Name: בידוד של קרדיומיוציטים מלבבות קבועים עבור אימונוציטוכימיה וניתוח פלוידי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: למד שיטה לבידוד קרדיומיוציטים מלבבות קבועים לניתוח פלוידי ואימונוציטוכימיה. הפרוטוקול מספק תפוקת תאים עקבית ומאפשר אימות ויזואלי של מצב הגרעינים והפלוידיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JHvB נתמך על ידי מענקים מ-NIH, רפואה רגנרטיבית במינסוטה, ופרס מחקר ביו-רפואי אישי מקרן הארטוול.

<ol><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (10), e146(2017).</li>
<li>Heidenreich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forecasting+the+future+of+cardiovascular+disease+in+the+United+States%3A+a+policy+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).</li>
<li>Eschenhagen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+Regeneration%3A+A+Consensus+Statement%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement.</a> Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).</li>
<li>Tzahor, E., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration+strategies%3A+Staying+young+at+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart.</a> Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
<li>Richardson, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Assessment+of+Cardiomyocyte+DNA+Synthesis+and+Ploidy%3A+A+Method+to+Assist+Quantification+of+Cardiomyocyte+Regeneration+and+Turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).</li>
<li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Shaklee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Click-Chemistry+Reagent+Compatible+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6657(2018).</li>
<li>Mollova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+proliferation+contributes+to+heart+growth+in+young+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).</li>
<li>Naqvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proliferative+burst+during+preadolescence+establishes+the+final+cardiomyocyte+number%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number.</a> Cell. 157 (4), 795-807 (2014).</li>
<li>Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+staging+of+individual+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy.</a> Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+mononuclear+diploid+cardiomyocytes+underlies+natural+variation+in+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration.</a> Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).</li>
<li>Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+DNA+content+in+live+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Division%22%5BJournal%5D)">Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy.</a> Cell Division. 13, 6(2018).</li>
<li>Woo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+phenotypic+assay+for+proliferation+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+identifies+L-type+calcium+channels+as+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).</li>
<li>Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-glycoprotein+complex+sequesters+Yap+to+inhibit+cardiomyocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation.</a> Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).</li>
<li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

מאז cardiomyocytes לא ניתן לשמור בתרבות, חשוב לבודד cardiomyocytes ראשוני כדי להיות מסוגל ללמוד את הארכיטקטורה שלהם ולתפקד11. לפיכך, טכניקות בידוד cardiomyocyte היו בשימוש נרחב בתחום הלב. אם המטרה היא לקבוע היבטים פונקציונליים של cardiomyocytes, חשוב לבודד cardiomyocytes קיימא. אלה cardiomyocytes חיים יכול לשמש גם כדי לבצע immunostaining על cardiomyocytes מבודד. עם זאת, אופטימיזציה של הטכניקה של בידוד cardiomyocytes חי הוא מאתגר מבחינה טכנית, ואפילו הטכניקות הטובות ביותר בדרך כלל רק להניב רק 60-65% קרדיומיוציטים בצורת מוט חיים, ואת קרדיומיוציטים הנותרים הם כל balledולמות או מת 11,12. כאן פיתחנו טכניקה שתאפשר לחוקרים לתקן תחילה את הלב, ולאחר מכן לבודד קרדיומיוציטים ביעילות. פרוטוקול חדש זה מאפשר תשואות גבוהות בהרבה של cardiomyocytes בצורת מוט בהשוואה לפרוטוקולים שפורסמו בעבר. יתר על כן, פיתחנו פלטפורמת ניתוח הדמיה לסווג cardiomyocytes באופן אוטומטי המבוסס על גרעין ותחבולה. עם מתודולוגיות חדשות אלה, קבוצות יכולות להכתים cardiomyocytes עבור חלבונים שונים, ולחקור cardiomyocyte תכסיס ומצב גרעין כתחליף לפוטנציאל ההתחדשות של הלב.
הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט יחסית, ותו לא ניתן לבצעו ללא כל ציוד מתקדם. כמות הקולגן וזמן הדגירה לעיכול עשויה להשתנות בהתאם למקצת הקולגנס, והחברה המספקת אותו. השתמשנו קולגן סוג 2, מאז זה משמש ביותר כדי לעכל את הלב להשגת cardiomyocytes חיים. בהתבסס על התצפיות שלנו, קבענו כי דגירה בן לילה עם 60 מ"ג / מ"ל קולגנאז סוג 2 הוא אופטימלי עבור כמעט כל לבבות העכבר ללא קשר לרמת פיברוזיס. מעולם לא הייתה לנו בעיה של עיכול יתר כמו חלבונים תאיים קבועים ולא נגישים כמו קולגן חוץ תאי. עם זאת, אם הלב אינו מתעכל כראוי, ייתכן שיהיה צורך בטריטורציה נמרצת יותר, מה שגורם לפיצול תאים עקב מתח גייה. לפיכך, חיוני לוודא שהלב מתעכל כראוי לפני שהוא עובר לתלת-תירגולציה. נוקשות של הלב יכול להיבדק על ידי לסחוט עם מפס כדי להעריך את מידת העיכול. בעקבות הדגירה עם קולגנאז, לבבות צריכים להיות פחות נוקשים וקל לקרוע לגזרים. סוגים אחרים של קולגנאז יכולים לשמש גם כן. דו"ח קודם השתמש בשילוב של קולאזנסים B ו- D14.
יתר על כן, אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את המספר הכולל של cardiomyocytes בלב15. עם זאת, אם המטרה היא להשיג ולכימת את כל cardiomyocytes מהלב, חשוב לעורר את הלבבות לפרקי זמן ממושכים בתמיסת הקולגן (למשל, 3-7 ימים), שבו יש לחדש את תמיסת הקולגן פעם ביום. זה יהיה למזער חוסר עקביות ביעילות בידוד על ידי ביטול ההשפעה של מידת הטריטורציה על תפוקת cardiomyocyte.
השימוש בתכני DNA כדי למדוד תכסיס אינו חדש, והיה בשימוש ציתום זרימה במשך עשרות שנים. לאחרונה, הראו כי מיקרוסקופ יכול לשמש באופן דומה כדי להעריך את תוכן ה-DNA לכל גרעין16. כאן, יישמנו אסטרטגיה זו כדי למדוד תחבולה של גרעיני cardiomyocyte, כפונדקאית עבור cardiomyocytes שנוצר לאחרונה. דוגמה בתחום התחדשות הלב היא כי רק מונורוצלול, קרדיומיוציטים דיפלואיד יכול לעבור ציטוקיניס ולועלות cardiomyocytes חדש. מאז זה מאוד מאתגר למדוד היווצרות cardiomyocyte חדש ב vivo, בידוד cardiomyocytes כי כבר נרדף לאחר ניהול של אנלוגי נוקלאוטיד DNA ולקבוע את רמת mononucleated, קרדיומיוציטים דיפלואיד שימש כעצוב של היכולת של הלב ליצור cardiomyocytesחדש 17. כאן, אנו מספקים מאקרו עבור ImageJ המאפשר כימות קלה של פלואיד cardiomyocyte. לכל הפחות, יש למדוד 500 גרעין כדי להשיג הערכה מדויקת של מיקום פסגת ה-G1. אם ננקט טיפול כדי להבטיח כי תנאי הכתמים וההדמיה עקביים על פני כל באר של הלוח התמונה, רק 500 גרעינים על פני המדגם כולו צריך להיות תמונה, אחרת, צריך להיות 500 גרעינים לכלקבוצת תמונה 18,19. מגבלות של מדידה מבוססת הדמיה של גרעין ותחבולה כוללות קושי להבחין בין גרעין לתאים דבקים מגרעין קרדיומיוציט בפועל, בעת שימוש בתמונות דו-ממדיות. תאים דבקים כאלה עלולים לגרום להערך יתר של כמות התאים המורבים ולהקטין את הדיוק של מדידות של אוכלוסיית גרעין קרדיומיוציט טטרפלואיד. אסטרטגיה אפשרית אחת כדי לפתור בעיה זו תהיה להשתמש סמן גרעיני cardiomyocyte PCM16,,20. עם זאת, היו לנו קשיים להשיג כתמי PCM1 אמין על תאים קבועים כראוי או רקמות.
מגבלה אפשרית נוספת היא כי כמה תמונות כתם גרעיני עשוי להיות כתמים צטופלסמיים רקע משמעותי, מניעת סף נכון באמצעות שיטות מובנות של פיג'י ללא עירוש טרום נרחב. בנוסף, התרומה הלא סדירה של פלואורסץ רקע זה להערכות תחבולות מפחיתה את הדיוק שלהם. יתר על כן, אם התאים לא יישארו בתמיסת כתם DNA מספיק זמן, צבע פלורסנט לא יהיה להיקשר רוויה בתוך הגרעין ואת ההנחה של קשר ליניארי בין עוצמה משולבת גרעינית ותוכן DNA כבר לא יהיה מדויק.
יש לציין כי התוכנה אינה יכולה מגזר אשכולות cardiomyocyte ובמקום זה מסיר אותם מניתוח. לכן, חשוב מאוד לזרוע קרדיומיוציטים בצפיפות נמוכה יחסית (למשל, 1000 תאים/ס"מ2). יתר על כן, התוכנה לא יכולה להבחין בין שני cardiomyocytes בשורה מקצה לקצה וארוך, cardiomyocytes יחיד. אשכולות מסוג זה עשויים לנפח בטעות הערכות רב-תזונה.
למרות השיטה המתוארת אינה מאפשרת להשיג cardiomyocytes קיימא ולכן לא ניתן להשתמש כדי למדוד תהליכים תאיים דינמיים, אם המטרה היא לבצע immunostaining, אנו מאמינים כי השיטה המתוארת עדיפה על פרוטוקולים קיימים עם תשואות גבוהות יותר של cardiomyocytes ואיכות טובה יותר במונחים של מורפולוגיה ומיקום חלבון. לבסוף, השיטה המתוארת יכולה לשמש לבידוד cardiomyocytes מדגימותקליניות 14,21. אנו מאמינים המתודולוגיה המתוארת יכולה לעזור לחוקרים שונים להשיג cardiomyocytes באיכות גבוהה למדוד גרעין ותחבולה כתחליף להיווצרות cardiomyocyte חדש.

מחלת לב הייתה הגורם המוביל למוות ברוב מדינות המערב במשך עשורים רבים1,2. למרות שיפורים רבים בטיפול במחלות לב וכלי דם השתפרו ההישרדות, אין כרגע טיפולים שיכולים להחליף קרדיומיוציטים אבודים. לכן, מחקרים הקשורים לתפקוד cardiomyocyte, התפשטות, אפופטוזיס והיפרטרופיה היו וממשיכים להיות מוקד מרכזי של הקהילה המדעית. מאז הלב היונקים הבוגר יש יכולת התחדשות מוגבלת מאוד, עם שיעור חידוש cardiomyocyte מוערך של פחות מ 1% בשנה, חשוב מאוד לזהות באופן אמין אירועי התפשטות cardiomyocyte3,4. רוב האסטרטגיות המודדות אירועים משגשגים מסתמכות על כתמות עבור אנלוגים נוקלאוטידים של דנ"א משולבים כדי להעריך התפשטות קודמת או נוכחית, או כתם עבור סמנים גרעיניים שלהתפשטות פעילה 5. חשוב במיוחד לזהות באופן אמין אירועים התפשטות cardiomyocyte מאז המספר הכולל של cardiomyocytes התפשטות הואכל כך נמוך 3,6. לדוגמה, בהתבסס על שיעור חידוש של 1% של cardiomyocytes אנדוגני בשנה, אפשר לצפות למצוא בין 25 ו 50 cardiomyocytes להיות משגשג בכל זמן נתון בלב העכבר הבוגר7,8. כל אי דיוקים בזיהוי גרעיני קרדיומיוציט עלולים להוביל לתוצאות חיוביות שגויות. לכן, זה קריטי לזהות באופן אמין גרעיני cardiomyocyte, אשר הוכיח קשה ולא אמין מסעיפים היסטולוגיים9. זיהוי של cardiomyocytes הוא הרבה יותר מדויק מתאי יחיד מאשר מקטעי רקמות כפי שזה עשוי להיות קשה להבחין cardiomyocytes מסוגי תאים אחרים גם בעת שימוש סמנים כגון α-actinin, למרות PCM1 עשוי להיות סמן אמין של גרעיני cardiomyocyte בסעיפים היסטולוגיים10.
הפרוטוקולים הנוכחיים מסתמכים על בידוד cardiomyocytes חיים לפני קיבעון, אשר ידוע לגרום למוות של לפחות 30% cardiomyocytes, עלול להוביל לבחירה בשוגג של אוכלוסיות ספציפיות של cardiomyocytes11. יתר על כן, פרוטוקולים אלה ידועים לשמצה קשה לייעל כדי לספק תוצאות לשחזור. אפילו טכניקות בידוד ממוטבות יכולות בדרך כלל לייצר לא יותר מ-65% חיים, קרדיומיוציטים בצורת מוט עם תשואותשונות 12.
כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו פרוטוקול המאפשר לחוקרים לבודד קרדיומיוקיטים קבועים. מכיוון שהדגימות קבועות לפני הבידוד, התפוקה מוגדלת, ומורפולוגיה vivo נשמרת היטב. יתר על כן, עם פרוטוקול זה ניתן לבודד cardiomyocytes מדגימות קליניות, אשר בדרך כלל קבועים מיד לאחר הרכש. יתר על כן, כדי לזהות cardiomyocytes שנוצר לאחרונה, חשוב למדוד את הגרעין ואת מצב תחבולה של cardiomyocytes בודדים, מאז רק קרדיומיוציטים דיפלואיד הם הניחו בדרך כלל נוצר לאחרונה. ציתום זרימה אינו יכול להבחין רב-תזונה מפוליפלואידית והוא פרוטוקול זמן ומשאבים עתירי יחסית. חלוקה ידנית ומדידה של גרעין בתוך תמונות היא בעלת תפוקה נמוכה מאוד ונוטה להטיה אנושית. כימות אוטומטי של תמונות של קרדיומיוציטים מוכתמים DAPI קבוע, מבודד פותר את שתי הבעיות האלה. ניתן להשיג קביעת גרעין מבוססת הדמיה והפצות תחבולה עם מינימום זמן ריגנטים המשתמשים בציוד בסיסי.

<table><tbody><tr><td>צלחת 96 בארות להדמיה</td><td>קורנינג</td><td>3340</td><td>אנו משתמשים בצלחות אלה מכיוון שהן מתאימות להדמיה, אם כי לוחות תחתונים מזכוכית יהיו טובים יותר להדמיה קונפוקלית</td></tr><tr><td>אלפא אקטינין</td><td>נובוס ביולוגי</td><td>NBP1-32462</td><td>נוגדן זה משמש כסמן של קרדיומיוציטים סרקומרים</td></tr><tr><td>מספריים קהים</td><td>כלי מספריים עדינים</td><td>14072-10</td><td>אנו מעדיפים מספריים קהים מכיוון שהאפשרות לקרוע רקמת לב נמוכה יותר בעת חשיפת הלב</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>664</td><td>משמש להדמיה, הערכת פלואידיה ונוקלציה באוכלוסיית קרדיומיוציטים</td></tr><tr><td>CD-1 עכברי נהר</td><td>צ'ארלס</td><td>22</td><td>משמש להדמיה, הערכת פלואידיה ונוקלציה באוכלוסיית קרדיומיוציטים</td></tr><tr><td>קולגנאז 2</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS004177</td><td>לצורך פרוטוקול זה, ההבדלים בין אצווה לאצווה הם מינימליים ואינם משפיעים על התפוקה הכוללת ואיכות הבידוד</td></tr><tr><td>נחושת (II) סולפט פנטהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>203165-10G</td><td>לצביעה אדולוגית</td></tr><tr><td>Cy5 Picolyl Azide</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1177-25</td><td>אזיד המשמש לצביעה אדולוגית</td></tr><tr><td>Cytation3</td><td>BioTek</td> <td>-</td> <td>משמש להדמיה אוטומטית לניתוח DNA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>DAPI משמש לצביעת DNA. המלאים הומסו במים מזוקקים.</td></tr><tr><td>חמור נגד עכבר IgG-Alexa568</td><td>Life Technologies</td><td>A10037</td><td>נוגדן משני המשמש לזיהוי צביעת אלפא אקטינין בתוך קרדיומיוציטים</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5137</td><td>אנו משתמשים במלקחיים המעוקלים והקהים הללו, אם כי ניתן להשתמש גם במלקחיים ישרים</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A144212</td><td>כדי להגדיר את ה-pH של מאגר Tris-HCl ל-pH 8.5</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td><a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads">imagej.net/Fiji/Downloads</a></td><td>-</td><td>משמש לניתוח תמונות</td></tr><tr><td>חומצה L-אסקורבית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255564-100G</td><td>לצביעה אדולוגית</td></tr><tr><td>מחט לעירוי</td><td>TERUMO</td><td>SV*23BLK</td><td>אנו משתמשים בערכות עירוי מכונפות לאורך כל הפרוטוקול מכיוון שקל לתפעל את מיקום המחט עם סטים אלה במהלך ההזרקה</td></tr><tr><td>Nikon A1R HD25</td><td>ניקון</td><td></td> <td>- משמש לצילום תמונות קונפוקליות של מכתים אלפא אקטינין</td></tr><tr><td>רשת ניילון 200 מיקרון</td><td>סינון אלקו</td><td>03-200/54</td><td>רשת המשמשת לסינון קרדיומיוציטים רגילים (לא היפרטרופיים)</td></tr> <tr><td>רשת ניילון 400 מיקרון</td><td>סינון אלקו</td><td>06-400/38</td><td>רשת המשמשת לסינון קרדיומיוציטים מבוגרים היפרטרופיים</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (1X)</td> <td>קורנינג</td><td>21-040-CV</td><td>ניתן להכין זאת גם במעבדה. למרות שסטריליות חשובה בניסוי זה, אנו חושבים שמספיק להכין PBS ולסנן אותו</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי, Granular</td><td>Mallinckrodt</td><td>6858</td><td>אשלגן כלורי גרגירי הועדף על ידינו מכיוון שהוא יוצר פחות אגרגטים כאשר הוא מאוחסן בטמפרטורת החדר</td></tr><tr><td>R</td><td><a href="http://www.r-project.org/">r-project.org</a></td><td>-</td><td>משמש לניתוח נתונים של המדידות המתקבלות מתמונות</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>משמש לחצץ תגובת צביעה של EdU</td></tr></tbody></table>

בידוד של קרדיומיוציטים מלבבות קבועים עבור אימונוציטוכימיה וניתוח פלוידי

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

הלב היונק הבוגר מורכב מסוגי תאים שונים, כולל קרדיומיוציטים, תאי אנדותל ופיברובלסטים. מאז קשה לזהות באופן אמין גרעין של cardiomyocytes על חלקים היסטולוגיים, קבוצות רבות מסתמכות על בידוד cardiomyocytes קיימא לפני קיבעון לבצע immunostaining. עם זאת, אלה טכניקות בידוד cardiomyocyte חי דורשים אופטימיזציה כדי למקסם את התשואה, הכדאיות והאיכות של הדגימות, עם תנודות הטבועות מדגימה כדי לדגום למרות אופטימיזציה מקסימלית. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול לשחזור, המערב קיבעון לפני עיכול אנזימטי של הלב, אשר מוביל לתשואה מקסימלית תוך שמירה על מורפולוגיה vivo של cardiomyocytes בודדים. פיתחנו גם פלטפורמת ניתוח אוטומטית כדי לקבוע את מספר גרעין ותכני DNA לכל גרעין עבור cardiomyocytes בודדים. לאחר שחשף את חלל החזה, הלב נעצר בדיאסטול על ידי עירוי עם 60 mM KCl ב PBS. לאחר מכן, הלב תוקן בתמיסת paraformaldehyde (PFA), ולאחר מכן עיכל עם 60 תמיסת קולגנאז מ"ג/מ"ל. לאחר העיכול, התאים היו ייחודיים על ידי trituration, שבר cardiomyocyte הועשר באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. cardiomyocytes מבודדים היו מוכתמות עבור Troponin T α-actinin כדי להעריך את טוהר האוכלוסייה שהושגה. יתר על כן, פיתחנו פלטפורמת ניתוח תמונה כדי לקבוע גרעין cardiomyocyte ומצב ploidy בעקבות כתמי DAPI. הערכות פלואידיות מבוססות תמונה הובילו לתוצאות עקביות ותו לא. לכן, עם פרוטוקול זה, ניתן לשמר מורפולוגיה מקורית של cardiomyocytes בודדים כדי לאפשר אימונוציטוכימיה וניתוח תוכן DNA תוך השגת תשואה מקסימלית.

קרדיומיוציטים היו מבודדים על פי הפרוטוקול המתואר לעיל. באמצעות שיטה זו, אנו בדרך כלל מקבלים cardiomyocytes ייחודי באופן אחיד כי הם טהורים יחסית מבלי לזהם תאים שאינם cardiomyocyte(איור 1א). Cardiomyocytes מזוהים בקלות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר בשל גודלם האופייני וbirefringence שלהם. טכניקה זו קלה ליישום ומספקת תוצאות עקביות מבידודים שונים עם תפוקות קרדיומיוציט דומות ואיכות(איור 1ב'). cardiomyocytes מבודד ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר שבועות לפני שימוש נוסף.
Cardiomyocytes שהיו מבודדים על פי הפרוטוקול לעיל יכול לשמש עבור יישומים שונים במורד הזרם, כגון מדידת גודל cardiomyocyte, פלואיד cardiomyocyte ו immunocytochemistry. כתוצאה מייצגת, אנו מראים כי cardiomyocytes מבודד על פי פרוטוקול זה יכול להיות מוכתם באמצעות נוגדנים וazides פלואורוכרום-התואם עבור כימיה לחץ כדי לזהות התאמה לשפות אחרות של חלבונים ספציפיים או כדי לזהות שכפול DNA cardiomyocyte, בהתאמה. לדוגמה, הכתמת cardiomyocytes עם נוגדנים α-actin כדי להראות את דפוס הכתמים Z-line אופייני של סרקומרים(איור 2A). בניסוי נפרד, נתנו את התימידין אנלוגי 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) לעכברים לפני בידוד cardiomyocytes קבוע. לאחר בידוד cardiomyocyte, הכתמת עבור EdU משולב באמצעות פרוטוקוליםסטנדרטיים 13, והצליחנו לזהות cardiomyocytes שעברו שלב S או קרדיומיוציטים חד נונוקלציה, binucleated ו trinucleated(איור 2B).
כדי להרחיב עוד יותר את השירות של שיטת הבידוד, פיתחנו צינור המאפשר כימות של תחבולה קרדיומיוציט המבוססת על כתמי DNA משולבים. כדי להיות מסוגל למדוד מצב תכסיס של תאים או גרעינים, היינו צריכים לפלח גרעין ו cardiomyocytes. איור 3 מציג ייצוג של האסטרטגיה בה השתמשנו לזיהוי גרעין בודד. ראשית, התמונה המקורית DNA מוכתמתבתמונה (איור 3A)היא סף בהתבסס על עוצמה (איור 3B). כאן, השתמשנו DAPI להכתים ל-DNA, אבל כל צבע גרעיני אחר שמראה מתאם ליניארי עם תוכן DNA יעבוד. התוכנית מאפשרת כל אחת משיטות סף האינטנסיביות של פיג'י להיבחר, אבל בדוגמה זו השיטה של Otsu היה בשימוש. מסיכות גרעיניות הנוגעות לקצה התמונה או קטנות יותר מסף אזור הפיקסל המינימלי שצוין אינן נכללות. לאחר מכן, אליפסות מתאימות למסכות הגרעיניות, פילוח גרעינים בודדים. איור 3C מציג אליפסות אלה המקוונות בתמונה המקורית. לאחר מכן, חורים מתמלאים במסכות, והפיקסלים של התמונה מחולקים לאחר מכן לאזורים המבוססים על איזו אליפסה הם פרוקסימליים ביותר (איור 3D). גבולות שטחים אלה משמשים לאחר מכן כדי לצייר קווים דרך אשכולות גרעיניים, סיום תהליך פילוח גרעיני (איור 3E).
השלב הבא כרוך בזיהוי של קרדיומיוציטים. עבור תמונות cardiomyocyte המתקבלות על בסיס תאים מוכתמיםפלורסנט (איור 4A),התהליך דומה מאוד לזה עבור גרעין. התמונה מוגדרת בסף בהתבסס על ערך עוצמה המחושב על-ידי שיטת הסף שנבחרה, במקרה זה שיטת המשולש. מסכות קרדיומיוציט מזוהות הנוגעות בגבול התמונה או נמצאות מתחת לגודל מסוים אינן נכללות וחורים מתמלאים במסכות כדי לספק קרדיומיוציטים מחולקים כראוי(איור 4ב'). בגלל cardiomyocytes יש צורה לא סדירה יותר מאשר גרעינים, אין ניסיון לקטלוח אשכולות cardiomyocyte. במקום זאת, אשכולות אלה אינם נכללים בהתבסס על הקוטר המינימלי הגבוה של Feret במהלך שלב הניתוח. פילוח מתמונות שדה בהירות ממשיך מעט שונה. ראשית, תמונת השדה הבהירההמקורית (איור 4C)מעובדת עם מסנן קצה סובל. מסנן זה מחשב את הערך המוחלט של מעבר הצבע של כל פיקסל בתוך התמונה. פיקסלים באזורים עם שינויים מהירים מקבלים ערכים גבוהים ופיקסלים באזורים חלקים של התמונה מקבלים ערכים נמוכים. תמונה מסוננת קצה זו היא לאחר מכן סף על ידי עוצמה, באמצעות שיטת המשולש, וכתוצאה מכך cardiomyocytes רעולי פנים (איור 4D). מסכות לא סדירות אלה מחליקות וקושרות זו לזו באמצעות סגירה מורפולוגית באמצעות עיגול ברדיוס של 2 פיקסלים, הממלא את כל האזורים הלבנים בתמונה שבה העיגול אינו יכול להתאים מבלי לחפוף אזור שחור(איור 4E). לבסוף, חורים במסכות מתמלאים, אזורים הנוגעים בגבול אינם נכללים, וחלקיקים קטנים מוסרים, ומסיימים את תהליך פילוח cardiomyocyte (איור 4F).
באמצעות אסטרטגיית פילוח המתוארת, אנו יכולים לקבוע את מצב הגרעין של cardiomyocytes בודדים. בגישה זו, קבענו את מצב הגרעין של קרדיומיוציטים מבודדים מלבבות של עכברי CD-1 גזעיים בנקודות זמן מוקדמות לאחר הלידה. לבבות של עכברים שזה עתה נולדו (היום הראשון של החיים) הראו כי רוב cardiomyocytes בשלב זה הם mononucleated(איור 5:יילודים). תדירות גבוהה זו של קרדיומיוציטים חד-נו-קוטיים נמוכה בהרבה בעכברים צעירים (בני שבועיים), שם קרדיומיוציטים חד-נוגרפיים הם כ-25% מכלל אוכלוסיית הקרדיומיוציטים(איור 5:ילדותי). לבסוף, אנחנו יכולים למדוד את המצב תכסיס של גרעין בודד בתוך cardiomyocytes, ולקבוע אם הם דיפלואיד או tetraploid. תוצאות אלה מראות תדירות גבוהה יותר של גרעין טטרפלואיד בעכברים מתבגרים (איור 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig1.jpg"> איור 1: יעילות בידוד קרדיומיוציט לאחר קיבעון. (א)תמונה מייצגת של קרדיומיוציטים מבודדים מוכתמים DAPI כדי להראות גרעין. (DAPI (כחול), ברייטפילד (אפור)) (ב)תשואה של קרדיומיוציטים מבודד מעכברים שונים בגיל 3 חודשים. קנה מידה של פסים = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig2.jpg"> איור 2: אימונוציטוכימיה של קרדיומיוציטים מבודדים. (א)תמונה מייצגת של קרדיומיוציטים מוכתמים α-אקדמין (α-אקדמין (אדום) ו-DAPI (כחול)). (ב)Cardiomyocytes מוכתם עבור EdU משולב (אדום) ו DAPI (כחול). קרדיומיוציטים מייצגים כי הם mononucleated (שמאל), binucleated (באמצע) ו trinucleated (מימין) ו EdU חיובי מוצגים. קנה מידה של פסים = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig3.jpg"> איור 3: אסטרטגיה לפילוח גרעיני. (A)תמונת ערוץ DAPI מקורית. (ב)תמונה מסוומת (בדוגמה זו, נעשה שימוש בשיטה של Otsu). (ג)מסכות שזוהו מהתמונות המסונות על התמונה המוכתמת המקורית של DAPI. (ד)תסה וורונוי המבוססת על מסכות גרעיניות. (ה)גרעין מפולח סופי, עם אשכולות מפוצלים מסומנים. קנה מידה ברים = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig4.jpg"> איור 4: אסטרטגיה לפילוח קרדיומיוציט. (א)טרופונין פלורסנט מקורי אני הכתים את תמונת cardiomyocyte. (ב)תמונה בעלת סף משולש, לאחר מילוי חורים ולא כולל חפצים קטנים ואלה שנוגעים בגבול. (ג)תמונה קרדיומיוקייט שדה בהיר מקורי(D)קצה מסונן ומצורה סף cardiomyocyte תמונה(E)קצה מסוננים תמונה לאחר סגירה מורפולוגית עם רדיוס של שני פיקסלים (F) אותה תמונה לאחר מילוי חורים ולא כולל אובייקטים קטנים ואלה נוגעים בגבול. קנה מידה ברים = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig5.jpg"> איור 5: סיווג קרדיומיוציטים בהתבסס על מספר הגרעינים. לבבות יילודים (בן יום אחד) מכילים יותר קרדיומיוציטים חד-נוגרפיים מאשר לבבות צעירים (בני 14 ימים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig6.jpg"> איור 6: הפצת תכולת דנ"א קרדיומיוציט לכל גרעין. בנילודים (משמאל), 13.5% מגרעין CM חד-גרעיני הם טטרפלואידים ו-11.9% מגרעין CM בינוקלי הם טטרפלואידים. בקטינים (מימין), 33.9% מגרעין CM חד-גרעיני הם טטרפלואידים ו-31.2% מגרעין CM בינוקלי הם טטרפלואידים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig6large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
קובץ משלים 1: צילומי מסך של תוכנה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/SoftwareScreenshots.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).</a>
קובץ משלים 2: AnalyzeNucleation.py. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/AnalyzeNucleation.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).</a>
קובץ משלים 3: ניתוחמוטרוינטיתסר.ר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/AnalyzeMultinucleatedServer.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).</a>

מטרת עבודה זו היא לפתח שיטה לבודד באופן רקרדיומיוקיטים מהלב הבוגר ים למדוד תוכן DNA וגרעין.

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

פרוטוקול זה מספק שיטה לבודד קרדיומיוציטים בצורת מוט מכל רקמת לב, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי למדוד תכסיסים וגרעין מצב של cardiomyocytes אלה ללא ניתוח ידני. בהשוואה לטכניקות אחרות, הפרוטוקול שלנו מספק תפוקות תאים ומורפולוגיה של תאים עקביים יותר, ונגד ציטומטריית זרימה, אנו מסוגלים לאמת חזותית את מצב הגרעין והתכסיסים של קרדיומיוציטים. ההדגמה החזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שקל יותר להעריך את חלוקת רקמת הלב וההתאגדות.התחל על ידי הצבת העכבר המתת חום עלות, והדבקת הגפיים המורחבות. השתמש במספריים קהים כדי לחתוך דרך החזה כדי לחשוף את הלב. ואז לחתוך את בית ההיתוך יורד ו vena קאווה נחות.השתמש במשאבה פריסטולית המחוברת ערכת עירוי עם מחט פרפר 23 מד כדי לבלבל את הלב על ידי הזרקת שלושה מיליליטר של אשלגן כלורי PBS פתרון דרך החדר השמאלי. הקפד לא לנקב דרך מחיצה. ואז להזריק 10 מיליליטר של 4% פתרון PFA במשך 10 דקות בקצב של מיליליטר אחד לדקה.השתמש במספריים כדי להסיר את כל הלב. ואם תרצה, לבודד אזור מסוים. מניחים את הרקמה בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של 4%PFA פתרון.דגירה זה על נדנדה במשך שעה אחת. מניחים את הלב בצלחת פטרי עם פתרון PBS. לסחוט אותו כדי להיפטר כל PFA שנותר בחדרים ולשטוף אותו PBS.שים את הלב הקבוע לתוך צינור חדש 1.5 מיליליטר המכיל פתרון קולגן. ואז להדרגר את הלב על נדנדה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשים את הלב בצלחת פטרי 35 מילימטר המכיל תווי קולגן, ולנתק אותו לחתיכות מילימטר אחד עם מטח או מספריים.לאחר מכן השתמש פיפטה העברה כדי עוד יותר triturate הרקמה ניתוק במשך שתי דקות. אם חלקיקי רקמה עדיין נשארים, השתמש פיפטה עם קצה צר יותר ולהמשיך trituration עד שרוב הרקמה מתפרקת. מניחים רשת ניילון 200 עד 600 מיקרומטר מעל צינור צנטריפוגה 15 מילימטר.הוסף חמישה מיליליטר של PBS לתאים המנותקים וסנן אותם דרך רשת הניילון. לשטוף את רשת ניילון על ידי העברת ארבעה מיליליטר נוספים של PBS. ואז צנטריפוגה הפתרון מסונן ב 10 עד 100 פעמים G לדקה אחת.להשליך את supernatant ולתלות מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של PBS לפני הכתמים. לאחר הורדת הפצת פיג'י של תמונה J, פתח את פיג'י ולחץ על עזרה, עדכון וניהול אתרי עדכון. בדוק את הקבוצה ביומד ותוספי IFPB.כדי להוריד את התוספים יחסי תלות, אליפסה לפצל מורפו ליב J.Then לחץ על סגור ולהחיל שינויים. לאחר מכן, להוריד RStudio ולפתוח אותו. העתק את הקוד מתוך כתב היד של הטקסט לתוך שורת הפקודה של RConsole והקש enter.לאחר מכן הקלד Y בתגובה לכל ההנחיות להתקין את כל יחסי התלות שלנו. כדי לבצע כימות תמונה, פתח את פיג'י וגרור ניתוח. py לתוך שורת המצב.כאשר חלון עריכת ה- Script נפתח, לחץ על הפעל בפינה הימנית התחתונה. תצוץ תיבת דו-שיח המבקשת את המיקום של ספריית נתוני הפלט. בחר את התיקיה שבה יאוחסנו כל נתוני הניתוח, הנתונים ונתונים אחרים המשמשים את התוכנה.בפרמטרי הניתוח, בחר את מיקום התמונות שיש לנתח והזן את תבנית שם קובץ התמונה באמצעות ביטויים רגילים. לאחר בחירת ההגדרות הרצויות, לחצו על הלחצן 'אשר'. כאשר תמונות מהשלבים השונים של צינור הניתוח מופיעות על המסך, בדוק אותן כדי לוודא שהסף והפילוח מתרחשים כראוי. פתח שרת ניתוח.r ברסטודיו. לאחר מכן, לשם התיקיה בעל שם המשתנה, הקלד את נתיב הקובץ לתיקיית נתוני הפלט שנבחרה בשלב האחרון ללא קו הנטוי הסופי. לחץ על הפעל אפליקציה בפינה הימנית העליונה של חלון עריכת קובץ ה- Script.השתמשו במ המחוונים כדי לקבוע סף לסף העוצמה המינימלי החוקי של הממוצע הגרעיני, לסף השטח הגרעיני החוקי המינימלי ולקוטר החמוסים המינימלי החוקי המרבי לקרדיומיוציטים. גלול מטה ולחץ על החל סף נבחר ולאחר מכן לחץ על התפלגות עוצמת התוויה, שתהפוך חלקה מהתפלגות עוצמת הגרעין של המדגם כולו וכן תת-פלוט נפרד עבור כל משתנה קיבוץ. כדי להסביר וריאציה תוך-סומסמית, גלול מטה ובדוק נורמליזציה בנפרד לפי קבוצה ולאחר מכן לחץ על חשב תכסיס והתוויה של התפלגות תכסיסים משוערת.לאחר שגרף הדגימה כולו מנורמל מופיע, שתי תבניות השיא צריכות להיות גלויות. השתמש במחוונים ובחר סף כדי לבודד את פסגות diploid ו tetraploid אחד מהשני חריגים. לאחר מכן גלול מטה ולחץ על חשב תכסיס וגרעין.לבסוף, לחץ על התוויית הלחצן ושמור בתיקיה תוצאות. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבודד cardiomyocytes ייחודי באופן אחיד כי הם טהורים יחסית ללא תאים מזהמים. זה קל ליישם ומספק תשואות cardiomyocyte עקבי ואיכות מבידודים שונים.קרדיומיוציטים מבודדים עם פרוטוקול זה יכול להיות מוכתם באמצעות נוגדנים ו azides פלואורוכרום נדוש. כדי להראות את תבנית הכתמת קו Z האופיינית של סרקומרים, התאים היו מוכתמים בנוגדנים המכירים באלפא אקטין. בניסוי נפרד, EdU ניתנה לעכברים לפני בידוד קרדיומיוציטים קבועים.לאחר הבידוד, זוהו הקרדיומיוציטים המונו-מונוקלציה, הנוקלציה והטרינוקלציה שעברו שלב S. כדי לזהות גרעינים בודדים, התמונה המוכתמת בדנ"א המקורית הייתה סף על סמך עוצמה. אליפסות היו מתאימות למסכות הגרעיניות, פילוח גרעינים בודדים.לאחר מכן, הפיקסלים של התמונה מחולקים לשטחים המבוססים על האליפסה שאליה הם קרובים ביותר, וגבולות שטחים אלה שימשו לציור קווים באמצעות אשכולות גרעיניים. תהליך פילוח דומה שימש לגילוי קרדיומיוציטים. אסטרטגיית פילוח זו הראתה כי רוב הקרדיומיוציטים מעכברים שזה עתה נולדו הם מונונוקלציה.התדירות של קרדיומיוציטים מונונוקלציה נמוכה בהרבה בעכברים בני שבועיים, שם הם חלקם כ -25% מכלל אוכלוסיית הקרדיומיוציטים. כאשר נמדד מצב התכסיסים של גרעינים בודדים בתוך קרדיומיוציטים, זוהתה תדירות גבוהה יותר של גרעיני טטרפלואידים בעכברים צעירים. בעת בידוד קרדיומיוציטים, חשוב לוודא שכל גושי התאים התפרקו מהטריטורציה שלהם.

isolation-cardiomyocytes-from-fixed-hearts-for-immunocytochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Myocytes לב למבוגרים הם תאים ראשוניים, כי יכול להיות מבודד לבבות בעלי חיים מתורבתים במשך כמה ימים. במהלך תקופה זו תרבות העברת גנים adenoviral ניתן להשתמש בהם כדי להביע biosensors מקודדים גנטית (GEBs) או חלבונים היתוך ניאון. שתי הגישות לאפשר חקירות הסלולר באמצעות מיקרוסקופיה confocal.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

גרעינים לב מבודדים באמצעות שקיעה צפיפות immunolabeled עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) כדי לזהות ולמיין גרעינים cardiomyocyte ידי cytometry הזרימה.

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

כימות תחלופת הקרדיומיוציטים הוא מאתגר. הפרוטוקול המתואר כאן תורם תרומה חשובה לאתגר זה בכך שהוא מאפשר כימות מדויק ורגיש של יצירת גרעיני ניאו-קרדיומיוציטים וגרעיני פלואידיה.

הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

כדי להבחין בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא בקרדיומיוציטים, אנו מציגים פרוטוקולים המשתמשים בשני קווי עכברים טרנסגניים: עכברים טרנסגניים Myh6-H2B-mCh, לזיהוי חד משמעי של גרעיני קרדיומיוציטים, ועכברי CAG-eGFP-אנילין, להבחנה בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא.

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

כמה פרוטוקולים פותחו ותיארו לבידוד של סוגי תאים לב שונים של הלב חולדה. כאן, פרוטוקול אופטימיזציה מתואר המאפשר בידוד של איכות גבוהה תאים מרכזיים של תאים לב (cardiomyocytes, תאים אנדותל, fibroblasts) מתוך הכנה אחת, הפחתת עלויות הניסוי.

בידוד סימולטני של Cardiomyocytes באיכות גבוהה, תאים אנדותל, ו Fibroblasts של לב עכברוש מבוגר

מוצג הוא פרוטוקול לבידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים ובעלי חיים מפרוסות שריר הלב לחתוך vibratome. תפוקות גבוהות של תאים סובלניים סידן (עד 200 תאים / מ"ג) ניתן להשיג כמויות קטנות של רקמה (&lt;50 מ"ג). הפרוטוקול ישים על שריר הלב החשוף לאישמיה קרה עד 36 שעות.

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

למד שיטה לבידוד קרדיומיוציטים מלבבות קבועים לניתוח פלוידי ואימונוציטוכימיה. הפרוטוקול מספק תפוקת תאים עקבית ומאפשר אימות ויזואלי של מצב הגרעינים והפלוידיות.

בידוד של קרדיומיוציטים מלבבות קבועים עבור אימונוציטוכימיה וניתוח פלוידי

גלה סרטונים נוספים