מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

כאן, אנו מאפיינים את התגובות הסלולר מדגיש התגובה התאית ב-נמטודות C. אלגיה על ידי מדידת ההפעלה של כתבים פלורסנט ההמרה ולומר רגישות ללחץ פיזיולוגי.

שיטות אלה יכולות לשמש כדי לאפיין תגובות מתח C.elegans ולקבוע אם הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות להשפיע על ההפעלה של מסלולים הסלולר מגן. שיטות אלה מאפשרות בדיקות תפוקה מהירה וגברוהה של מאות הפרעות כגון הפלת גנים הן ברמה המולקולרית והן ברמה הפיזיולוגית. כדי להבטיח שההתבצעות מתבצעת כראוי, כלול פקדים חיוביים ושליליים.

סנכרנו בעלי חיים בריאים וניזונים היטב לשלב הנכון ולהשתמש בצלחות טריות לניסוי. הדמיה של מיקרו-ניהול של התולעים עם בחירה יכולה לעזור למשתמשים חדשים להבין כיצד ניתן ליישר את התולעים ולהעריך אותן לצורך כדאיות. הדגמת ההליכים תהיה פיל פרנקינו, הולי גילדיה ומליסה מטקאלף, סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדה שלנו.

כדי להשתמש בבעלי חיים המבטאת GFP תחת האמרגן של חלבון הלם החום ארבע להפעלת reticulum אנדופלזמי התגלגל תגובת חלבון, לגדל בעלי חיים כתב מסונכרן ב 20 מעלות צלזיוס עד שלב L4 ולשטוף את התולעים מהצלחת באמצעות מדיום M9 ולהעביר לתוך צינור. לאחר איסוף התולעים על ידי צנטריפוגה, להחליף את M9 עם 25 ננוגרם למיליליטר של התרופה של עניין M9 או דימתיל סולפוקסיד ב M9 בצינורות בעלי חיים בקרה. ואז למקם את התולעים על פלטפורמה מסתובבת במשך שלוש עד ארבע שעות ב 20 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, צנטריפוגה התולעים להתיישב לפני החלפת פתרון הטיפול עם 15 מיליליטר של M9 לבד. לאחר שתי שטיפות, להעביר את בעלי החיים צלחות NGM או NGM RNA הפרעות לוחות לפי הצורך ולאפשר לתולעים להתאושש לילה ב 20 מעלות צלזיוס. כאשר התולעים התאוששו, להוסיף חמישה עד 10 microliters של 100 מילימולר נתרן אזיד על צלחת NGM סטנדרטית ללא חיידקים ולמקם צלחת של תולעים תחת מיקרוסקופ חיטוי.

מעבירים 10 עד 20 בעלי חיים מהצלחת לנקודה של נתרן אזיד. בעלי החיים צריכים לתפוס תנועה זמן קצר לאחר הנחיתה בתסתר המלח. לאחר שהנתרן אזיד התאדה, בשורה את בעלי החיים במערך ההדמיה הרצוי עם הצדדים הקדמיים וה האחוריים באותו אוריינטציה עבור כל בעלי החיים ומיד למקם את הצלחת של בעלי חיים תחת מיקרוסקופ סטריאו.

הפעל את תוכנת הדמיית המיקרוסקופ הסטריאו ותחת הכרטיסיה רכישות, לחץ על פתח פרוייקטים ותיקיות כדי לפתוח פרוייקט חדש. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר שנה שם כדי לשנות את שם התיקיה. מקם את דגימת התולעת מתחת למטרת המיקרוסקופ ולהשתמש בהגדרה Brightfield כדי לאתר את המוקד הנכון של התולעים כדי למזער הלבנה פלואורסצנטי.

מרכז המדגם יהיה הנקודה שבה קו הביצים נראה בבירור ולא מטושטש. הגדר את זמן החשיפה כדי להבטיח שפיקסלים אינם רוויים וגם כדי להבטיח שהאות נמצא מעל מגבלת הזיהוי. לאחר הגדרת זמן החשיפה, שינוי גודל התצוגה, המוקד ועיבוי ברייטפילד להגדרות המתאימות, לחץ על לחצן לכידת התמונה כדי להשיג תמונה.

להדמיה באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב מורכב, מקם את לוחית הטיפול הבסיסית על שלב המיקרוסקופ הרחב המורכב ולהשתמש בלוח המגע כדי להפעיל את תוכנית הבקרה. צור אלבום ושם קובץ חדשים ומקם את הלוחית מתחת לעדשת המטרה. השתמש בבקרה הבסיסית ובצלחות הבקרה החיוביות כדי להגדיר את זמן החשיפה ואת עוצמת הפלואורסצנטיות כך שהאות יהיה גלוי אך לא רווי.

לאחר מכן שמרו תמונות ברייטפילד ו-GFP FITC. כדי לכמת את האינדוקציה של הכתב על ידי ציטומטריית זרימת חלקיקים גדולה, הפעל תחילה את לייזרי הציטומטר ופתח את תוכנת הציטומטר. לחץ להתחיל להפעיל את הלייזרים בחלון התוכנה ולחץ על הפעל כדי ליזום את הלייזר בחלון המוקפץ בקרת לייזר ארגון.

כאשר הלייזר מגיע סביב 12 מילי וואט ואת רמת מקור האור 488 עולה עד סביב 12, לחץ על עשה ולבדוק את ארבעת ערכי הלחץ. אם הערכים נראים דומים לאלה שנצפו בהגדרה המקורית, סמן את התיבה אישור לחץ. לאחר מכן, כדי לוודא שאין בועות אוויר או פסולת החוסמת את זרימת נדן ולדגום דרך תא הזרימה, לחץ על נקי מספר פעמים.

לאחר מכן כבה את המיון ואת הנדן כדי להפעיל מחדש את הזרימה. כדי לבדוק את קצב הזרימה, לאסוף את נדן במשך 60 שניות. לאסוף את נדן לתוך צינור 15 מיליליטר במשך 60 שניות.

קצב הזרימה צריך להיות 9 עד 10 מיליליטר לדקה. כדי להפעיל את הדגימות, התאם את עוצמת הפוטומולטייאר בלייזר לרמה גבוהה מספיק כדי שהאות יהיה מעל מגבלת הזיהוי אך לא גבוה יותר ממגבלת הרוויה. בצע gating גודל כדי לא לכלול בועות, פסולת, ביצים, וחלקיקים קטנים לא רצויים אחרים לכלול רק את בעלי החיים של עניין כגון מבוגרים.

לאחר הגדרת פרמטרי ההקרנה, הוסף את התולעים המוכנות לגביע ולחץ על לרכוש. צפה כדי לוודא כי כל הנוזל לא נלקח לתוך המכונה כמו זה יגרום ציטומטר זרימה לקחת באוויר וליצור בועות בתוך הגלאי. כאשר המדגם נמוך ו/או נאספו מספיק בעלי חיים, לחץ על עצור.

כדי לאחסן נתונים מגודרים בהתבסס רק על אילוצי הגודל, לחץ על כיוונון, אחסון נתונים, מגודרים בלבד ואחסן אותם מגודרים כדי לשמור את הנתונים. לאחר מכן לשטוף את האוסף עם מים deionized ולהסיר את לשטוף על ידי ואקום שלוש פעמים לפני לחזור על הניתוח עם המדגם הבא. כדי למדוד את רגישות הלחץ המיטוכונדריאלי והחמצוני, להוסיף 50 עד 75 microliters של Paraquat ב M9 לשמונה עד 10 בארות לכל מצב של צלחת שטוחה למטה 96 באר ולהעביר שמונה עד 10 תולעים לכל תנאי לכל באר של Paraquat.

כל שעתיים, הקש על הצלחת בעדינות כדי לגרום לבעלי החיים לחיות לתפור או להתכופף כדי לאפשר ניקוד של מספר בעלי החיים המתים לבא. כדי למדוד את רגישות הטמפרטורה של בעלי החיים, הדגירה את התולעים במשך שלושה עד ארבעה ימים ב 20 מעלות צלזיוס לפני ציפוי 10 עד 15 בעלי חיים לכל צלחת לכל תנאי עבור סך של ארבע עד שש צלחות. ואז למקם את הצלחות לתוך אינקובטור 34 או 37 מעלות צלזיוס ולהבקיע את הישרדות התולעת כל שעתיים כפי שהוכח רק.

כתב hsp-4 יש רושם בסיס מינימלי בהיעדר מתח אבל מציג ביטוי GFP חזק כאשר בעלי החיים נחשפים ללחץ רשתית אנדופלזמית באמצעות התרופה Tunicamycin. הבדלים אלה ניתן לכמת גם באמצעות ציטומטר זרימת חלקיקים גדול. יתר על כן, אינדוקציה של הטרנסג'ין תחת מתח רשתית אנדופלזמית יכול להיות מדוכא לחלוטין על ידי הפלה של XBP-1 באמצעות הפרעה RNA.

בדיקות דומות יכולות להתבצע כדי למדוד מתח מיטוכונדריאלי, מתח חמצוני, ומתח חום. תגובות פיזיולוגיות של בעלי חיים שלמים ללחץ ניתן למדוד גם באמצעות מספר מיסי הישרדות. לדוגמה, חשיפה לטוניקמיצין משמשת למדידת רגישות ללחץ רשתית אנדופלזמית.

ההפלה של הגן XBP-1 גורמת לעלייה משמעותית ברגישות לטוניקאמיצין. יתר על כן, חשיפה לסוכן הכימי Paraquat משמשת למדידת רגישות ללחץ חמצוני ומיטוכונדריאלי. הפלת הגן DAF-2 גורמת לעלייה משמעותית בהתנגדות ל-Paraquat.

Thermotolerance ניתן למדוד על ידי קביעת ההישרדות של בעלי חיים בטמפרטורות גבוהות והוא יכול להיות התווה כמו עקומת הישרדות. בדיקות אלה צריכות להתבצע לפחות ארבע עד שש פעמים וכל השכפולים צריכים להיות מותווים אחד נגד השני כמו thermotolerance מדגים שונות גבוהה מאוד לעומת בדיקות מתח אחרות. כאשר מדמיינים בעלי חיים, חיוני להגדיר את הפרמטרים כך שלא תהיה רוויה של אות או מתחתיה ולהבטיח שאותם פרמטרים ישמשו לאורך כל הניסוי.

פרוטוקולי ההדמיה המתוארים כאן נוחים להקרנה בקנה מידה גדול כולל מסכים ברחבי הגנום והם נהדרים הן למחקרים גישושים והן למחקרים מאשרים אשר לאחר מכן ניתן לעקוב אחריהם על ידי הבדיקות הפיזיולוגיות המתוארות.