Name: באתרו היברידיזציה עבור סיפונקולוס נודוס מנוזל קואוממית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: למדו שיטת היברידיזציה in situ לזיהוי mRNA בנוזל הקואוממית של Sipunculus nudus. השיטה מאפשרת הדמיית ביטוי גני dmrt1 בתאי טרופובלסט ומסייעת בחקר ביולוגיה מולקולרית ביצורים ימיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי קרן המדענים הצעירים של הארגון הלאומי למדעי הטבע של סין (גרנט No. 31801034), הקרן המדע הטבעי של מחוז פוג'יין, סין (2016J01161), קרנות המחקר המדעי של אוניברסיטת Huaqiao (15BS306) ו פוסט בוגרי הקרן החדשנית מחקר מדעי של אוניברסיטת Huaqao

נוהל בעלי החיים אושר על ידי ועדת הבריאות והרווחה של אוניברסיטת Huaqao.
1. הכנה לריבוחלוק
<ol><li>פריימר עיצוב<ol>
<li>פתח את התוכנית פריימר 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). העתק את רצף dmrt1 (genbank: MK182259) לתוך חלון הרצף.</li>
		<li>הגדר אורך פריימר (23-25 bp), טמפרטורת ההיתוך (55-60 ° c), ו-G/C תוכן (40-60%). לחץ על בחר התחל. הערה: הגודל המינימלי הנדרש עבור בדיקה RNA הוא כ 500 bp. הבדיקות הארוכות בדרך כלל כוללים ספציפיות יותר.</li>
		<li>הוסיפו את רצף המקדם של T7 RNA פולימראז (5, -taאטקg, טטקקאכא2-3,) לאחד מצבעי היסוד שנבחרו. רצפי dmrt1 פריימר עבור ISH מוצגים בטבלה 1. הערה: לבדיקות הגיוניות, היזם T7 RNA פולימראז ממוקם בקצה של 5 התחל הקדמי. עבור בדיקה נגד היגיון, היזם T7 RNA פולימראז ממוקם ב 5 '-סוף של התחל לאחור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגברה הPCR<ol>
<li>מניחים את הצינורות microfuge על הקרח, ולהכין את תערובת התגובה הבאה (עבור התגובה μL 50): 1x Taq DNA פולימראז לערבב, 1 μg של cDNA (אשר מוכן 100 μL של נוזל קולוממית), 1 μM קדימה פריימר, 1 μM הפוכה פריימר ו nuclease מים ללא.</li>
		<li>מערבבים את תגובת ה-PCR באמצעות ליטוף וצנטריפוגה בקצרה.</li>
		<li>מניחים את צינור התגובה ב ציקלייר תרמית, ולהפעיל את ה-PCR באמצעות התנאים הבאים: דנטורציה הראשונית ב 95 ° c עבור 2 דקות ואחריו 36 מחזורים של דנטורציה ב 95 ° צ' עבור 30 s, ריפוי ב 55-60 ° c עבור 30, הארכה בשעה 72 ° צלזיוס עבור 30 ו הארכה הסופית בשעה 72 ° הערה: טמפרטורת הריפוי צריכה להיות ממוטבת לפי התחל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מוצר הטיהור והאימות של מוצרי PCR<ol>
<li>לטעון את 50 μL של התערובת PCR ישירות על 1% agarose ג'ל. הפעל את ג'ל agarose ב 150-180 V עבור 10 דקות ב 0.5 x TBE. בודד את קטעי ה-DNA הספציפיים מ 1% הצמח ג'ל. הערה: הדנ א אמור להופיע כלהקה אחת ולא ככתם.</li>
		<li>לטהר את קטעי ה-DNA באמצעות ערכת החילוץ ג'ל על פי פרוטוקול של היצרן. לכמת את המוצרים מטוהרים ידי ספקטרופוטומטר באורך גל של 260 ננומטר.</li>
		<li>בדוק את אמיתות מוצרי ה-PCR לפי רצף. הערה: (נקודת השהיה) ניתן לאחסן את מוצרי ה-PCR המטוהרים ב-20 ° c במשך מספר חודשים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סינתזה של ריבוגלימה<ol>
<li>מניחים את RNase-microfuge לשחרר את הצינורות על קרח, ולהוסיף את הבאות לצינור microfuge (עבור התגובה 10 μL): 1x Digoxygenin-RNA תיוג שילוב, 1x שעתוק מאגר, 0.5 μL של מעכבי RNase, 1 μL של T7 RNA פולימס, 1 μg של המוצר PCR ערבב את התגובה על ידי ליטוף וצנטריפוגה בקצרה. דגירה עבור 2 h ב 37 ° c.</li>
		<li>הוסף 2 μL של RNase-חינם DNase לערבב את התגובה על ידי ליטוף וצנטריפוגה בקצרה. דגירה של 15 דקות ב 37 ° c.</li>
		<li>הוסף 2 μL 0.2 M EDTA (pH 8.0). ערבב את התגובה על ידי ליטוף וצנטריפוגה בקצרה.</li>
		<li>הוסף 2.5 μL של 4 M LiCl ו 75 μL של אתנול מקורר לתגובה לעיל. . תערבב היטב השאירו 30 דקות ב-70 ° c.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. . מדקלת את האתנול הוסף 1 מ ל של מקורר 70% אתנול (v/v) ולשטוף את המשקעים על ידי ערבוב בעדינות.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. Decant 70% אתנול ויבש את המשקעים בקצרה ליד מנורת אלכוהול. מתמוסס את המשקעים על ידי הוספת 30 μL של מים ללא RNase-חינם ולערבב בעדינות.</li>
		<li>טען 2 μL של רנ א מסונתז על 1% צמח ג'ל. הפעל את ג'ל agarose ב 180 V עבור 5-10 דקות ב 0.5 x TBE. למדוד את הריכוז של ה-RNA שכותרתו באמצעות ספקטרוסקופיה באורך גל של 260 ננומטר.<ol>
<li>השימוש RNase-microfuge בחינם צינורות וטיפים מסנן כדי למנוע זיהום RNase. הערה: (נקודת הפסקה) ניתן לאחסן את הבדיקות המסומנות ב-digoxygenin-70 ° c במשך מספר חודשים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אוסף נוזלים קולאומית
<ol><li>. תקן את ס. נודוס על שולחן הניתוח עם סיכות פתח את גופתו של ה . nudus עם מספריים אוטוקליים קטנים. בודד את נוזל קולוממית עם פיפטה.</li>
	<li>לאסוף ולהעביר 1 mL הנוזל קולוממית עם פיפטה כדי פולי-D-ליזין מיקרוסקופ שקופיות. החל את הנוזל הקולאומית באופן שווה עם טיפ פיפטה. מייבשים את השקופיות ב-37 ° c.</li>
</ol>3. באתרו היברידיזציה
<ol><li>היום הראשון<ol>
<li>מימה מחדש את השקופיות בצנצנת מכתים שקופית המכילה 100 mL של מלוחים באגירה מפוספז של 1x דיאתיל פירוקרבונט (depc-PBS). מייבשים 3 פעמים עם 1 x DEPC-PBS, 5 דקות לכל כביסה עם עצבנות עדינה.</li>
		<li>החדירות הכתם של נוזל קולוממית על ידי עיכול עם 10 μg/mL פרוטטינואז K בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. מארג השקופיות ב 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) עבור 20 דקות כדי לעצור את העיכול. שטוף את השקופיות ב-1x-PBS עם עצבנות עדינה למשך 5 דקות 3 פעמים.</li>
		<li>הוסף 50 μL של תערובת היברידיזציה (HM) המכילה את הגלימה של התחושה/החושים על השקופיות והוסף תגית כיסוי.</li>
		<li>הוסף מאגר תיבות רטובות לתוך התיבה הרטובה. שים את השקופיות לתוך הקופסה רטוב לאטום היטב עם סרט פרפין. Hybridize לילה (לפחות 16 h) ב 60 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>היום השני<ol>
<li>מחממים את מאגר הכביסה ב-65 ° c. הישאב את השקופית לצנצנת המכתים שקופיות המכילה את מאגר הכביסה והעמד אותו עד להצגת השקופיות באופן אוטומטי. . זה לוקח בערך 5 דקות</li>
		<li>רוחצים 2 פעמים עם מאגר כביסה ב 65 ° c, 30 דקות לכביסה עם עצבנות עדינה. רוחצים 2 פעמים עם מלוחים של 0.2 x-נתרן ציטראט ב65 ° c, 30 דקות לכביסה בעצבנות עדינה. שטוף 2 פעמים עם מאגר חומצה מלפימית המכילה את הטמפרטורה 20 (מאבטי) בטמפרטורת החדר, 30 דקות לכביסה בעצבנות עדינה.</li>
		<li>מודיית את השקופיות בטמפרטורת החדר עבור 3 – 4 h במאגר חסימת. מודלת את השקופיות ב-1 mL anti-digoxigenin-AP שברי הפתרון מדולל ב 1/5000 עם מאגר חסימת ב 4 ° c לילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>היום השלישי<ol>
<li>הסר את פתרון הנוגדן ושטוף את השקופיות לזמן קצר ב-מאבט. שטפו 4 פעמים עם מאבט בטמפרטורת החדר, 25 דקות לכביסה בעצבנות עדינה.</li>
		<li>מודאת השקופיות עם מאגר פוספספטאז אלקליין בטמפרטורת החדר 3 פעמים, 5 דקות לכביסה. להסיר את מאגר פוספספטאז בסיסי, ולהוסיף 1 מ ל 5-bromo-4-כלורט-3-indolyl פוספט (BCIP)/ניטרו כחול הטטרזויום (NBT) כתמים הפתרון. . שמור את השקופיות בחושך</li>
		<li>שימו לב לתגובת הצבע מידי פעם תחת מיקרוסקופ אופטי. כאשר הצבע מפותח במלואו (זמן התגובה בטווח של 1-4 h), שטוף את השקופיות 2 פעמים עם מייבט בטמפרטורת החדר, 5 דקות לכביסה בעצבנות עדינה.</li>
		<li>שטוף 2 פעמים עם פתרון הפסקה בטמפרטורת החדר, 15 דקות לכביסה עם עצבנות עדינה. דגירה את השקופיות ב מתנול להסיר כתם עודף, בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות. על פי צבע הרקע, שטיפת מתנול יכול להיעשות 2 או 3 פעמים את הזמן decolorization ניתן להאריך.</li>
		<li>שטוף 2 פעמים עם מאבט בטמפרטורת החדר, 5 דקות לכביסה עם עצבנות עדינה. העבר את השקופיות לנייר סינון טרי. הוסף 50 μL של גליצרול. הוסף את הכיסויים ובדוק את המיקרוסקוזה. הערה: הרכב הפתרון מופיע בטבלה 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tsai, C. J., Harding, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).</li>
<li>Koshiba-Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+and+section+in+situ+hybridization+in+mouse+embryos+for+detecting+mRNA+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization.</a> Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).</li>
<li>Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+on+mouse+paraffin+sections+using+DIG-labeled+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wholemount+in+situ+hybridization+for+Astyanax+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).</li>
<li>Abler, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+in+situ+hybridization+method+to+characterize+mRNA+expression+patterns+in+the+fetal+mouse+lower+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).</li>
<li>Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+genetic+diversity+and+population+structure+of+Sipunculus+nudus+as+revealed+by+mitochondrial+COI+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences.</a> Biochemical Genetics. 47, 884(2009).</li>
<li>Lemer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+the+phylogeny+of+Sipuncula+through+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).</li>
<li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioprotective+effects+of+Sipunculus+nudus+L.+polysaccharide+combined+with+WR-2721%2C+rhIL-11+and+rhG-CSF+on+radiation-injured+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice.</a> Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).</li>
<li>Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+anti-nociceptive+activities+of+Sipunculus+nudus+L.+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract.</a> Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).</li>
<li>Ying, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+coelomocytes+in+the+sipunculid+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta.</a> Micron. 41, 71-78 (2010).</li>
<li>Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt1%2C+a+gene+related+to+worm+and+fly+sexual+regulators%2C+is+required+for+mammalian+testis+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation.</a> Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).</li>
<li>Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt+genes+in+the+development+and+evolution+of+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism.</a> Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).</li>
<li>Wu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+dmrt1+is+involved+in+the+sexual+fate+of+the+ovotestis+in+the+protandrous+black+porgy%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy.</a> Biology of Reproduction. 86, 41(2012).</li>
<li>Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+analysis+of+peanut+worms+transcription+factor+dmrt1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Hydrobiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1.</a> Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361(1993).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

מחקרים קודמים הראו כי איש מתאים לזיהוי מרובים rnas מטרה16,17,18. בפרוטוקול זה, תיארנו שיטת ISH ברזולוציה גבוהה כדי לאתר את ה-mRNA בנוזל הקולאומית ולהדגיש את תנאי הכלאה הממוטבים בסיפונקולוס נודוס. האותות הברורים של dmrt1 הבחנו ביישום מוצלח של פרוטוקול זה בזיהוי של ביטוי גנים (איור 2).
במהלך הניסוי, צריך להעניק לסדרה של צעדים תשומת לב מיוחדת. ראשית, תחושה ...

ISH, באמצעות בדיקה חומצה גרעין בתווית כדי לזהות את ה-DNA הספציפי או רצף RNA של עניין, היא שיטה שימושית כדי לתאר את תבנית הביטוי המרחבי של גנים היעד ברקמות שנשמרו מורפולוגית1,2,3. בדרך כלל, רצף היעד מופק על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), ולאחר מכן משמש כתבנית כדי לסנתז את antisense/תחושה RNA בדיקה מתויג עם digoxigenin uridine-5'-triphosphate. הדגימות קבועות ומופרחות לפני הדגירה. לאחר שטיפת המקדח עודף, היברידיזציה היא דמיינו על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן אנטי digoxygenin, שהוא בסיסי פוספטאז-מצומת3,4,5,6.
סיפונקולוס נודוס (מאכל שמנת; הזמנת סיקולידה: סיפונקולרוב) היא תולעת מחולקת, קומטואט ובקיעים ימית של התולעים7,8. סיפונקולוס נודוס הוא זן קוסמופוליטי המופץ באופן נרחב במימי חוף טרופיים וממוזגים. זהו גם משאב הדיג הימי החשוב בדרום סין בשל ערכי התזונה והמרפא הגבוהים שלה9,10. עם זאת, הסיפונקולוס נודוס בביולוגיה מולקולרית עדיין בחיתוליו. כדי להבין באופן מלא את התפקיד הביולוגי של הגנים, החקירה של ביטויים גנים דפוסי ברזולוציה תאית הוא מעניין מאוד. באורגניזם הלא מודל Sipunculus nudus, השיטה ISH, שהיא שיטה אידיאלית כדי לזהות את דפוסי הביטוי גנים, עדיין לא הוקם. נוזל קולאומית שלו מכיל מספר סוגי תאים, כולל גרנולוציטים, בתאי urn, תאים vesicular תאי הנבט, אריתרופוציטים, וכו '11. מין כפול/mab-3 מקדם התעתיק הקשור-1 (dmrt1), משמש כג מייצג בשיטה זו, הוא מווסת הטרנססקריפט שימור מאוד של קביעת מין ובידול ברוב המינים החל מיצורים חסרי חוליות ליונקים12,13. במגוון מינים (כלומר, פורגיה שחורה וכו ') 14, dmrt1 ביטא בתאי sertoli, סביב התאים נבטי, שתפקידם דומה לתאי הפיצוץ של סיפונקולוס nudus. לכן, אנו שיערו שdmrt1 של הסידקולוס נודוס באה לידי ביטוי בתאי הפיצוץ של spermatozeugmata, והתוצאה של שיטת ISH אישרה בבירור את ההשערה.
פרוטוקול זה בפעם הראשונה מתאר ISH, עם digoxigenin-התווית אנטי sense/תחושה mRNA, כדי לקבוע דפוסי ביטוי mRNA במכתם נוזל קולאומית שלה. תנאי התגובה האופטימליים מסופקים, המאפשרים הדמיה מאוד רגישה של ביטוי mRNA ברזולוציה גבוהה. שיטת ה-ISH המפותחת יכולה להיות מיושמת בעוד מינים של סיפונקולידה מלבד סיפנקולוס נודוס.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>Anti-digoxigenin-AP שברי Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>ערכת פיתוח צבע פוספטאז אלקליין BCIP/NBT</td><td>Beyotime</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>חומצת</td> <td>לימוןסינופארם ריאגנט כימי ושות'</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון טריסודיום</td><td>סינופארם ריאגנט כימי ושות'</td><td>4/3/6132</td><td></td></tr><tr><td>תלושי כיסוי</td><td>Beyotime</td><td>FCGF60</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד אמרסקו נטול יונים</td><td></td><td>12/7/1975</td><td></td></tr><tr><td>דיאתיל פירוקרבונט, DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>חומר מזיק</td></tr><tr><td>Digoxigenin (DIG) תערובת תיוג RNA</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNase I,</td><td>18047019</td><td></td><td></td> Invitrogen ללא RNase</tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>הדמיית ג'ל אלקטרופורזה</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood III</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סינופארם ריאגנט כימי ושות'.</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>ערכות מיצוי ג'ל</td><td>אומגה</td><td>D2500</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורזה ג'ל</td><td>בייג'ינג Liuyi Instrument Factory</td><td>DYY-6C</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות'.</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא</td><td>G5417</td><td></td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא</td><td>8/1/9041</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>סינופארם ריאגנט כימי ושות'</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma</td><td>203637</td><td></td></tr><tr><td>חומצה מאלית</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>110-16-7</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סינופארם ריאגנט כימי ושות'</td><td>67-56-1</td><td>חומר רעיל</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Biofount</td><td>JT0001</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>סרט פרפין</td> מאכל <td>חברת Bemis, Inc.</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד, PFA</td><td>סיגמא</td><td>158127</td><td>חומר מזיק</td></tr><tr><td>PCR מכשיר</td><td>חיים טכנולוגיית חיים</td><td>סיכות פרופלקס</td><td></td></tr><tr><td></td><td>מעדנייה</td><td>16</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>פלוס G</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ מטופלות פולי-D-ליזין</td><td>Liusheng</td><td>VER_A01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>SRE0005</tr><tr><td>מים ללא RNase</td><td>HyClone</td><td>SH30538. 02</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>S. nudus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום כבשים</td><td>Beyotime</td><td>C0265</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת צביעת שקופיות</td><td>Beyotime</td><td>FG010</td><td></td></tr><tr><td>קופסת אחסון שקופיות</td><td>Beyotime</td><td>FBX011</td><td></td></tr><tr><td>מספריים אוטוקלאב קטנים</td><td>Shuanglu</td><td>sku_8330</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטרים</td><td>תרמו פישר</td><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראזות</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA פולימראז תערובת (2X)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10109517001</tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>Zhengzhou Great Wall מדעי תעשייתי</td><td>HH-S2</td><td></td></tr></tbody></table>

באתרו היברידיזציה עבור סיפונקולוס נודוס מנוזל קואוממית

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

באתרו היברידיזציה (ISH) היא טכניקה מאוד אינפורמטיבי להציג דפוסי הפצה תאית של גנים ספציפיים (g., mRNA ו ncRNA) ברקמות. התולעת הסיפנעית מהווה משאב-דיג מכריע, שכן הוא בעל ערכי תזונה ומרפא גבוהים. כיום, המחקר על הביולוגיה המולקולרית של סיפונקולוס נודוס עדיין בחיתוליו. מטרת מאמר זה היא לפתח שיטה רגישה לאיתור mRNA מסוים בנוזל הסיפונקולוס nudus . הפרוטוקול כולל צעדים מפורטים של ISH, כולל digoxigenin-התווית אנטי הגיוני הכנה החלקה, לאסוף נוזלים קולוממית והכנה מקטע, הכלאה החוצה באופן ספציפי, הדגירה הנוגדן, צבע ושלאחר צבע טיפולים. תוצאות הנציג שהתקבלו מניסוי מוצלח באמצעות שיטה זו מומחש. הפרוטוקול צריך להיות רלוונטי גם. למינים אחרים של האחרים

סיכום השלבים המעורבים ב-ISH מומחש באיור 1. Antisense ואת התחושה המתאימה riboprobes עבור dmrt1 היו מסונתז מ-PCR מוצרים הוגדל מתוך cdomic נוזלים. האותנטיות של מוצרי ה-PCR אומתה באמצעות רצף ישיר. ריבוגלימות היו מסונתז באמצעות T7 RNA פולימות לפי פרוטוקולי היצרן ודוח קודם4 עם כמה שינויים משניים. האותות הנציגים של ISH מוצגים באיור 2. איש של סיפונקולוס nudus מנוזל קווממית עם הריבוכי מטרות dmrt1 מגלה מכתים סגול מרוכז בת...

פרוטוקול זה מתאר יעיל באתר היברידיזציה באתרו כדי לזהות את רמות ביטוי mRNA ודפוסי מרחבית של גנים היעד בנוזל הסיפונקולוס nuomic .

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

בהכלאה situ היא טכניקה אינפורמטיבית מאוד להציג mRNA ודפוסי ביטוי IncRNA של גנים ספציפיים ברקמות. מטרתנו במאמר זה היא לפתח שיטה רגישה לגילוי לוקליזציה mRNA ספציפי בנוזל הקולומי של עירום סיפונקולוס, שהוא משאב דיג חיוני. הצגנו את התוצאות הייצוגיות שהתקבלו מהניסויים המוצלחים שלנו באמצעות שיטה זו.יש לקוות כי השיטה שלנו תחול על מינים אחרים Sipuncula לזיהוי דפוסי הביטוי של mRNA ספציפי IncRNA בנוזל קוסמי. תקן את עירום סיפונקולוס על טבלת הניתוחים. פתח את גופו של עירום סיפונקולוס עם מספריים אוטוקלאבים קטנים.לאחר מכן לאסוף ולהעביר את הנוזל הקואלומי עם פיפטה לשקופיות מיקרוסקופ פולי-D-לינזין שטופלו, להתפשט במתינות. מייבשים את המגלשות למשך שעה ב-37 מעלות צלזיוס. לשטוף את השקופיות עם DEPC-PBS במשך שלוש פעמים, חמש דקות לכל לשטוף עם תסיסה עדינה.מסננים את ה-PBS, מוסיפים את תוסף החלבון K על השקופיות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מסננים את תסנון החלבון K. הוסף את פתרון PFA על השקופיות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.רוקן את פתרון PFA. לשטוף את השקופיות עם DEPC-PBS במשך שלוש פעמים, חמש דקות לכל לשטוף עם תסיסה עדינה. לנקז את PBS.מוסיפים 50 ריבופרוב מיקרוליטר. הוסף כיסוי. שים את השקופיות לתוך הקופסה הרטובה וחותם היטב עם סרט פרפין.הכלאה לילה ב 60 מעלות צלזיוס. טבול את השקופיות במאגר הכביסה ותן לו לעמוד עד שהכיסוי יחליק באופן אוטומטי. לשטוף את השקופיות עם חיץ לשטוף שחומם מראש במשך פעמיים ב 65 מעלות צלזיוס, 30 דקות לכל לשטוף עם תסיסה עדינה.לשטוף את השקופיות עם פתרון SSC שחומם מראש במשך פעמיים ב 65 מעלות צלזיוס, 30 דקות לשטוף עם תסיסה עדינה. לשטוף את השקופיות עם פתרון MABT פעמיים בטמפרטורת החדר. 30 דקות לשטוף בתסיסה עדינה.לנקז MABT. הוסף את מאגר החסימה. דגירה המגלשות בטמפרטורת החדר במשך שלוש עד ארבע שעות.רוקן את מאגר החסימה. מוסיפים את הנוגדן, דגירה את המגלשות בארבע מעלות צלזיוס לילה. לנקז את פתרון הנוגדנים.לשטוף את השקופיות עם פתרון MABT במשך ארבע פעמים, 25 דקות לכל לשטוף עם תסיסה עדינה. לנקז MABT. מוסיפים את מאגר הפוספטזה אלקליין במשך שלוש פעמים, חמש דקות לכל דגירה.הסר את מאגר הפוספטזה אלקליין. הוסף את פתרון הכתמים של BCIP-NBT. שמור את השקופיות בחושך.זמן הכתמים משתנה בין דקות לשעות, אפילו במהלך הלילה, מה שתלוי בעוצמת האות. יש לבדוק את מצב הכתמים בתדירות גבוהה יותר בתחילת הכתם. לדוגמה, עם מרווח של מספר דקות, וכמה שעות לכל המאוחר של הכתם.זמן הבדיקה צריך להיות קצר ככל האפשר כדי למנוע החדרת איתות רקע גבוה עקב החשיפה לאור. האותות הייצוגיים של היברידיות במקום מוצגים. בהכלאה situ של נוזל קוסמי סיפונקולוס nudus עם ריבופרוב אנטי חושי כי מטרות dmrt1 מציין כתמים סגולים מרוכזים בתאי trophoblast של spermatozeugmata, איור 2A ו B.Sense ריבופרופ עבור dmrt1 לא לזהות כל אות הכלאה, איור 2C.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה מאוד כיצד לדמיין את דפוסי הביטוי של mRNA היעד או IncRNA בנוזל הקואלומי של עירום סיפונקולוס.

in-situ-hybridization-for-sipunculus-nudus-coelomic-fluid

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים תפוקה גבוהה...

תפוקה גבוהה באתרו הכלאה שיטה לאפיון דפוסי ביטוי mRNA של העכבר עוברית בדרכי השתן ואברי המין התחתון

על ידי שילוב של כל שיטות להר...

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

מטרת פרוטוקול זה היא לספק למשתמשים סט של שיטות לפירוק קפסולציה בתפוקה גבוהה של עוברים וזחלים של Lymnaea stagnalis כהכנה להכלאה שלמה באתר, ולטיפולים הבאים לפני ואחרי הכלאה.

הר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; כלת שיטה עבור חלזון הרכיכות<em&gt; Stagnalis Lymnaea</em

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך במרחב של חנותם הנוכחות של קיימא microbiota במעיים שנתות תוך שימוש בגישה שונה כולה-הר היברידיזציה.

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

המטרה של פרוטוקול זה היא לבצע הכלאה בחיי עיר על דגימות אלמוגים מבוגרים שמוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. זוהי שיטה איכותי המשמש כדי להמחיש את הביטוי המרחבי לווין אנטי-חוש RNA ברקמות פרפין-מוטבע.

בחיי עיר טכניקות הכלאה פרפין-מוטבע דגימות אלמוגים למבוגרים

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של ביטוי גנים בעובריים Astyanax cavefish. גישה זו פותחה במטרה למקסם את אות של ביטוי גנים, תוך מזעור צביעת הרקע לא ספציפית.

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

דג הזברה הוא מודל חשוב להבנת התפתחות הכליות. כאן, פרוטוקול הכלאה במקום מותאם כדי לזהות ביטוי גנים בזחלי דגי זברה וצעירים במהלך פיתוח mesonephros.

בסיטו הכלאה בזחלי זברה וצעירים במהלך פיתוח מסונפרוס

חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

תאי T ו-ILC2 המבטאים IL-9 מושרים במהלך זיהום ב-N. brasiliensis , אך האפיון שלהם התעלם במידה רבה במעי הנגוע בשל התדירות הנמוכה והקינטיקה הדיפרנציאלית שלהם. פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאים אלה מאיברי מטרה שונים ואישור זהותם באמצעות ציטומטריית זרימה בשלבי זיהום שונים.

אסטרטגיה לחקר תאי לימפה מייצרי IL-9 במודל זיהום Nippostrongylus brasiliensis

כאן אנו מתארים פרוטוקול להדמיית תאים מתרבים דמויי גזע במדוזה Cladonema. הכלאה פלואורסצנטית שלמה באתרה עם סמן תאי גזע מאפשרת זיהוי של תאים דמויי גזע, ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין מאפשר זיהוי של תאים מתרבים. יחד, ניתן לזהות תאים דמויי גזע המתרבים באופן פעיל.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה ותיוג 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין לתאים דמויי גזע במדוזה הידרוזואנית Cladonema pacificum

למדו שיטת היברידיזציה in situ לזיהוי mRNA בנוזל הקואוממית של Sipunculus nudus. השיטה מאפשרת הדמיית ביטוי גני dmrt1 בתאי טרופובלסט ומסייעת בחקר ביולוגיה מולקולרית ביצורים ימיים.

באתרו היברידיזציה עבור סיפונקולוס נודוס מנוזל קואוממית

גלה סרטונים נוספים