פלטפורמת מיקרוסקופי מרובה-פוטונים מותאמת אישית להדמיה חיה של קרנית עכבר ולחמית
17 במאי 2020
מוצג כאן היא פלטפורמה מיקרוסקופית multiphoton עבור הדמיית פני השטח עינית עכבר חי. עכבר טרנסגני פלורסנט מאפשר הדמיה של גרעין התא, קרום התא, סיבי עצב ונימים בתוך פני השטח עינית. אותות לא ליניאריים של הדור ההרמוני השני הנגזרים ממבנים קולגניים מספקים הדמיה ללא תוויות עבור ארכיטקטורות סטרומה.
פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ מרובה מסננים להדמיה חיה של כל המבנה של משטח העין של העכבר במודל העכבר ההידור הפלואורסצנטי הכפול. השילוב של פלטפורמה מיקרוסקופית רב-פוטון מותאמת אישית ועכברים פלואורסצנטיים כפולים מאפשר הדמיה בזמן אמת של המבנה והמבנה של פני השטח העין. כדי להקים את מיקרוסקופ מולטיפוטונים, בחר את טבילת המים 20X, 1.00 NA המטרה ולהגדיר את לייזר ספיר טיטניום כמקור עירור על מיקרוסקופ זקוף.
הגדר את אורך הגל של פלט הלייזר ל- 880 ננומטר עבור EGFP ו- 940 ננומטר עבור tdTomato. כלול שתי מראות דיכרואיות להפרדת SHG EGFP ו- EGFP tdTomato ולהשתמש 434-17, 510-84 ו 585-40 ננומטר הלהקה לעבור מסננים כדי להפריד ספקטרלית את האותות SHG EGFP ו tdTomato. כדי להגדיר את מחזיק העין, לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה בעכבר הרדמה 8-12 שבוע, למקם את העכבר על שלב מיקרוסקופ מחומם ולהכניס בדיקה ניטור טמפרטורה.
מניחים את העכבר במחזיק עכבר סטריאטוקסי מותאם אישית ומכניסים את פסי האוזן לתוך הבשר השמיעתי החיצוני. השתמש קיבעון שלוש נקודות כדי לאבטח את מחזיק הראש ולהחיל 0.4% Oxybuprocaine הידרוכלוריד ותמיסת מלח על פני השטח העין. כסו את קצות זוג מדפים דומונט מספר חמש עם לולאת צינור PE.
לאחר שלוש דקות לבצע נסיגה עפעף ידני כדי לאשר את הבלט גלגל העין בזהירות למקם לולאת צינור מחזיק PE לאורך שולי העפעף כדי לחשוף את פני השטח העין. ולהשתמש בכוח של המחזיק כדי לייצב את גלגל העין עם המדפים. לאחר מכן, מכסים את משטח הקרנית עם ג'ל עיניים עם אינדקס שבירה של 1.338.
עבור הדמיה סדרתית Z של פני הקרנית, השתמש במקור אור כספית כדי לדמיין את שדה המטרה ולפתוח את תוכנת המיקרוסקופ. בחר את מכפיל התמונות והרווחים הדיגיטליים המתאימים להמחשת המבנה התאי במשטח העין והגדר את השקופית הראשונה והאחרונה כדי לאפשר רכישה של מחסנית תמונות. הגדר את רזולוציית התמונה ל- 512 על 512 פיקסלים ואת שלב Z למיקרומטר אחד.
לאחר מכן, לחץ על התחל לאסוף תמונות טוריות Z רכישת תמונה חיה אחת עם 880 nanometer העירור עבור SHG EGFP אוסף אותות, ותמונה חיה אחת ב 940 nanometer העירור עבור אוסף אותות tdTomato EGFP בתוך כל אזור. לאורך התמונה, השתמש במחזיק הבמה ממונע צעד כדי לסובב את גלגל העין כדי לאפשר הדמיה על פני הקרנית כולה. לאחר שכל התמונות נרכשו, טען את התמונות הטוריות Z לתוך פיג'י ובחר את תוסף המסנן חציוני תלת-מימדי.
לאחר הסרת רעשי הרקע, בחרו בחבילת המסנן 'הסרת חידוד מסיכה' פיג'י כדי לחדד את התמונות ולחצו על ניגודיות הבהירות האוטומטית כדי למטב אוטומטית את איכות התמונות. לאחר העיבוד, שמרו את התמונות כרצף תמונות טורי וייצאו את רצף התמונה לתוכנה מתאימה לשחזור תלת-מימדי. בכל התמונות מיקרוסקופיה multiphoton, להציג את אותות tdTomato ו SHG EGFP ב פסאודו ירוק, אדום, ציאן בהתאמה לפני לכידת תמונות מבנה 3D על ידי תצלום בזק.
מיקרוסקופיה מרובת פוטון מאפשרת הדמיה של תאי כנף ובזל שטחיים באפיתל הקרנית של עכברים מהונפים פלואורסצנטיים כפולים. תאים בודדים מהשכבה הבסיסית ניתן למפות לשכבה השטחית, כמו גם תאים שטחיים בצורת משושה יחיד. כפי שנחשף על ידי הביטוי הציטופלסמי של אות tdTomato, חלבון הממברנה עשיר במערכת כלי רכב תאיים עשירה, כולל מנגנון הגולגי והריתוק האנדופלסמי מפוזרים בתוך תאי הכנף.
בתוך סטרומה קולגן, קורטזיטים בצורת סטלטה מתוארים על ידי קרום מיקוד פלואורסצנטים EGFP בעכברים אלה. הקורטזיטים המוטמעים בסטרומה המכללה הם במים רופפים יותר מאשר בתוך תאי ה אנדותל. בנוסף, עצבי הסתעפות דקים בתוך סטרומה הקרנית ניתן גם לדמיין על ידי קרום מיקוד אותות tdTomato ו monolayers תא אנדותל הקרנית להפגין צורה משושה הומוגנית יחסית מחובר בתבנית חלת דבש.
האפיתל הלימבי מורכב משכבה אחת עד שתי שכבות של תאי אפיתל. הזן הפלורסנטי הכפול מאפשר גם הדמיה של נימים בתוך הלחמית, ומאפשר שחזור של הארכיטקטורה תלת מימדית של נימים המתארים את אנדותל כלי הדם. ייצוב גלגל העין עם לחץ מתון ללא פציעה הוא קריטי לרכישת תמונות באיכות טובה כמו לחץ לא מספיק או מוגזם יכול לסכן את איכות התמונה.
זה פלטפורמת הדמיה תמונה NVivo ניתן לשנות עבור הדמיה של מבנים מתחת לפני השטח העין והוא יכול להיות מיושם על מחקרים in-situ של מחלות עיניים שונות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פלטפורמה של מיקרוסקופיה רב-פוטונית להדמיה חיה של פני השטח של העין בעכבר, תוך שימוש במודל עכבר טרנסגני פלואורסצנטי כפול. המערכת מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של מבנים תאיים שונים בתוך פני השטח של העין.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- רפואת עיניים
- מיקרוסקופיה
רקע
- מיקרוסקופיית רב-פוטון היא טכניקת דימות עוצמתית.
- עכברים טרנסגניים פלואורסצנטיים מאפשרים ויזואליזציה משופרת של רכיבים תאיים.
- הבנת מבנה פני השטח של העין חיונית ליישומים מחקריים שונים.
- טכניקות דימות ללא סימון יכולות להשלים שיטות פלואורסצנטיות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לדימות חי של פני השטח של העין בעכבר.
- שימוש במיקרוסקופ מולטיפוטון מותאם אישית להדמיה משופרת.
- הדגמת היכולות של עכברים טרנסגניים פלואורסצנטיים כפולים בדימות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקמה של מיקרוסקופ רב-פוטוני עם עדשות אובייקטיביות והגדרות לייזר ספציפיות.
- שימוש במראות דיכרואיות ובמסנני Band pass להפרדת אותות.
- דימוי חי של עכברים תחת הרדמה על במה של מיקרוסקופ מחוממת.
- ויזואליזציה בזמן אמת של מבני פני השטח של העין.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של גרעיני תאים, ממברנות וסיבי עצב.
- דימוג ללא סימון (Label-free) של מבנים סטרומליים באמצעות יצירת הרמוניקה שנייה.
- הדגמה של יעילות פלטפורמת המולטי-פוטון.
- תיקוף של יכולות ויזואליזציה בזמן אמת.
מסקנות
- פלטפורמת המיקרוסקופיה הרב-פוטונית יעילה עבור דימות עיני.
- עכברים טרנסגניים עם פלואורסצנציה כפולה משפרים את הוויזואליזציה של מבני העין.
- שיטה זו יכולה לקדם את המחקר בביולוגיה של העין ובתחומים קשורים.
שאלות נשאלות שכיחוב
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פלטפורמת מיקרוסקופיה רב-פוטונית זו מאפשרת דימות חי, ללא סימון, של מבני פני השטח של העין בעכבר, ומספקת תובנות קריטיות לגבי ביולוגיה של הקרנית והלחמית לצורך גילוי תרופות אופתלמולוגיות. באמצעות ויזואליזציה של דינמיקה תאית, ארכיטקטורה סטרומלית ורשתות כלי דם in vivo, השיטה תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים של מטרות טיפוליות במודלים פרה-קליניים של מחלות עיניים. יכולתה של הפלטפורמה לבצע דימות על פני כל שטח העין עם מיקום מדויק מגבירה את הביטחון החזוי בתהליכי תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות (assays).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של גרעיני תאים, ממברנות, סיבי עצב ונימי דם ברקמה עינית חיה.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות תצפית בזמן אמת על ארכיטקטורת הסטרומה באמצעות second harmonic generation ודינמיקה תאית בדו-דיווח פלואורסצנטי.
- ערך ניבוי: משפר את מיון הפורטפוליו על ידי אספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של שינויים מבניים ותאיים במודלים עיניים רלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות עוברי-תיקוף לתהליכי עבודה המשכיים על ידי מתן אפשרות לדימות ברזולוציה גבוהה של מדורים אפיתליאליים, סטורמליים, אנדותליאליים וכלי דם.
- ערך תפעולי: נותן מענה לסטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות רכישת Z-stack מדויקת, הפרדה ספקטרלית של אותות SHG ואותות פלואורסצנציה, ומיקום מיוצב של גלגל העין.
- ערך אסטרטגי: מדגיש את המוכנות לסריקה ואת היכולת להשתמש בפלטפורמה שוב על ידי מתן אפשרות לדימות של כל שטח הקרנית והלחמיתי עם רעילות פוטו-כימית מינימלית.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות לשחזור של ארכיטקטורת נימי דם תלת-ממדית בלחמית וויזואליזציה של שכבות אפיתל הלימבס.
- ערך תפעולי: מתאר רצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, באמצעות תמיכה בדימות intravital עם מיקום מדויק באזורים השונים של פני השטח של העין.
- ערך ניבוי: נותן מענה להחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת דימות ללא סמנים (label-free) של הסטרומה ומיפוי תאי, המסייעים להבנה מכניסטית של פתולוגיה עינית.
שילוב בקו תהליך ובזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מוקדם של מטרות ועד לדימות פרה-קליני, ובכך תומכת בבחינת השערות ובצמצום סיכונים מכניסטיים במחקר אופתלמולוגי.
- ביולוגיה של גילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבחינת השערות, הבהרת מסלולים והפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לדימות חי של דינמיקה תאית ומבנית בפני השטח של העין.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה, השחזוריות ותוצרי הכמות באמצעות דימות Z-serial, הפרדת אותות ספקטרליים ותנאי דימות מיוצבים.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות, תוצאות או פלטי סטטיסטיקה המסייעים לצוויות להשוות בין תנאים, כולל SHG עבור ארכיטקטורת קולגן ו-tdTomato/EGFP עבור לוקליזציה של ממברנה וגרעין.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר את השיטה לרציפות פרה-קלינית או להתאמת סממנים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לשחזור תלת-ממדי של נימי דם ומיפוי של השכבה האפיתליאלית במודלים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה ככשרון רב-שימושי ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי, הניתנת להתאמה למגוון מודלים של מחלות עיניות ונקודות קצה של דימות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזויי, תיקוף מטרה, וצמצום עמימות מכניסטית בביולוגיה של פני השטח של העין.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות מחזיק עין מותאם אישית, מיקום סטריאוטקסי ופרמטרי דימות מבוקרים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות טובה יותר לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go), יעילות הון וצמצום סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה מוקדמת של מעורבות המטרה ותגובת הרקמה.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות לסיכון באמצעות קריאות כמותיות, ללא סימון (label-free) ופלואורסצנטיות במדרי הרקמה של הקרנית והלחמית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית במיקרוסקופיה רב-פוטונית, אנטומיה של העין וטיפול במודלים טרנסגניים.
- דרישות לתשתיות מכשוריות ואנליטיות, כולל לייזר טיטניום-ספיר, מראות דיכרואיות, מסנני Band pass, במה ממוטורת ותוכנה לשחזור תלת-ממדי.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרוטוקולי הדמיה, הגדרות גילוי אותים ותהליכי עיבוד תמונה (למשל, תוספי Fiji להפחתת רעשים והגברת ניגודיות).
- שיקולי התאמה בין מערכות מודלים, כולל התאמת ייצוב העפעפיים, ג'ל לצימוד לפני השטח של העין ואורכי גל עירור עבור רפורטרים פלואורסצנטיים שונים.
- מגבלות מעשיות הנתמכות בחומר המקור: ייצוב גלגל העין באמצעות לחץ מתון ללא גרימת פגיעה הוא קריטי, שכן לחץ נמוך או גבוה מדי פוגע באיכות התמונה.
