בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון
7 במאי 2020
מוצג כאן פרוטוקול כדי להעריך את המאפיינים ההתכווצות של שרירים מחוסנים myofibrils עם רזולוציית ננו ניוטון. הפרוטוקול משתמש בהתקנה עם גשוש כוח אופטי מבוסס אינטרפרומטריה. הגדרה זו יוצרת נתונים עם יחס אות לרעש גבוה ומאפשרת הערכה של קינטיקה מתכוובת של myofibrils.
הערכת המאפיינים החוזיים של myofibrils מבודד שרירים מנוצים ניתן להשתמש כדי לקבוע אם תפקוד לקוי sarcomere הוא הגורם העיקרי לחולשת שרירים עקב מוטציות חלבונים סרקומריים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להשיג נתונים עם יחס אות לרעש גבוה מאוד עם רזולוציה nanonewton. פרוטוקול זה מתאים גם למדידת התכווצות בקרדיומיוציטים מחלחלים.
זכור כי מתמר הכוח הוא שביר מאוד. אז בעת הסרת הדבק ממחט ההרכבה או בעת הדבקת myofibril, אתה צריך להיות יד יציבה, הרבה תרגול, והרבה סבלנות. לפני הרכבה של הרקמה, מניחים מוט הומוגניזר בצינור המכיל את רקמת השריר.
שמירה על הצינור על קרח, לסובב את הרוטור במשך 15 שניות על מהירות חמש. בסוף הומוגניזציה, להעביר 50 microliters של ההשעיה myofibril וכתוצאה מכך 250 microliters של פתרון מרגיע על מגלשה מצופה פולי HEMA באמבט רקמות. מכסים את האמבטיה במכסה כדי להגן על התערובת מפני אבק ומחכים 5 עד 10 דקות כדי לאפשר myofibrils לשקוע לתחתית הירידה.
במהלך הטביעה של myofibrils, מחממים Shellac דבק אתנול ב 65 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 שניות לפני הוספת על שישה microliters של דבק על מגלשת זכוכית לא צותת. טובלים שוב ושוב את קצה כל מחט הרכבה לתוך הדבק עד שכבה של דבק גלוי. לאחר מכן השתמש במיקרו-מניפולטורים כדי להזיז את הגשוש ואת הפיזו אנכית כדי לפנות מקום לאמבט הרקמות בשלב המיקרוסקופ ולהסיר את מגלשת הזכוכית המכילה את הדבק.
לאחר הרכבה myofibrils, כדי למדוד את אורך sarcomere, להזיז את פיזו ו / או בדיקה כוח כדי להגדיר את אורך sarcomere הראשונית של myofibril ל 2.5 מיקרומטר. באמצעות תפקוד כלי השיט של תוכנת בקר המערכת, למדוד את האורך והרוחב myofibril. השתמש בשלב המיקרוסקופ כדי למקם את myofibril במרכז תמונת הווידאו למתוח מלבן מצד אחד של myofibril לצד השני, דואג לכלול את הקצה הכהה של טיפות דבק.
כדי להתחיל בהקלטת הנתונים, לחץ על התחל. לאחר חמש שניות, לחץ על השהה. האורך יירשם.
כדי למדוד את הרוחב, סובב את המצלמה ב- 90 מעלות כדי להציג את הניגודיות של קצה ה- myofibril עצמו. כוונן את המלבן ולחץ על התחל כדי להתחיל להקליט את הנתונים. לאחר חמש שניות, לחץ על השהה.
הרוחב נרשם. כדי למקם את התטא, השתמש בעין ובמניפולטור כדי להזיז בזהירות את התטא לכיוון myofibril. ליישר את הערוץ העליון של תטא עם myofibril ולבצע צעד מהיר כדי לבדוק את המיקום.
הפעל את זרימת מרגיע הרקע כדי לבדוק את יישור הזכוכית תטא ולהשתמש ידית שסתום לור כדי להפעיל את הזרימה של תא הזרימה. ואז להתחיל לנקז את תא הזרימה ולמנוע גלישה של תא הזרימה, להגדיר את שסתום משאבת הזרימה לשסתום אמבטיה 2, מצב צעד מיקרו למיקרו, יעד הבוכנה ל 48, 000, ואת מהירות הבוכנה ל 38 עד 40. כדי למדוד את קצב פיתוח המתח, לחשב את תנועת פייזו הדרוש כדי להתרשל myofibril על ידי 15%ולהזין ערך זה לתוך מחולל האות.
לחץ על קורות חיים כדי להמשיך להקליט את הנתונים ושסתומים פתוחים אחד ושש כדי להתחיל את הזרימות של הפתרון המרגיע ואת ריכוזי הסידן השונים דרך תטא בהתאמה. בחר טווח איפוס על האינטרפרומטר כדי לאפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה אפס וולט. כאשר עקבות הכוח יציבות, בצע את הצעד המהיר של זכוכית תטא עם גודל צעד של 100 מיקרומטר.
כאשר מגיעים למישור הכוח, מבצעים את המתיחה מחדש עם הפייזו. עקבות הרפיה הפעלה יירשמו. לחץ על השהה.
כדי לבצע מתיחה מבחינת שלב, לחץ על התחל ואפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה אפס וולט. בצע מתיחה צעד חכם עם מחולל האותות. כאשר המתיחה הסתיימה, השתמש piezo כדי לקצר את myofibril לאורך הרפוי.
לאחר מכן לחץ על השהה ועוון ושמור את הנתונים. כאן, עקבות כוח של ניסוי כוח פעיל עם myofibril מבודד שרירי שרירי שרירי הארבע ראשי אנושי בריא מוצגים. myofibril הופעל חמש פעמים עם פתרונות עם ריכוזי סידן שונים, עם כוח מרבי ממוצע של כל myofibrils של כ 123 מילניטון למילימטר מרובע.
בניית עקומת ריכוז סידן כוח מ לכוחות הרמה שהושגו במהלך כל הפעלה בכל אחת מחמש עקומות הסידן מאפשרת חישוב של ריכוז הסידן ב -50% מייצור הכוח המרבי. כפי שמודגם בניתוח מייצג זה, myofibrils ניתן לטפל עם תרכובות מרובות בניסוי אחד כדי לענות על שאלות נוספות על סוג myofibril. ניתן למדוד גם את הכוח הפעיל ואת אורך הסרקומר כדי לאפשר חישוב של שיעורי הפיתוח מחדש, ההפעלה והרפיה.
העלייה התלולה המוצגת בתיבה האדומה המנוקדת נגרמת הן על ידי צמיגות והן על ידי גמישות. הרמה דומה רק למרכיב האלסטי. כמו צמיגות מתנגדת למתח ליניארי, הכוח ירד לאחר המתח הוסר.
בעת מיקום תטא, הקפד ליישר אותו כראוי עם myofibril. אחרת, פתרון ההפעלה עשוי לבוא בין הסיב האופטי ואת cantilever של בדיקה כוח וזה גורם חפצים להתרחש בנתונים שלך. כמו כן, myofibril לא יכול לפעול כראוי.
שיטה זו של זיוף מתאימה גם כדי לקבוע את סוג סיבי השריר של myofibril. לדוגמה, אתה יכול קודם לבלבל את myofibril עם פתרון סידן נורמלי ואחריו תדלוק של אותו פתרון, אבל אז להוסיף תרכובת ספציפית לשיפור כוח סוג סיבי שריר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להערכת תכונות התכווצות של מיופיברילים בשריר משורטט, תוך התמקדות בזיהוי תקלות בסרקומר הקשורות לחולשה שרירית. השיטה משיגה זאת באמצעות גשוש כוח אופטי המבוסס על אינטרפרומטריה, המספק נתונים ברזולוציה גבוהה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- תכונות התכווצות של מיופיברילים
- פיזיולוגיה ותפקוד לקוי של שרירים
- טכניקות למדידת כוח
רקע
- הבנת תפקוד לקוי של הסרקומר כגורם לחולשת שרירים
- שימוש במיופיברילים מבודדים להערכת כושר התכווצות
- הערכת סוגי סיבי שריר וקינטיקה של התכווצות
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גשש כוח אופטי מבוסס אינטרפרומטריה
- מיופיברילים שבודדו משריר משורטט
- טכניקות מדידה בעלות יחס אות לרעש גבוה
תוצאות עיקריות
- כוח מקסימלי ממוצע של סיבי שריר (myofibrils) שנמדד בכ-123 mN/mm²
- פיתוח עקומה של כוח מול ריכוז סידן
- הדגמת יכולת להערכת תרכובות מרובות בניסויים
מסקנות
- פרוטוקול זה מודד ביעילות את יכולת התכווצות המיופיברילים, ובכך מאפשר חקר נוסף של פיזיולוגיה של השריר.
- רלוונטי למחקר בביולוגיה של השריר ובמחלות שרירים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכת כושר הכיווץ של המיופיברילים מאפשרת בחינה ישירה של תפקוד הסרקומר, ומספקת תובנה מכניסטית לגבי השאלה האם מוטציות בחלבונים סרקומריים גורמות באופן ישיר לחולשת שרירים. גישה זו מפחיתה את הסיכון באישור המטרה על ידי בידוד פגמים בכיווץ ממשתנים תאיים או מבניים מבלבלים. מדידות כוח ברזולוציה גבוהה תומכות בביטחון ניבוי בבדיקה של היפותזות טיפוליות בשלב מוקדם.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן האם תפקוד לקוי של הסרקומר הוא ההשפעה העיקרית של מוטציה בחלבונים סרקומריים.
- ערך תפעולי: מאפשר מדידה של אינטראקציות בין אקטין למיוזין תחת אילוצים סרקומריים פיזיולוגיים.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות המשך (go/no-go) על ידי הבהרת הבסיס המכניסטי של חולשת שרירים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספק נתוני כוח כמותיים עם יחס אות לרעש גבוה בטווח של nano-Newton.
- ערך תפעולי: מאפשר פרפוזיה מהירה של סידן או תרכובות הודות לקוטר קטן של המיופיבריל.
- ערך אסטרטגי: מאפשר הערכה של קינטיקת ההפעלה וההרפיה לצורך סריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר חישוב של רגישות לסידן (EC50) באמצעות עקומות של כוח מול ריכוז סידן.
- ערך תפעולי: תומך בבדיקה של מספר תרכובות בדגימה אחת של myofibril.
- ערך אסטרטגי: מאפשר פרמקולוגיה ספציפית לסוג הסיב באמצעות פרפוזיה של תרכובות סלקטיביות לסוג הסיב.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה מתאימה לשלבי הגילוי המוקדמים להערכת תקיפות המטרה לפני המעבר למודלים מבוססי תאים או רקמות.
- ביולוגיה של גילוי: בודק את ההשערה כי תפקוד לקוי של הסרקומרה מניע את הפנוטיפ במודלים גנטיים של שריר.
- סריקה: מספק נתוני כוח כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר עקומות כוח המאפשרות גזירת קצבי הפעלה, הרפיה ושחזור.
- מחקר תרגומי: מקשר בין המנגנון המולקולרי לפנוטיפ כיווץ ברקמה אנושית רלוונטית למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה סטנדרטית למכניקת סרקומרה עבור מטרות ואינדיקציות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי במנגנון המטרה באמצעות הערכה ישירה של הסרקומר.
- ערך תפעולי: זיהוי כוח ברזולוציה גבוהה עם רגישות בטווח של nano-Newton.
- ערך אסטרטגי: מפחית את אי-הוודאות בהפחתת סיכונים ביולוגיים בשלבי תיקוף מוקדמים של המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף המבוסס על סיבתיות מנגנונית של חולשת שרירים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרו-מניפולציה וטיפול ברקמות לצורך קיבוע של גששים שבירים ושל myofibrils.
- נדרשת תשתית של מתמר כוח מבוססה אינטרומטריה ומנוע אורך פיאזו (piezo length motor).
- חיוני לבצע פרפוזיה סטנדרטית ובקרה סביבתית (למשל, טמפרטורה, החלפת תמיסות).
- התאמה למינים שונים או לסוגי שרירים שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- שבירותו של גשש הכוח האופטי מחייבת הכשרה וטיפול זהירים כדי למנוע נזקים.
