פלטפורמת מיקרוסקופי מרובה-פוטונים מותאמת אישית להדמיה חיה של קרנית עכבר ולחמית
May 17th, 2020
מוצג כאן היא פלטפורמה מיקרוסקופית multiphoton עבור הדמיית פני השטח עינית עכבר חי. עכבר טרנסגני פלורסנט מאפשר הדמיה של גרעין התא, קרום התא, סיבי עצב ונימים בתוך פני השטח עינית. אותות לא ליניאריים של הדור ההרמוני השני הנגזרים ממבנים קולגניים מספקים הדמיה ללא תוויות עבור ארכיטקטורות סטרומה.
פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ מרובה מסננים להדמיה חיה של כל המבנה של משטח העין של העכבר במודל העכבר ההידור הפלואורסצנטי הכפול. השילוב של פלטפורמה מיקרוסקופית רב-פוטון מותאמת אישית ועכברים פלואורסצנטיים כפולים מאפשר הדמיה בזמן אמת של המבנה והמבנה של פני השטח העין. כדי להקים את מיקרוסקופ מולטיפוטונים, בחר את טבילת המים 20X, 1.00 NA המטרה ולהגדיר את לייזר ספיר טיטניום כמקור עירור על מיקרוסקופ זקוף.
הגדר את אורך הגל של פלט הלייזר ל- 880 ננומטר עבור EGFP ו- 940 ננומטר עבור tdTomato. כלול שתי מראות דיכרואיות להפרדת SHG EGFP ו- EGFP tdTomato ולהשתמש 434-17, 510-84 ו 585-40 ננומטר הלהקה לעבור מסננים כדי להפריד ספקטרלית את האותות SHG EGFP ו tdTomato. כדי להגדיר את מחזיק העין, לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה בעכבר הרדמה 8-12 שבוע, למקם את העכבר על שלב מיקרוסקופ מחומם ולהכניס בדיקה ניטור טמפרטורה.
מניחים את העכבר במחזיק עכבר סטריאטוקסי מותאם אישית ומכניסים את פסי האוזן לתוך הבשר השמיעתי החיצוני. השתמש קיבעון שלוש נקודות כדי לאבטח את מחזיק הראש ולהחיל 0.4% Oxybuprocaine הידרוכלוריד ותמיסת מלח על פני השטח העין. כסו את קצות זוג מדפים דומונט מספר חמש עם לולאת צינור PE.
לאחר שלוש דקות לבצע נסיגה עפעף ידני כדי לאשר את הבלט גלגל העין בזהירות למקם לולאת צינור מחזיק PE לאורך שולי העפעף כדי לחשוף את פני השטח העין. ולהשתמש בכוח של המחזיק כדי לייצב את גלגל העין עם המדפים. לאחר מכן, מכסים את משטח הקרנית עם ג'ל עיניים עם אינדקס שבירה של 1.338.
עבור הדמיה סדרתית Z של פני הקרנית, השתמש במקור אור כספית כדי לדמיין את שדה המטרה ולפתוח את תוכנת המיקרוסקופ. בחר את מכפיל התמונות והרווחים הדיגיטליים המתאימים להמחשת המבנה התאי במשטח העין והגדר את השקופית הראשונה והאחרונה כדי לאפשר רכישה של מחסנית תמונות. הגדר את רזולוציית התמונה ל- 512 על 512 פיקסלים ואת שלב Z למיקרומטר אחד.
לאחר מכן, לחץ על התחל לאסוף תמונות טוריות Z רכישת תמונה חיה אחת עם 880 nanometer העירור עבור SHG EGFP אוסף אותות, ותמונה חיה אחת ב 940 nanometer העירור עבור אוסף אותות tdTomato EGFP בתוך כל אזור. לאורך התמונה, השתמש במחזיק הבמה ממונע צעד כדי לסובב את גלגל העין כדי לאפשר הדמיה על פני הקרנית כולה. לאחר שכל התמונות נרכשו, טען את התמונות הטוריות Z לתוך פיג'י ובחר את תוסף המסנן חציוני תלת-מימדי.
לאחר הסרת רעשי הרקע, בחרו בחבילת המסנן 'הסרת חידוד מסיכה' פיג'י כדי לחדד את התמונות ולחצו על ניגודיות הבהירות האוטומטית כדי למטב אוטומטית את איכות התמונות. לאחר העיבוד, שמרו את התמונות כרצף תמונות טורי וייצאו את רצף התמונה לתוכנה מתאימה לשחזור תלת-מימדי. בכל התמונות מיקרוסקופיה multiphoton, להציג את אותות tdTomato ו SHG EGFP ב פסאודו ירוק, אדום, ציאן בהתאמה לפני לכידת תמונות מבנה 3D על ידי תצלום בזק.
מיקרוסקופיה מרובת פוטון מאפשרת הדמיה של תאי כנף ובזל שטחיים באפיתל הקרנית של עכברים מהונפים פלואורסצנטיים כפולים. תאים בודדים מהשכבה הבסיסית ניתן למפות לשכבה השטחית, כמו גם תאים שטחיים בצורת משושה יחיד. כפי שנחשף על ידי הביטוי הציטופלסמי של אות tdTomato, חלבון הממברנה עשיר במערכת כלי רכב תאיים עשירה, כולל מנגנון הגולגי והריתוק האנדופלסמי מפוזרים בתוך תאי הכנף.
בתוך סטרומה קולגן, קורטזיטים בצורת סטלטה מתוארים על ידי קרום מיקוד פלואורסצנטים EGFP בעכברים אלה. הקורטזיטים המוטמעים בסטרומה המכללה הם במים רופפים יותר מאשר בתוך תאי ה אנדותל. בנוסף, עצבי הסתעפות דקים בתוך סטרומה הקרנית ניתן גם לדמיין על ידי קרום מיקוד אותות tdTomato ו monolayers תא אנדותל הקרנית להפגין צורה משושה הומוגנית יחסית מחובר בתבנית חלת דבש.
האפיתל הלימבי מורכב משכבה אחת עד שתי שכבות של תאי אפיתל. הזן הפלורסנטי הכפול מאפשר גם הדמיה של נימים בתוך הלחמית, ומאפשר שחזור של הארכיטקטורה תלת מימדית של נימים המתארים את אנדותל כלי הדם. ייצוב גלגל העין עם לחץ מתון ללא פציעה הוא קריטי לרכישת תמונות באיכות טובה כמו לחץ לא מספיק או מוגזם יכול לסכן את איכות התמונה.
זה פלטפורמת הדמיה תמונה NVivo ניתן לשנות עבור הדמיה של מבנים מתחת לפני השטח העין והוא יכול להיות מיושם על מחקרים in-situ של מחלות עיניים שונות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מציג פלטפורמת מיקרוסקופיה רב-פוטונית להדמיה חיה של משטח העין של העכבר באמצעות מודל עכבר טרנסגני דו-פלואורסצנטי כפול. המערכת מאפשרת הדמיה בזמן אמת של מבנים תאיים שונים בתוך משטח העין.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- אופתלמולוגיה
- מיקרוסקופיה
רקע
- מיקרוסקופיה רב-פוטונית היא טכניקת הדמיה חזקה.
- עכברים טרנסגניים פלואורסצנטיים מספקים הדמיה משופרת של מרכיבי התא.
- הבנת מבנה משטח העין היא חיונית ליישומים מחקריים שונים.
- טכניקות הדמיה ללא תוויות יכולות להשלים שיטות פלואורסצנטיות.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה להדמיה חיה של משטח העין של העכבר.
- לנצל מיקרוסקופ רב-פוטוני מותאם אישית להדמיה משופרת.
- להדגים את יכולותיהם של עכברים טרנסגניים דו-פלואורסצנטיים בהדמיה.
שיטות ששימשו
- הגדרת מיקרוסקופ רב-פוטוני עם עדשות והגדרות לייזר ספציפיות.
- שימוש במראות דו-כרומטיות ומסנני פס רצועה להפרדת אותות.
- הדמיה חיה של עכברים מורדמים על במת מיקרוסקופ מחוממת.
- הדמיה בזמן אמת של מבני משטח העין.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של גרעיני תאים, ממברנות וסיבי עצב.
- הדמיה ללא תוויות של ארכיטקטורות סטרומה באמצעות יצירת הרמוניה שנייה.
- הדגמה של יעילותה של פלטפורמת הרב-פוטונים.
- אומתו יכולות ההדמיה בזמן אמת.
מסקנות
- הפלטפורמה המיקרוסקופית הרב-פוטונית יעילה להדמיות עיניים.
- עכברים טרנסגניים דו-פלואורסצנטיים משפרים את ההדמיה של מבני העין.
- שיטה זו יכולה לקדם מחקר בביולוגיה של העיניים ובתחומים קשורים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This multiphoton microscopy platform enables live, label-free imaging of mouse ocular surface structures, providing critical insights into corneal and conjunctival biology for ophthalmic drug discovery. By visualizing cellular dynamics, stromal architecture, and vascular networks in vivo, the method supports mechanistic de-risking of therapeutic targets in preclinical models of ocular disease. The platform’s ability to image across the entire ocular surface with accurate positioning enhances predictive confidence in target validation and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing cell nuclei, membranes, nerve fibers, and capillaries in live ocular tissue.
- Operational Value: Supports functional target validation through real-time observation of stromal architecture via second harmonic generation and cellular dynamics in dual fluorescent reporters.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts of structural and cellular changes in disease-relevant ocular models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling high-resolution imaging of epithelial, stromal, endothelial, and vascular compartments.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through precise Z-stack acquisition, spectral separation of SHG and fluorescent signals, and stabilized eyeball positioning.
- Strategic Value: Highlights screening readiness and platform reuse by allowing imaging across the entire corneal and conjunctival surface with minimal phototoxicity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by enabling reconstruction of 3D capillary architecture in the conjunctiva and visualization of limbal epithelial layers.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by supporting intravital imaging with accurate positioning across ocular surface regions.
- Predictive Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by providing label-free stromal imaging and cellular mapping that inform mechanistic understanding of ocular pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical imaging, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in ophthalmic research.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking by enabling live imaging of cellular and structural dynamics in the ocular surface.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through Z-serial imaging, spectral signal separation, and stabilized imaging conditions.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including SHG for collagen architecture and tdTomato/EGFP for membrane and nuclear localization.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment by enabling 3D reconstruction of capillaries and epithelial layer mapping in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, adaptable to various ophthalmic disease models and imaging endpoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in ocular surface biology.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through customized eye holder, stereotaxic staging, and controlled imaging parameters.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling early visualization of target engagement and tissue response.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions through quantitative, label-free, and fluorescent readouts across corneal and conjunctival compartments.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in multiphoton microscopy, ocular anatomy, and transgenic model handling.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including titanium sapphire laser, dichroic mirrors, band pass filters, motorized stage, and 3D reconstruction software.
- Cross-team standardization requirements for imaging protocols, signal detection settings, and image processing pipelines (e.g., Fiji plugins for noise reduction and contrast enhancement).
- Adaptation considerations across model systems, including adjustment of eyelid stabilization, ocular surface coupling gel, and excitation wavelengths for different fluorescent reporters.
- Practical limitations supported by source material: stabilizing the eyeball with moderate pressure without injury is critical, as insufficient or excessive pressure compromises image quality.
