מערך מערכת Droplet ליטר ליצירת חלבון מקבילי בנפט ממולקולות דנ א יחיד
20 ביוני 2020
המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא להכין מעל 1,000,000 הורה, אחיד, יציב, ותואם ביולוגי טיפות של ליטר על 1 ס מ2 מצע מישורי שניתן להשתמש בו עבור סינתזה של חלבון תא ללא.
יותר ממיליון מדים מהטביעות מיוצרים על המצע בגודל אצבע. ומולקולות דנ"א בודדות מופצות באופן אקראי לכל טיפה. תפוקת החלבון פרופורציונלית למספר המולקולות ירידה.
הטכניקה שלנו יכולה לשמש למדידה מהירה וכמותית של פעילות האנזים ללא ביטוי חלבון מסובך וטיהור. כדי להתחיל, להגדיר זכוכית כיסוי על מתלה ויטראז'ים ולהנחות את המדף בשמונה נתרן הידרוקסיד דיוח. Sonicate את זכוכית הכיסוי ואת מתלה ויטראז' במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
הסר את מתלה ויטראז' נתרן הידרוקסיד ולשטוף את הכיסוי עם מים 10 פעמים. ייבש את הכיסוי עם אקדח אוויר. ואז לאפות ולייבש את הכיסוי על צלחת חמה ב 200 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
הכן פתרון אמינוסילן 0.05%.. לטבול את הכיסוי בתסומה זו ולהדרור אותו במשך שעה בטמפרטורת החדר. שוטפים את הכיסוי חמש פעמים במים טהורים.
ואז לייבש את הכיסוי באמצעות אקדח אוויר. אופים אותו על הצלחת החמה ב 80 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. מניחים את מצע זכוכית הכיסוי על צ'אק ואקום מותאם אישית עבור מעיל ספין.
לוותר על 70 עד 90 מיקרוליטרים של פולימר CYTOP מסוג-A במרכז מצע הזכוכית. ואז מיד לסובב את הפולימר. ציפוי הפולימר הראשוני פוגע באיכות מערך המיקרוצ'מברים הסופי.
מחלקים את הפולימר למרכז זכוכית הכיסוי מבלי להציג בועות אוויר. להרים את הזכוכית מצופה על ידי החזקת אותו בפינות ולה מניח אותו על רדיד אלומיניום. אופים אותו במשך 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס ולאחר מכן במשך שעה נוספת ב 200 מעלות צלזיוס.
לוותר 0.2 כדי 0.3 מיליליטר של פוטורסיסט במרכז המצע. מיד ספין-מעיל הפוטורסיסט ב 6, 000 סל"ד במשך 60 שניות. השתמש לנגב ספוג אתנול כדי להסיר את הפוטורסיסט העודף משוני המצע.
אופים את המצע ב 110 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. כדי לייבש מחדש את הפוטורסיסט, תן למצע לעמוד במשך 30 דקות בלחות יחסית של 42 עד 60% טען את המצע לתוך מיישר המסכות וחשוף אותו למשך 25 שניות במצב מגע ואקום. ואז לטבול את המצע במפתח במשך חמש דקות כדי להמיס את הפומריסט חשוף.
יש לשטוף את המצע 10 פעמים באמצעות מים טהורים. ואז לייבש את המצע ביסודיות באמצעות אקדח האוויר. מניחים את המצע בתא התגובה של מכונת התחריט תגובתי-יון וחרוטים את CYTOP מכוסה photoresist עם פלזמת חמצן.
לאחר תחריט, להסיר את הפוטורסיסט הנותר על ידי sonicating המצע באצטון במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. ואז sonicate המצע לתוך propanol במשך חמש דקות. לשטוף, sonicate, ולשטוף את המצע שוב באמצעות מים טהורים כמתואר בכתב יד.
ואז לייבש את המצע עם אקדח אוויר. באמצעות חותך שולחן עבודה, לחתוך סרט סרט קפטון דבק מצופה כפול לצורות microchannel מוגדר. תקע את חתיכות הסרט החתוכות בתחתית צלחת פטרי שטוחה כדי לשמש כמאסטר לעיצוב של PDMS.
יוצקים את תערובת ה-PDMS לתוך צלחת פטרי בדוגמת סרט הדבקה. לאחר מכן מניחים את צלחת פטרי לתוך תא ואקום מיני deerate תערובת PDMS במשך 1 עד 3 שעות. לאחר מכן מניחים את צלחת פטרי בתנור ב 60 מעלות צלזיוס ולהשאיר אותו לילה כדי לרפא את PDMS.
לאחר שה-PDMS נרפא, מקלפים את האלסטומר שנרפא מצלחת פטרי ולהשתמש בחותך כבלים שטוחים כדי לחתוך את קוביות המיקרו-ערוצים של PDMS. ואז לחפור חור בכל קצה של כל מיקרו-ערוצי. המצע שהוכן בעבר יהיה אזור למערך המיקרו-צ'מברים.
מקם את המיקרו-ערוצים של PDMS בחלק זה של המצע. לאחר מכן הכנס קצה צינור 200 מיקרוליטר לתוך אחד החורים במיקרו-ערוצי PDMS. ראשית, להכין את פתרון התגובה CFPS בצינור PCR.
לאחר מכן, באמצעות קצה צינור שאינו מסנן 200 microliter, לצייר 10 microliters של הפתרון. הכנס את קצה הצינור לתוך החור הכניסה של מיקרו-ערוצי PDMS ולדחוף למטה על הבוכנה צינור עד הפתרון עולה על גדותיו משקע microchannel. העבר את מכשיר FemDA לבלוק אלומיניום מקורר מראש.
ודא שאזור מערך המיקרו-שבבים הופך במהירות משקוף לשקוף. משוך 300 מיקרוליטרים של שמן סומק מקורר מראש ומיד להעביר את השמן לתוך קצה הצינור של חור התוך microchannel. שמן הסומק עובר לתוך המיקרו-ערוצים וממקם את פתרון התגובה העודף הממוקם מחוץ למיקרוצ'מברים.
הסר בו-זמנית את שני עצות הצינור שהוכסו מההתקן. מיד להעביר את המכשיר מבלוק אלומיניום לסרט פרפין. הכנס את קצה הצינור המוכן המכיל את שמן האיטום לתוך הכניסה של microchannel PDMS ולהזריק את השמן עד שהוא עולה על גדותיו מן השקע.
טיפות הפמטוליטר אטומות במיקרוצ'מברים בודדים על ידי השמן. פתח את תמונת ה- BF מנומרת. להסרת רקעים חלקים רציפים מכל מסגרת, בחרו 'חיסור רקע' מתפריט 'תהליך'.
הזן 20 לרדיוס הכדור המתגלגל. סמן את התיבה תצוגה מקדימה ובחר בסדר. בחרו 'כן' כשנשאלו אם לעבד את כל התמונות.
לאחר מכן, כדי להפחית את הרעש, בחר תהליך, מסננים, חציון. הזינו 2.0 לרדיוס בפיקסלים. סמן את התיבה תצוגה מקדימה ובחר בסדר.
בחרו 'כן' כשנשאלו אם לעבד את כל התמונות. לאחר מכן, בחרו 'תמונה', 'התאם', 'סף' כדי להפריד את התמונות של המיקרו-שבבים מרקע התמונה. מתפריט תוספים, בחר FemDA, ניתוח FemDA.
הזן את המספר המינימלי והמקסימום המשוער של פיקסלים של מיקרו-צ'מבר יחיד. המעגליות המינימלית והמקסיבית הצפויה של המיקרו-שבבים ומספרי מסגרת ההתחלה והסיום, ולאחר מכן בחר צור את ערך ההשקעה כדי לזהות את המיקרו-שבבים. ה- ROIs שזוהו בהצלחה מוצגים בתפריט המוקפץ ROITable.
בחלון ניתוח FemDA, בחר החל מסיכת ROI. בדוק את התמונה כדי לראות אם המיקרו-שבבים זוהו כראוי. פתח את תמונת הפלואורסצנטיות וה הבא אותה לחזית.
לחץ שוב על החל מסיכת ROI כדי להוסיף את ה- ROIs לתדמית הפלואורסצנטיות. בחלון ניתוח FemDA, בחר ירייה אחת כדי לנתח נתוני נקודת קצה של תמונה. הזן N עבור מספר הפיקסלים העליונים כדי להשתמש בפיקסלים העליונים של כל ROI כדי לחשב את העוצמה הממוצעת של הרשימה הנפתחת המתאימה.
לאחר מכן לחץ על למדוד עוצמה כדי לחשב את העוצמות הממוצעות של כל טיפות שזוהו. ה- ROITable מתעדכן בנתונים החדשים מתמונת הפלואורסצנטיות וההיסטוגרמה מוצגת בחלון חדש. יצא את הנתונים על-ידי לחיצה על לחצן שמור כטקסט.
פתרון פלואורסצנטי היה אנקפסולציה במיקרו-שבבים FemDA ואת עוצמת הפלואורסצנטיות, אשר מתואם עם גודל טיפה נמדד באמצעות מיקרוסקופיה. טיפות נמצאו יש התפלגות גודל צר. התמונה תלת-מימדית משוחזרת מן מיקרוסקופיה confocal גם הראה את גודל טיפה עקבי לאורך זמן.
טיפות היו יציבות בטמפרטורת החדר ללא אובדן אידוי או זיהום צולב בין טיפות לפחות 24 שעות. חלבון פלואורסצנטי mNeonGreen היה מסונתז ב FemDA. ותגלי תמונת המחסנית נותחו בעזרת תמונת השדה הבהיר המנושל בו-זמנית.
מכיוון שעוצמת הפלואורסצנטיות של כל טיפה נמדדת בתפוקת החלבון שלה, ההיסטוגרמה מרמזת בחוזקה על מספרים לא שווים של מולקולות דנ"א לכל טיפה. ההסתברות של טיפות המכילות מספרים שונים של מולקולות DNA היה התאמה מושלמת להתפלגות פואסון. סינתזה של האנזים אלקליין פוספטאז בוצעה גם ב FemDA עם תמונות שנתפסו כל חמש דקות.
התגובה הראתה התפלגות דיסקרטית דומה של עוצמת הפלואורסצנטיות של טיפות בנקודות זמן מוקדמות יותר ותוצאות ההיסטוגרמה אימתו כי המספרים הלא שווים של מולקולות ה- DNA טיפות. מולקולת DNA יחידה אנקפסולציה טיפות בודדות ניתן לשחזר עוד יותר, מוגבר, ורצף להפוך אותו הקרנת חלבונים הגבוהה ביותר האפשרית. טכניקת טיפה הכוללת נפח קטן או יציבות גבוהה מאפשרת אבחון מולקולרי מהיר ומדויק של מחלות סרטן עם סמנים ביולוגיים ספציפיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הכנתם של למעלה ממיליון טיפות פמטוליטר אחידות ויציבות על מצע מישורי עבור סינתזת חלבונים ללא תאים. הטיפות מאפשרות מדידה מהירה וכמותית של פעילות אנזימטית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוטכנולוגיה
- סינתזת חלבונים
- מדידת פעילות אנזימטית
רקע
- סינתזת חלבונים ללא תאים היא כלי בעל ערך בביוטכנולוגיה.
- טיפות אחידות יכולות לשפר את תנאי התגובה ואת תנובת המוצר.
- שיטות מסורתיות של ביטוי וטיהור חלבונים עשויות להיות מורכבות.
- טכניקה זו מפשטת את התהליך על ידי שימוש בטיפות למדידה ישירה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לייצור טיפות פמטוליטר אחידות.
- מתן אפשרות לסינתזה של חלבונים ללא תאים באופן מפושט.
- מתן אפשרות למדידות מהירות וכמותיות של פעילות אנזימטית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מצע מישורי ליצירת טיפות.
- חלוקה של מולקולות DNA בודדות לתוך הטיפות.
- מדידת תנובת החלבון בהתבסס על ריכוז מולקולות ה-DNA.
- סוניקציה של זכוכית כיסוי להבטחת יצירה אחידה של טיפות.
תוצאות עיקריות
- מעל מיליון טיפות אחידות הופקו בהצלחה.
- נמצא כי תנובת החלבון פרופורציונלית למספר מולקולות ה-DNA בכל טיפה.
- הטכניקה מאפשרת מדידה יעילה של פעילות אנזימטית.
- ביטול של שלבי ביטוי וטיהור חלבונים מורכבים.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מספק שיטה מהימנה לסינתזת חלבונים מבוססת טיפות.
- גישה זו יכולה לייעל באופן משמעותי בדיקות של פעילות אנזימטית.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לתחומי ביוטכנולוגיה שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערך טיפות הפמטוליטר (FemDA) מאפשר סינתזה מקבילית מאסיבית של חלבונים ממולקולות DNA בודדות, ותומך בסינון בתפוקה גבוהה ובבדיקות כמותיות של פעילות אנזימטית. על ידי מתאם בין תנובת החלבון למספר עותקי ה-DNA בכל טיפה, הטכנולוגיה מספקת פלטפורמה חסונה סטטיסטית לתיקוף מטרות וזיהוי מובילים (leads) בשלבי הגילוי המוקדמים. צריכת הרכיבים המינימלית שלה והתאימות למיקרוסקופיה סטנדרטית הופכות אותה לכלי ניתן להרחבה ומשתלם כלכלית להפחתת סיכונים של היפותזות ביולוגיות בצינורות הפיתוח של המחקר והפיתוח בביו-פארמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור תפוקת חלבונים לקלטים של DNA ברמה של מולקולה בודדת.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות קריאות כמותיות של סינתזת חלבונים ברזולוציית טיפות.
- ערך ניבוי: מסייע במיון פורטפוליו על ידי אספקת התפלגויות תנובה של חלבונים הניתנות לשחזור ובעלות מובהקות סטטיסטית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יצירת ריאקטורים אחידים בנפח של פמטוליטרים לצורך סינתזה עקבית וכמותית של חלבונים ללא תאים.
- ערך תפעולי: מאפשר מדידה מהירה של פעילות אנזימטית ללא צורך בטיהור מורכב, ובכך מקצר את זמן פיתוח הבדיקה.
- יכולת הרחבה: מעל מיליון טיפות לכל התקן מאפשרות קמפיינים של סריקה במקביליות מאסיבית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין כמות ה-DNA להפלט החלבוני התפקודי, ובכך תומכת בתכנון בדיקות המותאמות לסממנים ביולוגיים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבודדת משתנים בסינתזת חלבונים כדי להבהיר את הקשרים בין הגנוטיפ לפנוטיפ.
- ביטחון חיזוי: טעינת DNA בעלת התפלגות פואסון מאפשרת מידול סטטיסטי של שונות הביטוי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
טכנולוגיית ה-FemDA משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות, סטנדרטיזציה של בדיקות ואנליזה כמותית, תוך רלוונטיות תרגומית באמצעות קורלציה של תנובת חלבון והדירות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות רזולוציה של מולקולה בודדת של אירועי סינתזה של חלבון.
- סריקה: מספק מערכי טיפות אחידים ומוכנים לבדיקה לצורך סריקה של ביטוי חלבון בצפיפות גבוהה ובאופן הדיר.
- אנליטיקה: מספק קריאות של עוצמת פלואורסצנציה הפרופורציונליות לתשואת החלבון, מה שמאפשר השוואה כמותית בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מספר עותקי ה-DNA לבין תפוקת חלבון פונקציונלית, ובכך תומך בתרגום של בדיקות המותאמות לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: תואם לחדר נקי סטנדרטי ולמיקרוסקופיית פלואורסצנציה, מה שמאפשר שימוש חוזר נרחב בקרב צוותי מחקר וגילוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף מטרה באמצעות קורלציה של סינתזת חלבון ברמה של מולקולה בודדת.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות גודל טיפה אחיד ותאי פמטוליטר אטומים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של go/no-go באמצעות נתוני ביטוי כמותיים הניתנים להבחנה סטטיסטית.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף מותאם סיכון המאפשר סריקה בתפוקה גבוהה ובצריכה נמוכה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-פבריקציה (microfabrication), כימיה של פני שטח ופרוטוקולים לאיטום מיקרו-פלואידי.
- תלוי בגישה למסובבים (spin coaters), למכשירי חריטה בפלזמה ולתאי ואקום לצורך ייצור ההתקן.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי איטום בשמן ושל חומרים פעילי שטח בין צוותים שונים להבטחת יציבות טיפות.
- התאמה למערכות חלבונים שונות עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי הסינתזה ללא תאים (cell-free synthesis).
- מגבלה מעשית: קריאה מבוססת פלואורסצנציה דורשת רפורטרים תואמים ובקרות כיבוי (quenching controls).
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:33
Cleaning and Silanizing the Glass
1:26
Spin-Coating the Glass Substrate
2:40
Photolithography, Etching, and Cleaning
3:47
Fabricating the Microchamber Array Device
5:04
Generating the Femtoliter Droplet Array (FemDA)
6:35
Image Data Analysis
8:45
Results: Cell-Free Protein Synthesis in FemDA
10:07
Conclusion
