בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון

מוצג כאן פרוטוקול כדי להעריך את המאפיינים ההתכווצות של שרירים מחוסנים myofibrils עם רזולוציית ננו ניוטון. הפרוטוקול משתמש בהתקנה עם גשוש כוח אופטי מבוסס אינטרפרומטריה. הגדרה זו יוצרת נתונים עם יחס אות לרעש גבוה ומאפשרת הערכה של קינטיקה מתכוובת של myofibrils.

הערכת המאפיינים החוזיים של myofibrils מבודד שרירים מנוצים ניתן להשתמש כדי לקבוע אם תפקוד לקוי sarcomere הוא הגורם העיקרי לחולשת שרירים עקב מוטציות חלבונים סרקומריים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להשיג נתונים עם יחס אות לרעש גבוה מאוד עם רזולוציה nanonewton. פרוטוקול זה מתאים גם למדידת התכווצות בקרדיומיוציטים מחלחלים.

זכור כי מתמר הכוח הוא שביר מאוד. אז בעת הסרת הדבק ממחט ההרכבה או בעת הדבקת myofibril, אתה צריך להיות יד יציבה, הרבה תרגול, והרבה סבלנות. לפני הרכבה של הרקמה, מניחים מוט הומוגניזר בצינור המכיל את רקמת השריר.

שמירה על הצינור על קרח, לסובב את הרוטור במשך 15 שניות על מהירות חמש. בסוף הומוגניזציה, להעביר 50 microliters של ההשעיה myofibril וכתוצאה מכך 250 microliters של פתרון מרגיע על מגלשה מצופה פולי HEMA באמבט רקמות. מכסים את האמבטיה במכסה כדי להגן על התערובת מפני אבק ומחכים 5 עד 10 דקות כדי לאפשר myofibrils לשקוע לתחתית הירידה.

במהלך הטביעה של myofibrils, מחממים Shellac דבק אתנול ב 65 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 שניות לפני הוספת על שישה microliters של דבק על מגלשת זכוכית לא צותת. טובלים שוב ושוב את קצה כל מחט הרכבה לתוך הדבק עד שכבה של דבק גלוי. לאחר מכן השתמש במיקרו-מניפולטורים כדי להזיז את הגשוש ואת הפיזו אנכית כדי לפנות מקום לאמבט הרקמות בשלב המיקרוסקופ ולהסיר את מגלשת הזכוכית המכילה את הדבק.

לאחר הרכבה myofibrils, כדי למדוד את אורך sarcomere, להזיז את פיזו ו / או בדיקה כוח כדי להגדיר את אורך sarcomere הראשונית של myofibril ל 2.5 מיקרומטר. באמצעות תפקוד כלי השיט של תוכנת בקר המערכת, למדוד את האורך והרוחב myofibril. השתמש בשלב המיקרוסקופ כדי למקם את myofibril במרכז תמונת הווידאו למתוח מלבן מצד אחד של myofibril לצד השני, דואג לכלול את הקצה הכהה של טיפות דבק.

כדי להתחיל בהקלטת הנתונים, לחץ על התחל. לאחר חמש שניות, לחץ על השהה. האורך יירשם.

כדי למדוד את הרוחב, סובב את המצלמה ב- 90 מעלות כדי להציג את הניגודיות של קצה ה- myofibril עצמו. כוונן את המלבן ולחץ על התחל כדי להתחיל להקליט את הנתונים. לאחר חמש שניות, לחץ על השהה.

הרוחב נרשם. כדי למקם את התטא, השתמש בעין ובמניפולטור כדי להזיז בזהירות את התטא לכיוון myofibril. ליישר את הערוץ העליון של תטא עם myofibril ולבצע צעד מהיר כדי לבדוק את המיקום.

הפעל את זרימת מרגיע הרקע כדי לבדוק את יישור הזכוכית תטא ולהשתמש ידית שסתום לור כדי להפעיל את הזרימה של תא הזרימה. ואז להתחיל לנקז את תא הזרימה ולמנוע גלישה של תא הזרימה, להגדיר את שסתום משאבת הזרימה לשסתום אמבטיה 2, מצב צעד מיקרו למיקרו, יעד הבוכנה ל 48, 000, ואת מהירות הבוכנה ל 38 עד 40. כדי למדוד את קצב פיתוח המתח, לחשב את תנועת פייזו הדרוש כדי להתרשל myofibril על ידי 15%ולהזין ערך זה לתוך מחולל האות.

לחץ על קורות חיים כדי להמשיך להקליט את הנתונים ושסתומים פתוחים אחד ושש כדי להתחיל את הזרימות של הפתרון המרגיע ואת ריכוזי הסידן השונים דרך תטא בהתאמה. בחר טווח איפוס על האינטרפרומטר כדי לאפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה אפס וולט. כאשר עקבות הכוח יציבות, בצע את הצעד המהיר של זכוכית תטא עם גודל צעד של 100 מיקרומטר.

כאשר מגיעים למישור הכוח, מבצעים את המתיחה מחדש עם הפייזו. עקבות הרפיה הפעלה יירשמו. לחץ על השהה.

כדי לבצע מתיחה מבחינת שלב, לחץ על התחל ואפס את טווח האינטרפרומטר כך שהכוח הבסיסי יהיה אפס וולט. בצע מתיחה צעד חכם עם מחולל האותות. כאשר המתיחה הסתיימה, השתמש piezo כדי לקצר את myofibril לאורך הרפוי.

לאחר מכן לחץ על השהה ועוון ושמור את הנתונים. כאן, עקבות כוח של ניסוי כוח פעיל עם myofibril מבודד שרירי שרירי שרירי הארבע ראשי אנושי בריא מוצגים. myofibril הופעל חמש פעמים עם פתרונות עם ריכוזי סידן שונים, עם כוח מרבי ממוצע של כל myofibrils של כ 123 מילניטון למילימטר מרובע.

בניית עקומת ריכוז סידן כוח מ לכוחות הרמה שהושגו במהלך כל הפעלה בכל אחת מחמש עקומות הסידן מאפשרת חישוב של ריכוז הסידן ב -50% מייצור הכוח המרבי. כפי שמודגם בניתוח מייצג זה, myofibrils ניתן לטפל עם תרכובות מרובות בניסוי אחד כדי לענות על שאלות נוספות על סוג myofibril. ניתן למדוד גם את הכוח הפעיל ואת אורך הסרקומר כדי לאפשר חישוב של שיעורי הפיתוח מחדש, ההפעלה והרפיה.

העלייה התלולה המוצגת בתיבה האדומה המנוקדת נגרמת הן על ידי צמיגות והן על ידי גמישות. הרמה דומה רק למרכיב האלסטי. כמו צמיגות מתנגדת למתח ליניארי, הכוח ירד לאחר המתח הוסר.

בעת מיקום תטא, הקפד ליישר אותו כראוי עם myofibril. אחרת, פתרון ההפעלה עשוי לבוא בין הסיב האופטי ואת cantilever של בדיקה כוח וזה גורם חפצים להתרחש בנתונים שלך. כמו כן, myofibril לא יכול לפעול כראוי.

שיטה זו של זיוף מתאימה גם כדי לקבוע את סוג סיבי השריר של myofibril. לדוגמה, אתה יכול קודם לבלבל את myofibril עם פתרון סידן נורמלי ואחריו תדלוק של אותו פתרון, אבל אז להוסיף תרכובת ספציפית לשיפור כוח סוג סיבי שריר.