Name: מדידת רעילות ב -C. אלגיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: חקור רעילות פפטידים מסוג RAN במחלות ניווניות עצביות באמצעות Caenorhabditis elegans. השיטה כוללת מבחני התנהגות ותאיים לכימות השפעות רעילות ולזיהוי גנים מכוילים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH R21NS107797

<ol><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+associated+non-ATG+%28RAN%29+translation%3A+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li>
<li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li>
<li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+address%2C+g.+h.+m.+h.+e.%2C+Genetic+Modifiers+of+Huntington%27s+Disease%2C+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington%27s+Disease+Onset%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li>
<li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length+of+Uninterrupted+CAG%2C+Independent+of+Polyglutamine+Size%2C+Results+in+Increased+Somatic+Instability%2C+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li>
<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat-associated+non-ATG+%28RAN%29+translation+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li>
<li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat-associated+non-AUG+%28RAN%29+translation%3A+insights+from+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li>
<li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAN+Translation+in+Huntington+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li>
<li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li>
<li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li>
<li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877(2016).</li>
<li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li>
<li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li>
<li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly%2C+Dynamics%2C+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li>
<li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906(2019).</li>
<li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87(2011).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li>
<li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399(2009).</li>
<li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li>
<li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li>
<li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494(2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li>
<li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li>
<li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li>
<li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li>
<li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li>
<li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+auxin-inducible+degradation+%28AID%29+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן אנו מדווחים על שיטות שניתן להשתמש בהן כדי לעצב את הרעילות של פפטיד המודל בשריר או בנוירונים של ג. אלגיה. בעוד חלבונים נוירוניווניות יש הופעת גיל פנוטיפ בחולים אנושיים, הם יכולים גם להפגין רעילות מנטלית כאשר מתבטאת במערכות מודל. ביטוי יתר יש מגבלות הפרשנות משמעותי, אבל זה גם מספק נקודת התחלה רבת עוצמה עבור מסכי גנטיות או תרופתי מכוון לזהות גנים או תרופות שיכולות להפוך פנוטיפים רעילים. זה חשוב במיוחד בהתחשב ביותר מודלים בעלי חיים מדויקים של מחלות יש או לא פנוטיפ או פנוטיפים חלשים לא מתאים ההקרנה משוחדת גישות<s...

ההתרחבות הבלתי הולמת של רצפים חוזרים DNA הוא הבסיס הגנטי עבור מחלות ניווניות מספר כגון טרשת amyotrophic לרוחב (ALS), דמנציה הפרופנטיסטית (FTD), ו מחלת הנטינגטון (HD)1. בעוד יש מבוססים מודלים סלולריים ובעלי חיים עבור מחלות אלה, מנגנונים המשמשים את התנאים הללו אינם מוגדרים היטב. לדוגמה, HD נגרמת על ידי הרחבות של רצף החזרה של הקאג ברצף הקידוד של החלבון Htt2. כי הקאג מקודד את החומצה האמינית גלוטמין, התרחבות חזרה הקאג התוצאות בהוספה של polyglutamine, או polyglutamine, רצף בתוך htt. מורחבת חלבונים polyglutamine הטופס באורך והגיל מצרפים מזיבי החלבון המשויכים רעילות3,4. למרבה ההפתעה, שני מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי אורכו של רצף polyq הוא לא הנהג העיקרי של התפתחות HD מחלה, מציע כי גורמים בלתי תלויים polyq עשוי גם לתרום למחלה5,6.
אחד אפשרי polyQ המנגנון העצמאי כולל סוג חדש של תרגום חלבון כינה REpeat aSSOCIATED NON-אוג-תלוי (רן) תרגום7. כפי ששמה מרמז, תרגום רן מתרחש רק כאשר קיים רצף חוזר מורחב ואינו דורש התחלה קאנונית. לכן, תרגום רן מתרחש בכל שלושת מסגרות הקריאה של החזרה כדי לייצר שלושה פוליפפטידים ברורים. בנוסף, מכיוון שגנים רבים מייצרים גם תעתיק אנטי-חוש המכיל את ההשלמה ההפוכה של רצף החזרה המורחב, תרגום הראן מתרחש גם בכל שלושת מסגרות הקריאה של התעתיק האנטי-הגיוני. יחד, תרגום רן מרחיב את מספר החלבונים המיוצרים מתוך רצף מורחב חוזר המכיל DNA מ פפטיד אחד עד שישה פפטידים. עד כה, תרגום רן נצפה בלפחות שמונה הפרעות חוזרות שונות של התרחבות8. פפטידים הרצתי נצפו בדגימות המטופל שלאחר המוות ורק במקרים שבהם המטופל נושא חזרה מורחבת9,10. בעוד פפטידים אלה נמצאים בבירור בתאי החולה, תרומתם למחלות פתופסיולוגיה אינה ברורה.
כדי להגדיר טוב יותר את הרעילות הפוטנציאל הקשורים עם הפפטידים RAN, מספר קבוצות הביעו כל פפטיד במערכות מודל שונות, כגון שמרים, זבובים, עכברים, והתרבות רקמות תאים11,12,13,14,15,16. במקום להשתמש ברצף החזרה של הביטוי, מודלים אלה מעסיקים גישה מקודון וריאציה שבה רצף החזרה מסולק, אך רצף חומצת האמינו נשמר. החניכה בתרגום מתרחשת באמצעות ATG קאנונית והפפטיד בדרך כלל מותכות לחלבון פלורסנט ב-N-או C-טרמינוס, שאף אחד מהם אינו מפריע לרעילות ה-RAN. לכן כל אחד מהמבנה מבטא פפטיד בודד. מידול מוצרים שונים של RAN באורגניזם משני עם בחני פשוטה למדוד רעילות הפפטיד של הראן הוא החשוב ביותר כדי להבין כיצד מוצרי RAN שונים של כל מחלה-גרימת התרחבות חוזרת לתרום לתפקוד התאי וניוון המוח.
כמו מערכות מודל אחרות, C. אלגיה מספקת פלטפורמה ניסיונית גמישה ויעילה המאפשרת מחקרים של מנגנוני מחלה חדשים, כגון רעילות של מחלות מסוג RAN. תולעים מציעות מספר תכונות נסיוניות ייחודיות שאינן זמינות כרגע במודלים אחרים של הרעלת פפטיד בראן. ראשית, הג הם שקופים מהלידה עד המוות. זה מאפשר הדמיה פשוטה של ביטוי פפטיד ולוקליזציה של הראן, כמו גם בניתוח vivo של ניוון מוחי בבעלי חיים חיים. שיטות שניות ליצירת מודלים של ביטוי פפטיד בשיטת RAN הם זולים ומהירים. בהינתן מחזור החיים הקצר של שלושה ימים של C. אלגיה, קווים טרנסגניים יציבים המבטא כל פפטיד RAN נתון בצורה מסוימת של סוג תא ניתן לייצר בתוך פחות משבוע. שלישית, פלטי פנוטים פשוטים יכולים להיות משולבים עם שיטות סינון גנטי, כגון מוטזיס כימי או הקרנת RNAi, כדי לזהות במהירות גנים חיוניים של הרעלת פפטיד בראן. לבסוף, תוחלת החיים הקצרה של הג (~ 20 יום) מאפשרת לחוקרים לקבוע את מידת ההזדקנות, שהיא גורם הסיכון הגדול ביותר למחלות התרחבות חוזרות ומחלות, השפעות רעילות מהפפטיד. יחד, שילוב זה של מאפיינים ניסיוניים הוא ללא תחרות בכל מערכת מודל אחרת והוא מציע פלטפורמה רבת עוצמה לחקר רעילות פפטיד בראן.
כאן אנו מתארים מספר שאומר כי למנף את היתרונות הניסיוניים של C. אלגיה כדי למדוד את הרעילות של פפטידים בראן ולזהות מכפילי גנטי של רעילות זו. Codon-מגוון מגוונת ATG-פפטידים רץ מתויגים עם GFP והביע בנפרד בתאי שריר תחת מקדם myo-3 או בנוירונים מוטוריים GABAergic תחת unc-47 יזם. לביטוי בתאי שריר, חשוב כי הפפטידים רץ רעילים מתויגים עם חלבון פלורסנט ירוק (GFP), או חלבון פלורסנט אחרים (FP) תג כי ניתן לפלח עם וקטור האכלה RNAi. הסיבה לכך היא ביטוי ביטויים רעילים מסוג RAN בדרך כלל חוסם את הצמיחה, עיבוד זנים כאלה ללא קיימא. השימוש gfp (RNAi) מותנית בביטוי פפטיד ביטוי מאפשר מאמץ, צלבים גנטיים, וכו '. עבור assays בעלי חיים אלה יוסרו gfp (RNAi), אשר מאפשר ביטוי של הפפטיד RAN ואת הפנוטיפים כתוצאה מכך. בנוסף לאסטרטגיה המולקולרית לעיצוב מבני ביטוי מגוונים בעלי מגוון של מבנים, אנו מתארים את הנושא למדידת רעילות התפתחותית (הזחל ושיטת הצמיחה), הרעילות לאחר גיל התפתחותי (שיטת שיתוק), ומומים מורפולוגיים (מזנון בטוח).

<table><tbody><tr><td>צלחת פטרי 35 מ"מ x 10 מ"מ,</td><td>מוצרים מדעיים סטריליים CELLTREAT</td><td>50-202-036</td><td>לוחות גידול נמטודות</td></tr><tr><td>ומערכות אבחון</td><td></td> BD<td>מגורענות RNAi AGAR 2 קילוגרם</td> DF0145070 <td>לוחות גידול נמטודות וטכנולוגיות חיים רנאי</td></tr><tr><td>אגרוז אולטרה-טהורים</td><td></td><td></td> 16500500 <td>מיקרו-הזרקה ליצירת זנים טרנסגניים של פפטיד RAN</td></tr><tr><td>קרבניצילין 5G</td><td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td><td>BP26485</td><td>צלחות גידול נמטודות</td></tr><tr><td>ומשקפיים לכיסוי RNAi מס' 1 22 מ"מ 1OZ/PK</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>12542B</td><td>הדמיה לבדיקת קומיסורה</td></tr><tr><td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td><td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td> E5242952008 <td></td><td>מיקרו-הזרקה ליצירת זנים טרנסגניים של פפטיד RAN</td></tr><tr><td>FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK</td><td>THERMO SCI</td><td>ERIE 125485C</td><td>מיקרו-הזרקה ליצירת זנים טרנסגניים של פפטיד RAN</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; שקופיות מיקרוסקופ Superfrost Plus</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>12-550-15</td><td>הדמיה לבדיקת קומיסור</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; בקטו פפטון&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td>DF0118-17-0</td><td>לוחות גידול נמטודות ושמן RNAi</td></tr><tr><td>HALOCARBON 700</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>H8898-50ML</td><td>מיקרו-הזרקה ליצירת זנים טרנסגניים של פפטיד RAN</td></tr><tr><td>IPTG BIOTECH 10G</td><td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td><td></td> BP162010 <td>לוחות גידול נמטודות ותוכנת הדמיה פלואורסצנטית מתקדמת של RNAi</td></tr><tr><td>Leica Leica Microsystems</td><td></td><td>LAS-AF</td><td>תוכנת רכישת תמונות לניתוח מהירות וידאו ובדיקת קומיסורה</td></tr><tr><td>Leica טבילה מסוג N (שמן)</td> <td>W NUHSBAUM INC</td><td></td> NC9547002 <td>הדמיה לבדיקת קומיסורה</td></tr><tr><td>LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR</td><td>THERMO SCI ACROS ORGANICS</td> AC187870100 <td></td><td>הדמיה לבדיקת קומיסורה</td></tr><tr><td>טיפים למיקרו-מעמיס 2 X 96 יחידות</td><td>EPPENDORF צפון אמריקה BIOTOOLS</td><td></td> <td>E5242956003מיקרו-הזרקה ליצירת זנים טרנסגניים של פפטיד RAN</td></tr> <tr><td> צלחת פטרי, 60X15 מ"מ, 500/CS</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td></td><td>פלסטיק FB0875713A לוחות גידול נמטודות</td></tr><tr><td>וצלחת פולחן רקמות RNAi 24WEL 50/CS</td><td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td><td>87721</td><td>לוחות גידול נמטודות ו-RNAi</td></tr></tbody></table>

מדידת רעילות ב -c. אלגיה

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

ג. אלגיה משמש בדרך כלל למודל מחלות ניווניות הקשורות לגיל הנגרמת על ידי מוטציות התרחבות חוזרות, כגון טרשת Amyotrophic לרוחב (ALS) ומחלת הנטינגטון. לאחרונה, חזרה על הרחבה המכילה RNA הוכח להיות מצע עבור סוג הרומן של תרגום חלבון שנקרא לחזור על-ידי הקשורים לא אוגוסט תלוי (רן) תרגום. בשונה מתרגום קאנוני, תרגום רן אינו דורש התחלה של מפעיל ומתרחש רק כאשר החזרה עולה על אורך הסף. מכיוון שאין להתחיל קודון לקבוע את מסגרת הקריאה, תרגום RAN מתרחשת בכל מסגרות הקריאה מתוך הגיון ואנטי היגיון תבניות RNA המכילות רצף הרחבה חוזרת. לכן, תרגום הראן מרחיב את מספר הפפטידים האפשריים הקשורים למחלות רעילות מאחד לשש. עד כה, התרגום של רן תועד בשמונה שונות של התרחבות ומחלות נוירוניווניות המבוססות על הרחבה. בכל מקרה, פענוח אשר מוצרי ראן רעילים, כמו גם מנגנוני רעילות שלהם, הוא צעד קריטי לקראת הבנה כיצד אלה פפטידים לתרום פתופסיולוגיה המחלה. במאמר זה, אנו מציגים אסטרטגיות כדי למדוד את רעילות של פפטידים RAN במערכת דגם C. אלגיה. ראשית, אנו מתארים הליכים למדידת רעילות של מבני רן על הצמיחה והתנועתיות של התפתחות C. אלגיה. שנית, אנו מפרטים את התשובה למדידת ההשפעות ההתפתחותיות, התלויות בגיל של פפטידים של RAN בתנועתיות. לבסוף, אנו מתארים שיטת רעילות עצבית להערכת ההשפעות של פפטידים בראן על מורפולוגיה של תא העצב. מספר זה מספק הערכה רחבה של רעילות בתלת-המידה של פפטיד, ועשוי להועיל לביצוע מסכי מולקולות גנטיות או קטנות כדי לזהות מנגנוני מחלות או תרפיות.

השתמשנו בספר שמתואר כאן כדי להעריך את ההשפעה של מעצורים גנים שונים על רעילות של dipeptides RAN שנמצאים בחולים ALS עם G4C2 הרחבה חוזרת. באמצעות שיטת הצמיחה כדי למדוד רעילות התפתחותית, ניתחנו את ההשפעות של מוטציות הסתרה גנטית מספר מזוהה הגנום רחב RNAi דכאי מסך של השריר הביע הרעלת PR50-GFP. בעוד הביטוי של PR50-GFP לבדו הביא למעצר גדילה לחלוטין החדירה, אובדן של מוטציות פונקציה במספר גנים דיכאו רעילות התפתחותית PR מ 12-94% (איור 1A).
כמו כן, מדדנו...

מוצרי העברה שאינם תלויי ATG הקשורים לחזרה מתגלים כתכונות פתוגניים של מחלות מבוססות הרחבה חוזרות. מטרת הפרוטוקול המתואר היא להעריך רעילות הנגרמת על ידי פפטידים אלה באמצעות בחני התנהגות הסלולר מערכת המודל C. אלגיה.

מדידת רעילות ב -C. אלגיה

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

פפטידים RAN הם תכונה של הפרעות נוירודגנרטיביות התרחבות חוזרת כגון מחלת הנטינגטון, טרשת נפוצה צידית amyotrophic, דמנציה frontotemporal. פרוטוקולים אלה מספקים גישה מתוקקנת חשובה לכימות רעילות פפטיד RAN במערכת המודל C.elegans. הטכניקות המתוארות הן פשוטות ללמוד וזול, ניתן לבצע במהירות, למנף את התכונות לשחזור של מערכת C.elegans כגון תנועה ורבייה.בעת ניסיון פרוטוקול זה, האתגר העיקרי הוא להשיג רעילות פפטיד רן עקבי וביטוי. הגורמים העיקריים לשליטה כוללים טמפרטורת סמים, תזמון של משמרות טמפרטורה והכנת צלחות מבדיקת. חשוב לניסויים לסווג באופן עקבי את הפנוטיפים של בעלי החיים בתהליך תלוי גיל זה.הדגמה חזותית של טכניקה זו מציגה את קריטריוני הסיווג שלהם. התחל על ידי שפיכת בינוני צמיחה nematode סטנדרטי עם IPTG מילימולר אחד ו 25 מיקרוגרם לכל קרבניצילין מיליליטר לתוך צלחות 24 באר. פס החוצה שיבוטים האכלה RNAi בחיידק HT115 על LB קרבניצילין אגר ולגדל אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.למחרת, לבחור מושבה אחת לתוך מיליליטר אחד של מדיה נוזלית קרבניצילין LB ולגדל את החיידקים במשך 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 250 סל"ד. ספוט ארבע בארות בודדות של צלחת NGM RNAi 24 באר עם 20 microliters של תרבויות חיידקיות לילה כמתואר בכתב היד טקסט ולאפשר חיידקים RNAi לגרום ייצור RNA תקוע כפול בן לילה. השתמש בשיטת ההיפוכלוריט הסטנדרטית כדי לבודד ביצים מהיום הראשון C.elegans בוגר המבטא את טרנסגן פפטיד RAN משולב.ואז לזרוע כ 30 ביצים לתוך כל באר של צלחת 24 היטב דגירה את הצלחת ב 20 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים. כדי לבצע ניתוח מהירות וידאו, לרכוש שני קטעי וידאו משתי בארות נפרדות עבור כל מצב RNAi באמצעות מיקרוסקופ ניתוח סטריאו מצויד במצלמת מונוכרום. הקפד להשתמש בהגדרות רכישה עקביות בין בארות.עבור כל סרטון, הגדר את משך הזמן למשך 10 שניות ואת מרווח הזמן ל- 76 אלפיות שניה. הגדר את זמן החשיפה לתמונה לארבע אלפיות שניה ולהשתמש בהגדרת גודל התצוגה של 1.49. לאחר מכן בחר שניים על-ידי שני binning.ודא שהרזולוציה היא 800 על 600 פיקסלים והתחל להקליט. לאחר הרכישה, תייג כל סרטון מיד עם המתח, מצב RNAi ומספר טוב. לאחר מכן למדוד את המרחק נסע ואת האורך של כל בעל חיים עבור 20 בעלי חיים שונים לכל וידאו, בוחן בסך הכל כ 40 תולעים עבור כל מצב RNAi.בתוכנה, בחר בלחצן כלי ביאור. לאחר מכן, כלי ציור הטקסט. לחץ על נקודה במרכז התולעת הנמדדת במסגרת הראשונה של הווידאו וסמן אותה במספר.קדם את הווידאו עד הסוף תוך מעקב חזותי אחר התולעת. לאחר מכן לחץ על זה ולסמן אותו עם המספר המתאים הבא. השתמש בכלי סרגל קנה המידה של ההגרלה כדי לצייר קו מהמספר הראשון למספר השני ולתרשם את המרחק שנסע בגיליון אלקטרוני.חזור על מדידה זו עבור 19 תולעים אחרות בסרטון תוך שמירה על כל מדידה בודדת בחלון הניתוח. לאחר השלמת המדידות, צלם תמונה של מסגרת הווידאו הסופית הממחישה את כל קווי המדידה כך שניתן יהיה לעקוב אחר הנתונים בחזרה אל החיה שממנה היא נוצרה. לאחר מכן, נתח את הנתונים באמצעות גיליון אלקטרוני בן ארבע עמודות שבו עמודה אחת היא מזהה התולעת ועמודה 2 היא המהירות.הזמן של כל סרטון ניתן למצוא על ידי לחיצה ימנית על הווידאו תחת הניסוי והולך אל המאפיינים. כדי לנרמל את מדידת המהירות, מצא את האורך של כל חיה. השתמש בכלי לצייר polyline כדי לעקוב בחופשיות C.elegans מקץ הראש לקצה הזנב.לאחר מכן צלם תמונה של מסגרת הווידאו הסופית הממחישה את כל הפוליקווים. אורך השורות יירשם תחת סטטיסטיקה. הוסף שתי עמודות לגיליון האלקטרוני, אחת עבור אורך בעלי חיים אחת עבור מהירות מנורמלת.לבסוף, לנתח את נתוני מהירות מנורמל באמצעות ANOVA חד כיוון עם בדיקות שלאחר hoc לעומת RNAi וקטור ריק. מניחים ארבעה עד שישה L4 C.elegans מהונדסים המבטאת רן פפטיד GFP על צלחת GFP RNAi שישה סנטימטרים ולגדל אותם ב 20 מעלות צלזיוס. אם הניסוי הוא ניצול RNAi כדי לבדוק השפעות גנטיות על רעילות פפטיד RAN, להעביר 10 מבוגרים gravid מהונדסים לכל אחד משני וקטור ריק RNAi GFP RNAi או גנים ספציפיים RNAi צלחות.אם מוטנטים משמשים לניתוח השפעות גנטיות על רעילות פפטיד RAN, מקום 10 סוג בר gravid או בעלי חיים מוטנטים המבטאת את אותו טרנסגן RAN על כל אחד משני צלחות RNAi וקטור ריק או GFP RNAi. לגדל אותם ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. בחרו 10 סטים של 10 L4s מהוססים מצלחות ה-RNAi והמקמו כל סט על צלחת RNAi באורך 3 ס"מ.ודא כי התולעים שנבחרו להסקה כל יש תנועתיות נורמלית שטחית. מניחים את הצלחות בשקית ניילון כדי לשמור על לחות ולהדיר אותם ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, לנתח את בעלי החיים לניידות על ידי הקשה על הצלחות על מיקרוסקופ ניתוח ובדיקת תנועה.אם תולעת נעה יותר מאורך גוף, ספור אותה כניידת והעבר אותה לצלחת RNAi חדשה באורך 3 ס"מ. השתמש בבחירה פלטינה כדי להקיש על התולעים הנותרות על הראש והזנב. אם החיה נעה יותר מאורך גוף, לספור את החיה כמו נייד ולהעביר אותו צלחת RNAi שלושה סנטימטר חדש.אם שיתוק משמעותי אינו נצפה בשליטה הווקטורית הריקה עד היום השני, לסיים את ההסקה ולהתחיל מחדש. קבץ את כל התולעים שאינן זזות יחד, כך שניתן יהיה לזהות בקלות תנועה של יותר מאורך גוף. לספור את כל משותק, ארז, או תולעים מתות ולהשליך את הצלחת.המשך להבקיע את בעלי החיים לשיתוק כל יום במשך חמישה עד שבעה ימים. בדיקת הצמיחה שימשה למדידת ההשפעה של עכבות גנים על הרעילות של דיפפטידים RAN שנמצאים בחולים ALS עם התרחבות חוזרת G4C2. ביטוי של PR50 GFP לבדו הביא למעצר צמיחה מוחלט, אבל הפלה של כמה גנים דיכאה את הרעילות ההתפתחותית.ההשפעה של הפלות גנים ספציפיות על תנועתיות ההתפתחותית של PR50 המבטאת בעלי חיים נמדדה בשיטת ניתוח מהירות הווידאו. כצפוי, עיכוב של ביטוי PR50 GFP הביא לעלייה גדולה בהנעה בהשוואה לווקטור ריק RNAi. יתר על כן, RNAi נגד RPN7 תת-כוח proteasome הביא לעלייה משמעותית תנועתיות PR50.כאשר פנוטיפים בוגרים נותחו עם הראיה שיתוק תלוי גיל, PR50 GFP הציג עד 80% שיתוק על ידי חמישה ימים של גיל. עם זאת, RNAi מכוון לגן cul-6 עיכוב משמעותי שיתוק רומז כי cul-6 נדרש עבור רעילות PR50 GFP. כדי לקבוע אם חלבוני RAN גורמים לנוירופתולוגיה כאשר הם באים לידי ביטוי בנוירונים C.elegans, רעילות ספציפית לנוירונים נבדקה באמצעות בדיקת הקומיסר.ביום שני מבוגרים, ביטוי PR50 GFP בנוירונים המוטוריים הוביל לעלייה משמעותית בפענון הנוירונים המוטוריים. נוירופתולוגיה זו דוכאה באופן משמעותי על ידי מוטציה בגן קולטן IGF אינסולין הומולוג DAF-2 אשר מעכב את המאפיינים הרעילים של מספר חלבונים ניווניות. לצורך ההתרפסות ההתנהגותית, חשוב כי פפטידים RAN לייצר פנוטיפ חודר מאוד.גנים או תרופות כאלה יכולים לספק סמנים ביולוגיים חדשים או אפשרויות טיפוליות למחלות פפטיד רן. באמצעות בדיקות אלה, ביצענו מסך RNAi כלל-גנום עבור מדכאי C9ORF72 הקשורים RAN פפטיד פרולין-ארגנין. גנים שזוהו במסך זה כוללים גנים חדשים ו שמורים רבים שיהיו נושא למחקרים מכניים עתידיים.

measuring-ran-peptide-toxicity-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם

סרטון זה מציג בדיקת הישרדות לטווח קצר שבודקת טיפול ברעילות חריפה או בודקת זן גנטי לעמידות למצב רעיל. הפרוטוקול לדוגמה מציג בדיקת הישרדות לדוגמה שבה תולעים נבדקות על יכולתן להתנגד לעקה חמצונית הנגרמת על ידי פרקוואט (PQ).

ג. אלגנס בדיקת הישרדות: מבחן רעילות לטווח קצר

התפשטות דמוית פריון של אגרגטים חלבוניים התגלתה לאחרונה כמעורבת במחלות ניווניות רבות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש בנמטודה C. elegans כמערכת מודל לניטור התפשטות חלבון ולחקירת תופעות דמויות פריון.

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

אנו מתארים את השלבים המפורטים של בדיקה כימית בעלת תפוקה גבוהה בנמטודה Caenorhabditis elegans המשמשת להערכת רעילות קו הנבט. בבדיקה זו, הפרעה בתפקוד קו הנבט בעקבות חשיפה לכימיקלים מנוטרת באמצעות מדווח פלואורסצנטי ספציפי לעוברים אנופלואידים.

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

פרוטוקול בסיסי כדי להעריך את הרעילות של כימיקלים חיית מודל, Caenorhabditis elegans, מתואר. השיטה זו נוח ושימושי עבור הפיתוח של תרופות כמו גם באשר הערכת הסיכונים של מזהמים סביבתיים שונים.

מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans

שיטה כמותית פותחה כדי לזהות ולחזות את רעילות חריפה של כימיקלים על-ידי ניתוח באופן אוטומטי את פרופיל פנוטיפי של Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מתאר כיצד להתייחס תולעים עם כימיקלים בצלחת 384-ובכן, לכידת וידאו, לכמת פנוטיפים קשורים רעילות.

וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מאפיינים את התגובות הסלולר מדגיש התגובה התאית ב-נמטודות C. אלגיה על ידי מדידת ההפעלה של כתבים פלורסנט ההמרה ולומר רגישות ללחץ פיזיולוגי.

מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת הפעילויות הנוירו-הגנתיות של תרכובות בדיקה ב - Caenorhabditis elegans, כולל צבירה של פוליגלוטמין, מוות עצבי והתנהגות כימואבואידית, כמו גם שילוב מופתי של פנוטיפים מרובים.

Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לגילוי תרכובות ביו-אקטיביות נגד רעילות עצבית בתיווך פוליגלוטמין

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקה לקביעת התגובה ללבמיזול, אגוניסט פרמקולוגי של סוג אחד של קולטני אצטילכולין Caenorhabditis elegans . במבחן השחייה הנוזלי הזה, החוקרים מתבוננים באופן חזותי ומכמתים את השיתוק תלוי הזמן של בעלי חיים המעובדים בצלחות של 24 בארות.

מדידת רגישות Caenorhabditis elegans לקולטן אצטילכולין אגוניסט לבאמיזול

חקור רעילות פפטידים מסוג RAN במחלות ניווניות עצביות באמצעות Caenorhabditis elegans. השיטה כוללת מבחני התנהגות ותאיים לכימות השפעות רעילות ולזיהוי גנים מכוילים.

מדידת רעילות ב -C. אלגיה

גלה סרטונים נוספים