנטית מוצלחת של PEG, פוליסטירן ופוליניפאם למרחיבי AFM.
- הוכחת שיחזוריות במדידות כוח.
- מתודה מקיפה להכנה ושימוש במרחיבי AFM מתפקדים.
- הדגשת חשיבות השטיפה ושימוש ברפידות בקרה בניסויים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר מחקרים אמינים של תכונות פולימר באמצעות AFM.
- הכנה טיפול נאותים חיוניים לניסויים מוצלחים.
- יישומים עתידיים יכולים להתרחב לסוגים ותצורות פולימרים שונות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Covalent single-molecule attachment enables reproducible force spectroscopy measurements critical for de-risking polymer-based therapeutic candidates. This approach provides quantitative mechanical and adhesive data that supports target validation and lead identification in stimuli-responsive drug delivery systems. By establishing reliable single-molecule benchmarks, the method enhances predictive confidence in preclinical model selection and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of polymer-surface interactions to clarify binding mechanisms and functional target relevance.
- Operational Value: Provides hundreds of force-extension traces from a single molecule, reducing experimental variability and increasing data robustness.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying stretching and desorption forces under controlled stimuli, informing structure-property relationships.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative force-extension readouts (stretching force, desorption force, length) suitable for high-content polymer screening.
- Operational Value: Standardized covalent attachment and rinsing protocols ensure assay reproducibility across polymer types and experimental batches.
- Scalability: Functionalized AFM cantilevers can be stored and reused, enabling platform-wide deployment in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Force spectroscopy data from single molecules can be directly compared to molecular dynamics simulations, bridging scales for predictive modeling.
- Disease-Relevant Systems: Applicable to stimuli-responsive polymers (e.g., PEG, PNiPAM) used in drug delivery, enabling evaluation of temperature- or pH-dependent behavior.
- Preclinical De-risking: Measures desorption events under physiologically relevant conditions, supporting go/no-go decisions for formulation advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early polymer screening to preclinical formulation testing, providing mechanical property data that informs lead optimization and risk-adjusted advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of polymer adhesion and mechanical stability in liquid environments, reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Delivers standardized, quantitative force measurements that enable reliable comparison of polymer candidates across libraries.
- Analytics: Outputs include force and length parameters derived from sigmoidal fitting of plateaus, enabling statistical comparison of polymer batches.
- Translational Research: Connects single-molecule behavior to bulk polymer performance, supporting continuity from discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Functionalized chips can be prepared in batches, stored at 4°C, and reused across projects, maximizing resource efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in polymer-surface interactions, increasing confidence in target validation assays.
- Operational Value: High reproducibility through controlled covalent attachment and rigorous rinsing minimizes false positives and experimental noise.
- Strategic Value: Enables data-driven go/no-go decisions in polymer selection, reducing late-stage formulation failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of polymer candidates based on quantified mechanical and adhesive profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, plasma surface treatment, and polymer solution handling.
- Needs plasma chamber, temperature-controlled incubator, solvent-resistant glassware, and AFM with liquid-cell capability.
- Demands standardization of rinsing protocols across teams to prevent capillary force artifacts and contamination.
- Must account for polymer-specific binding conditions (e.g., toluene vs. ethanol, incubation time/temperature) as outlined in the protocol.
- Practical limitation: Successful single-molecule interpretation depends on low surface density to avoid multi-molecule cascades in force traces.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Surface Activation, Silanization, and PEGylation
3:03
Covalent Polymer Attachment
4:21
Determining the Inverse Optical Lever Sensitivity (InVOLS)
6:13
Determining the AFM Cantilever Force Constant
7:06
Data Collection
8:10
Results: Single-Molecule Stretching and Desorption
9:44
Conclusion
