Name: פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: למדו את שיטת HDX-MS לניתוח דינמיקת קונפורמציה של אנזימים ביוסינתטיים פפטידיים. טכניקה זו מאפשרת זיהוי אזורים פונקציונליים חשובים בתנאים קרובים לטבעיים ללא צורך בסימון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה לחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה, פונדס דה Recherche du Quebec Nature et Technologie, הקרן הקנדית לחדשנות, וקרנות הזימון של אוניברסיטת מקגיל.

<ol><li>Karplus, M., McCammon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dynamics+simulations+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular dynamics simulations of biomolecules.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).</li>
<li>Campbell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+dynamics+in+the+evolution+of+new+enzyme+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).</li>
<li>Tokuriki, N., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamism+and+evolvability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Protein dynamism and evolvability.</a> Science. 324 (5924), 203-207 (2009).</li>
<li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).</li>
<li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224(2011).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214(1991).</li>
<li>Zhang, Z., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+amide+hydrogen+exchange+by+mass+spectrometry%3A+a+new+tool+for+protein+structure+elucidation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation.</a> Protein Science. 2 (4), 522(1993).</li>
<li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li>
<li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).</li>
<li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+architecture+of+protein+complexes+by+an+orthogonal+approach+combining+HDXMS%2C+CXMS%2C+and+disulfide+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).</li>
<li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li>
<li>Masson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+performing%2C+interpreting+and+reporting+hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+%28HDX-MS%29+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments.</a> Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Site-Specific+Method+for+Irreversible+Covalent+Labeling+of+Proteins+with+a+Fluorophore%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore.</a> Scientific Reports. 5, 16883(2015).</li>
<li>Marion, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+overlap+problem+in+the+assignment+of+proton+NMR+spectra+of+larger+proteins+by+use+of+three-dimensional+heteronuclear+proton-nitrogen-15+Hartmann-Hahn-multiple+quantum+coherence+and+nuclear+Overhauser-multiple+quantum+coherence+spectroscopy%3A+application+to+interleukin+1.beta%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta.</a> Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).</li>
<li>Balasubramaniam, D., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+intrinsic+disorder+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Goswami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+window+expansion+for+HDX+analysis+of+an+intrinsically+disordered+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).</li>
<li>Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Unstructured+Regions+and+Synergistic+Folding+in+Intrinsically+Disordered+Proteins+with+Amide+H%2FD+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).</li>
<li>Mitchell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+and+Conformational+Analysis+of+the+Herpesvirus+saimiri+Tip-C484+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein.</a> Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).</li>
<li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+with+top-down+electron+capture+dissociation+for+characterizing+structural+transitions+of+a+17+kDa+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).</li>
<li>Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Dynamic+Structural+Properties+of+a+Lanthipeptide+Synthetase+using+Hydrogen-Deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).</li>
<li>Hebling, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li>
<li>Duc, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+application+of+bicelles+for+conformational+analysis+of+G+protein-coupled+receptors+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).</li>
<li>Canul-Tec, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+allosteric+inhibition+of+excitatory+amino+acid+transporter+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1.</a> Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).</li>
<li>Reading, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+Membrane+Protein+Conformational+Dynamics+within+Native+Lipid+Compositions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).</li>
<li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50839(2013).</li>
<li>Lento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+ElectroSpray+Ionization+Hydrogen-deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry+for+Studying+Protein+Structure+and+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).</li>
<li>Schowen, K. B., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+isotope+effects+on+enzyme+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Solvent isotope effects on enzyme systems.</a> Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).</li>
<li>Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deuteros%3A+software+for+rapid+analysis+and+visualization+of+data+from+differential+hydrogen+deuterium+exchange-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).</li>
<li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071(2011).</li>
<li>Burkitt, W., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).</li>
<li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li>
</ol>

אין לנו מה לחשוף.

זרימת העבודה HDX-MS המוצגת בפרוטוקול זה מספקת פלטפורמה איתנה להפליא למיפוי ההתפלגות המרחבית של אלמנטים דינמיים מבנית בחלבונים ולחקור כיצד דינמיקות אלה משתנות בתגובה לטריאבינציה (קשירה ליגנד, מוטגנזיס אנזים וכו '). HDX-MS מחזיק במספר יתרונות ברורים על פני גישות ביולוגיות מבניות אחרות המשמשות בדרך כלל לחקר הדינמיקה הקונפורמית. בעיקר, רק כמויות קטנות של חלבון נדרשים. באמצעות זרימת העבודה המתוארת במסמך זה, מדגם של 1 מ"ל של חלבון μM אחד מספק מספיק חומר לתגובות HDX משולשות שכל אחת מהן מכילה 5 נקודות זמן החלפה. יתר על כן, אין כ...

חלבונים הם מולקולות דינמיות מבחינה מבנית המדגמות קונפורמציות שונות על סולמות זמן החל רטט קשר בקנה מידה femtosecond כדי סידור מחדש של תחומי חלבון שלמים אשר יכול להתרחש על פני שניות רבות1. תנודות קונפורמיות אלה הן לעתים קרובות היבטים קריטיים של תפקוד האנזים/חלבון. לדוגמה, שינויים קונפורמיים הנגרמים על ידי קשירה ליגנד הם לעתים קרובות חשובים ביותר עבור מידול תפקוד האנזים, או על ידי ארגון שאריות אתר פעיל הדרושות לקטליזה, הגדרת אתרי איגוד מצע במנגנונים קינטיים רציפים, הגנה על ביניים תגובתיים מהסביבה, או על ידי היפוך פונקציית האנזים באמצעות רשתות allosteric. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו גם כי ניתן לשמר דינמיקה קונפורמטיבית לאורך האבולוציה וכי הפרעה לתנועות מולקולריות שמורות יכולה להיות מתואמת עם שינויים בספציפיות המצע והופעתם של פונקציות אנזים חדשות2,3.
בשנים האחרונות, ספקטרומטריית מסה חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) התפתחה במהירות כטכניקה רבת עוצמה כדי לחקור כיצד נופים קונפורמיים של חלבונים מגיבים להפרעות כגון קשירה ליגנד או mutagenesis4,5,6,7. בניסוי HDX-MS טיפוסי (איור 1), חלבון בעל עניין מוכנן למאגר שהוכן ב- D2O, אשר מפעיל החלפת פרוטונים הניתנים להחלפה בממס עם דוטריה. שער החליפין של ה- amide moiety של איגרות החוב פפטיד תלוי מאוד ב- pH, ברצף חומצות האמינו המקומיות ובסביבה המבנית המקומית של אמיד8. בין אלה העוסקים אינטראקציות מליטה מימן (כגון אלה הנוכחים α-helices ו β-sheets) להחליף לאט יותר מאשר בין באזורים לא מובנים של החלבון החשופים ממס בתפזורת. לכן, היקף ספיגת דיטריום הוא השתקפות של המבנה של האנזים. אנזימים דינמיים קונפורמיים, או העוברים מעברים מבניים על קשירה ליגנד, צפויים להניב תגובת HDX מדידה.
הבסיס המכניסטי לשער החליפין האיטי של אמיד מובנה מוצג באיור 25,8,9. על מנת לעבור HDX, האזור המובנה חייב תחילה לטעום באופן ארעי קונפורמציה נפרשת, כך מולקולות ממס לזרז חילופי HDX באמצעות חומצה ספציפית / מנגנון כימי בסיס, יש גישה אמיד להחלפה. בסופו של דבר, סדרי הגודל היחסיים של שער החליפין הכימי (kchem) ושיעורי הקיפול והקיפול מחדש (kopen ו- kclose) קובעים את שער ה- HDX הנמדד בניסוי5,8. ממודל קינטי פשוט זה, ברור כי היקף ספיגת הדיטריום ישקף את הדינמיקה הקונפורמציונית הבסיסית (כהגדרתה על ידי kopen ו- kclose). רוב הניסויים HDX-MS מבוצעים בזרימת עבודה מלמטה למעלה שבו, בעקבות תגובת ההחלפה, החלבון של עניין מתעכל לתוך פפטידים ואת ספיגת דיטריום על ידי כל פפטיד נמדד כמו עלייה במסה7. בדרך זו, HDX-MS מאפשר הפרעה דינמיקה קונפורמציה אנזים להיות ממופה בסולם המרחבי המקומי של פפטידים, המאפשר לחוקר להעריך כיצד הפרעה משנה את הדינמיקה באזורים שונים של האנזים של עניין.
היתרונות של גישת HDX-MS להבהרת הדינמיקה המבנית של החלבון הם רבים. ראשית, השיטה יכולה להתבצע עם כמויות קטנות של חלבון מקומי או על קומפלקסים חלבון במערכות עם מבנה quaternary10. זה אפילו לא הכרחי עבור הכנת האנזים המשמש ב assay להיות מטוהרים מאוד11,12, כל עוד זרימת העבודה HDX-MS מלמטה למעלה מספק מספר מספיק של פפטידים מזוהים בביטחון המכסים את רצף החלבון של עניין. יתר על כן, HDX-MS יכול לספק מידע על דינמיקה קונפורמטיבית בתנאים כמעט מקומיים ללא צורך בתיוג חלבון ספציפי לאתר כפי שהיה משמש במחקרי פלואורסצנטיות מולקולה אחת13, ואין מגבלת גודל למתחם החלבון או החלבון שניתן לחקור (מה שהופך גישות כגון תהודה מגנטית גרעינית [NMR] ספקטרוסקופיה מאתגרת)7,14. לבסוף, ניתן להציע שיטות HDX-MS שנפתרו בזמן כדי ללמוד חלבונים עם הפרעות מהותיות, שקשה ללמוד עם קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן15,16,17,18. המגבלה העיקרית של HDX-MS היא שהנתונים הם ברזולוציה מבנית נמוכה. נתוני HDX-MS שימושיים לצביעה על המקום שבו הדינמיקה הקונפורמית משתנה ולחשוף שינויים קונפורמיים מצמדים, אך לעתים קרובות הם אינם מספקים תובנה רבה לגבי המנגנון המולקולרי המדויק המניע את השינוי שנצפה. ההתקדמות האחרונה בשילוב של שיטות דיסוציאציה לכידת אלקטרונים עם נתוני HDX-MS חלבון הראו הבטחה למיפוי אתרי חילופי שאריות חומצת אמינו יחיד19, אבל מעקב אחר מחקרים ביוכימיים ומבניים עדיין נדרשים לעתים קרובות כדי לספק בהירות מודלים מבניים שהועברו על ידי נתוני HDX-MS.
להלן, פרוטוקול מפורט לפיתוח של HDX-MS assay מוצג20. פרוטוקולי ההכנה לדוגמה המוצגים להלן צריכים להיות רלוונטיים בדרך כלל לכל חלבון המציג מסיסות טובה במאגרים מימיים. שיטות הכנה מדגם מיוחדות יותר ותהליכי עבודה HDX-MS זמינים עבור חלבונים מאשר צריך להיות assayed בנוכחות חומר ניקוי או פוספוליפידים21,22,23,24. הגדרות אינסטרומנטליות לאיסוף נתונים HDX-MS מתוארות עבור ספקטרומטר מסה מרובע ברזולוציה גבוהה בשילוב למערכת כרומטוגרפיה נוזלית. נתונים של מורכבות ורזולוציה דומים ניתן לאסוף על כל אחד ממספר מערכות ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית זמינה מסחרית (LC-MS). היבטים מרכזיים של עיבוד הנתונים באמצעות חבילת תוכנה זמינה מסחרית מסופקים גם כן. כמו כן, אנו מציגים קווים מנחים לאיסוף וניתוח נתונים התואמים להמלצות של קהילת HDX-MS הרחבה יותר12. הפרוטוקול המתואר משמש לחקר המאפיינים המבניים הדינמיים של HalM2, סינתטאז lanthipeptide המזרז את התבגרות רב-שלבי של מוצר טבעי פפטיד מיקרוביאלית20. אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש ב- HDX-MS כדי לחשוף אתרי איגוד מצע ומאפיינים אלוסטריים שחמקו מאפיון קודם. מספר פרוטוקולים אחרים על חלבון HDX-MS פורסמו בשנים האחרונות25,26. יחד עם העבודה הנוכחית, תרומות קודמות אלה אמורות לספק לקורא גמישות מסוימת בעיצוב ניסיוני.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[glu-1]-פיברינופפטיד B (Glu-Fib)</td><td>BioBasic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ל Amicon Ultracel 10k מכשיר סינון צנטריפוגלי (Millipore)</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>פישר</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>SIGMA</td><td>a2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>ALDRICH</td><td>435767-100G</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>תרמו פישר</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>גואנידין-HCl</td><td>VWR</td><td>97063-764</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>SiGMA-Aldrich</td><td>63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>BioBasic</td><td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט</td><td>BioBasic</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>TCEP הידרוכלוריד</td><td>TRC קנדה</td><td>T012500</td><td>פפטיד סונתז על פי בקשה</td></tr><tr><td>שם החומר/ציוד</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deuteros</td><td>Andy M C Lau, et al</td><td>גרסה 1.08</td><td></td></tr><tr><td>DynamX</td><td>Waters</td><td>גרסה 3.0</td> MassLynx Waters גרסה 4.1 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein Lynx Global Server (PLGS)</td><td>Waters</td><td>גרסה 3.0.3</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; דינגר</td><td>גרסה 2.2.2</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם החומר/ציוד</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות/תיאור/תיאור</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>מכשיר וציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 אנליטי טור</td><td>מים</td><td>186002346</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard טרום טור</td><td>מים</td><td>186003978</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-CLASS HDX מערכת</td><td>מים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX מנהל</td><td>מים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטיפ pH אלקטרודה</td><td>תרמו פישר</td><td>13-620-291</td><td></td></tr><tr><td>מים Enzymate BEH עמוד או פפסין סולומן</td><td>מים</td><td>186007233</td><td></td></tr><tr><td>מים סינפט מי</td><td></td><td></td><td></td> G2-Si</tr></tbody></table>

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (hdx-ms) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) היא שיטה רבת עוצמה לאפיון ביופיזי של שינויים קונפורמיים של אנזימים ואינטראקציות בין מצע אנזימים. בין היתרונות הרבים שלה, HDX-MS צורכת רק כמויות קטנות של חומר, יכול להתבצע בתנאים מקומיים קרובים ללא צורך תיוג אנזים / מצע, והוא יכול לספק מידע נפתרה spatially על דינמיקה קונפורמציה אנזים-אפילו עבור אנזימים גדולים קומפלקסים multiprotein. השיטה היא ביוזמת דילול של האנזים של עניין לתוך חוצץ מוכן D2O. זה מפעיל את חילופי פרוטיום ב אמיד אג"ח פפטיד (N-H) עם דיטריום (N-D). בנקודות זמן ההחלפה הרצויות, אליקוטים תגובה מרווה, האנזים הוא proteolyzed לתוך פפטידים, פפטידים מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה (UPLC), ואת השינוי במסה של כל פפטיד (עקב חילופי מימן עבור דיטריום) נרשם על ידי טרשת נפוצה. כמות ספיגת הדיאוטריום על ידי כל פפטיד תלויה מאוד בסביבת מליטה מימן המקומית של פפטיד זה. פפטידים נוכחים באזורים דינמיים מאוד של דיטריום חילופי אנזימים במהירות רבה, ואילו פפטידים שמקורם באזורים מסודרים היטב עוברים חילופים הרבה יותר לאט. באופן זה, שיעור HDX מדווח על דינמיקה קונפורמציה אנזים מקומי. לאחר מכן ניתן להשתמש בהפרעות לרמות ספיגת הדיטריום בנוכחות ליגנדים שונים כדי למפות אתרי קשירה ליגנד, לזהות רשתות allosteric, ולהבין את התפקיד של דינמיקה קונפורמית בתפקוד האנזים. כאן, אנו ממחישים כיצד השתמשנו ב- HDX-MS כדי להבין טוב יותר את הביוסינתזה של סוג של מוצרים טבעיים פפטיד הנקרא lanthipeptides. Lanthipeptides הם פפטידים מקודדים גנטית כי הם לאחר תרגום שונה על ידי אנזימים גדולים, רב תכליתיים, דינמי קונפורמי שקשה ללמוד עם גישות ביולוגיה מבנית מסורתית. HDX-MS מספק פלטפורמה אידיאלית ומותאמת לבדיקת התכונות המכניסטיות של אנזימים מסוג זה.

יש צורך להעריך את איכות העיכול הפרוטאוליטי ואת הרבייה של זרימת העבודה עבור כל קבוצה של זריקות מדגם. לכן, לפני ביצוע מבחני HDX-MS, חיוני לקבוע תנאים יעילים לפרוטאואליזה של החלבון המעניין, להפרדת פפטידים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית פאזה הפוכה וניידות שלב גז יון, ולגילוי פפטידים באמצעות טרשת נפוצה. לשם כך, יש לחקור תחילה את דגימות הייחוס לחלבון המעניין (שנאסף בהיעדר דיטריום) (סעיף 3). הנתונים הכרומטוגרפיים באיור 3A-C מראים את סך כרומטוגרמות היונים (TICs) עבור שלוש דגימות ייחוס ש...

סינתזות Lanthipeptide לזרז תגובות מרובות צעדים במהלך הביוסינתזה של מוצרים טבעיים פפטיד. כאן, אנו מתארים רציף, מלמטה למעלה, מימן-deuterium חילופי ספקטרומטריית מסה (HDX-MS) זרימת עבודה שניתן להפעיל כדי ללמוד את הדינמיקה הקונפורמטיבית של סינתטאז lanthipeptide, כמו גם אנזימים דומים אחרים המעורבים ביוסינתזה של מוצר טבעי פפטיד.

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

פרוטוקול זה יכול לספק מידע שנפתר במיוחד על דינמיקת קונפורמציה של חלבונים. מה שיכול לעזור לזהות אזורים חשובים מבחינה תפקודית בחלבון המעניין. טכניקה זו בוחנת דינמיקה קונפורמציונית של חלבון בתנאים כמעט טבעיים.ללא צורך בתיוג חלבון באמצעות כמות ננו-מולרית של חומר לכל תגובה. התחל בהכנת דגימות ייחוס לא מעודכנות לחלבון המעניין בטריפליקט, בשפופרות של 500 מיקרוליטר. הרוו את הדגימות בנפח המתאים של מאגר מרווה לכל צינור כדי להשיג קריאת מד pH של 2.5.הבזק הקפיא את הדגימות בחנקן נוזלי לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוחן. לאחר מכן נתח את דגימות הייחוס של האנזים באמצעות זרימת עבודה של ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית מלמטה למעלה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לנתח את נתוני ספקטרומטריית המסה הגולמיים בתוכנה הפרוטאומית המתאימה.נווט אל ספריות ומאגרי נתונים של רצף חלבונים כדי לייבא את רצף חומצות האמינו של החלבון המבוקש. הזן שם עבור רצף החלבון המעניין וייבא את רצף החלבון בפורמט PASTA. כדי להגדיר את פרמטרי העיבוד בתפריט ספרייה, בחר Electrospray MSE כסוג רכישת הנתונים.בשדה נעילת מסה לטעינה 2, הזן 785.8426 עבור יחס הטעינה הראשי עבור שני הפלוס יון של גלוקן סיב אחד ללא פפטיד B ולחץ על סיום. כדי להגדיר את הפרמטרים של זרימת העבודה, בחר Electrospray MSE עבור סוג החיפוש. תחת הכותרת שאילתת חיפוש זרימת עבודה ומסד נתונים, בחר את חלבון מסד הנתונים שנוצר בשדה מאגר נתונים ושנה את מגיב התקציר הראשי ללא ספציפי.כדי לנקות את שדה המגיב הקבוע, החזק את לחצן הבקרה תוך כדי לחיצה על Carbamidomethyl C.To לציין את ספריית הפלט, בחר אפשרויות, הגדרת אוטומציה וזיהוי E.לאחר מכן סמן את תיבות הפלט התלת-ממדי של ה-apex 3D ו-peptide ו-Ion Accounting Output. וציין את הספרייה הרצויה. כדי לעבד את נתוני הדגימה המוזכרים, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על לוחית המיקרוטיטר כדי ליצור לוחית חדשה.לחץ לחיצה ימנית בבאר אחת וגרור לשלוש בארות אחרות כדי לסמן באר אחת עבור כל דגימה שהוזכרה. לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית ובחר הוסף נתונים גולמיים. בחלון, נווט אל הספרייה המכילה את שלושת הקבצים המוזכרים ובחר את כל שלושת הקבצים בו-זמנית.לחץ על הבא ובחר את פרמטרי העיבוד שהוגדרו. לחץ שוב על הבא ובחר את הפרמטרים המוגדרים של זרימת העבודה. לאחר מכן לחץ על סיום.לאחר הקצאת הנתונים הגולמיים, פרמטרי העיבוד ופרמטרי זרימת העבודה לכל באר בצלחת, הבארות יהפכו לכחולות. בחר את הבארות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר עבד את הנתונים הגולמיים האחרונים. כדי לעקוב אחר עיבוד הנתונים, לחץ על הפינה השמאלית התחתונה של החלון.כאשר לא מופיעה עבודה להפעלה, העיבוד הושלם והבארות בצלחת המיקרוטיטר יהפכו לירוקות. לחץ לחיצה ימנית על הבארות ובחר הצג תוצאות זרימת עבודה. ייפתח חלון נפרד עבור כל קובץ נתונים שאליו מתבצעת הפניה.בדוק את הנתונים כדי לוודא שרוב אותות ספקטרומטריית המסה בנתוני הדגימה המוזכרים מופו בהצלחה לפפטידים הצפויים מהעיכול בסיליקו של החלבון המעניין. פפטידים תואמים יופיעו כחולים בספקטרום הפלט. לחץ פעמיים על מסנן האישור ובדוק שאחוז הכיסוי גדול מ-99%ייבא את פלט התוכנה הפרוטאומית לתוכנת עיבוד חילופי מימן דאוטריום לסף נוסף.ולחץ על נתונים וייבא תוצאות PLGS. לחץ על הסמל Add ונווט לספרייה המתאימה כדי לבחור את קובצי הנתונים המעובדים. לחץ על הבא והגדר את מספר היונים הרצוף המינימלי לגדול או שווה לשניים.שגיאת המסה לחמישה חלקים למיליון. וסף הקובץ לשלוש, ולאחר מכן לחץ על סיום. כדי לבצע תגובות חילופי מימן דאוטריום, יש להרוות את המאגר בצינורות של 500 מיקרוליטר.וצנטריפוגה קצרה כדי להעביר את כל מאגר המרווה לתחתית כל צינור. הניחו את הצינורות המכילים תמיסה מרווה על קרח. לאחר מכן, ערבבו מראש את כל מרכיבי התגובה המפוזרים בשפופרת נפרדת של 1.5 מיליליטר.לאחר מכן העבירו את תערובת התגובה לאמבטיית מים מבוקרת טמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הוסף אנזים לרכיבי התגובה המפוזרים כדי ליזום את תגובת ההחלפה. מערבבים היטב את תוכן התגובה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.בנקודות זמן ההחלפה הניסיוניות המתאימות הסר 50 מיקרוליטר מכל תגובת חילופי מימן דאוטריום. וערבבו את התגובות במהירות ובאופן שווה עם מנה אחת של מאגר מרווה קר כקרח בצינורות בודדים של 500 מיקרוליטר. לאחר מכן מכסים מיד את הצינורות להקפאת הבזק בחנקן נוזלי.אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לניתוח. לאחר הפשרת הדגימות הקפואות, נתח את דגימות הייחוס של האנזים המפוזר באמצעות אותו זרימת עבודה של מפרט מסה של כרומטוגרפיה נוזלית מלמטה למעלה שפותחה עבור דגימות הייחוס הלא מעודכנות. לאחר איסוף נתוני ה-LCMS עבור הדגימות המנותקות, ייבא את הנתונים לפרויקט חילופי מימן דאוטריום שנוצר בעבר לעיבוד נתונים.ולחץ על מצב חדש וחשיפה חדשה כדי להגדיר את המצבים הביוכימיים וזמני החשיפה לדאוטריום בהתאמה הרלוונטיים לניתוח. לחץ על New Raw כדי לבחור את קבצי הנתונים של חילופי מימן דאוטריום לניתוח. והקצה את זמני ההחלפה והמצב הביוכימי המתאימים לכל קובץ נתונים גולמיים המיובא.לניתוח והדמיה של הנתונים, בחר את הפפטיד הראשון ברשימה Peptide ופתח את התרשים הספקטרלי המוערם מתפריט Views. לחץ על העכבר כדי להקצות ולבטל הקצאה של מקלות לפי הצורך כדי להבטיח שהתפלגות האיזוטופים הנכונה אותרה בנתונים. ושכל שיא איזוטופ הוקצה.כדי לבדוק את הקצאות המוט עבור כל מצב טעינה, החלף את מצב הטעינה בחלק העליון של חלון העלילה הספקטרלית המוערמת. כדי לבדוק את סטיית התקן של ערכי קליטת הפפטיד דאוטריום בתפריט Views, בחר את מפת הכיסוי. המציג כל פפטיד ברשימת הפפטידים הממופה לאורך רצף חומצות האמינו של החלבון המבוקש.צבעו את הפפטידים לפי סטיית תקן יחסית וחפשו חזותית במפה פפטידים חריגים עם סטיית התקן היחסית הגבוהה. לחץ על הפפטידים החריגים במפת הכיסוי כדי לאכלס את העלילות הספקטרליות המוערמות ואת חלון מציג הנתונים בפפטיד היעד. הצג את הפרש העניין במפת הכיסוי ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על המפה כדי לייצא את נתוני ההפרש לקובץ CSV.ייבא את ההפרש, ואת נתוני המצב, ואת קובץ ה-PDB של החלבון המעניין ל-Deuteros. ובחר את מרווח הסמך של 99% והפעל סכום ועבד את הנתונים. לאחר מכן, תחת pi mol, בחר ייצוא, קליטה וייצוא כדי ליצור סקריפט PyMOL כדי למפות את האזורים של הפרש החליפין המשמעותי על מבנה ה-PDB של החלבון המעניין בתוכנת PyMOL.כרומטוגרמות יונים מייצגות אלה עבור שלוש דגימות ייחוס של סינתטאז פפטיד למבדה Hal-M2 מראות את השינויים תלויי הזמן בסכום כל ספירת היונים בכל ערכי יחס המסה למטען הכלולים בסריקה הספקטרלית של המסה. הצורה והעוצמה של פרופיל הכרומטוגרמה הכולל של היונים צריכים להיות דומים. מה שמצביע על כך שהעיכול הפרוטאוליטי של Hal-M2 ניתן לשחזור.והוא בעל יעילות דומה בכל שלושת דגימות הייחוס. ספקטרום המסה במרווח זמן נתון צריך להיות דומה גם הוא. מתן ביטחון כי פפטידים דומים קיימים בכל דגימה ורומזים בזמנים דומים מעמודת C18.רוב הפפטידים בדגימות המוחלפות בדאוטריום אמורים להראות תזוזות ברורות בהתפלגות האיזוטופית לעבר ערכי יחס מסה למטען גבוהים יותר. לדוגמה, נתונים אלה מצביעים על כך שחלק ניכר מתווית הדאוטריום נשמר במהלך איסוף נתוני מרווה החומצה, עיכול הפפסין וספקטרומטריית המסה של כרומטוגרפיה נוזלית. לאחר אפיון התכונות הביוכימיות של האנזים כפי שהודגם, ניתן לייצר תוצאות ספקטרומטריית מסה מייצגות של חילופי מימן דאוטריום כגון אלה.כדי להמחיש את הקישור של פפטיד מבשר Hal-A2 לקומפלקס Hal-M2 AMP, PMP. יש להכין ולהרוות את תגובות חילופי המימן דאוטריום בצורה עקבית. ועליך להיות שיטתי בעת קביעת ערכי חילופי הדאוטריום עבור פפטידים רבים שזוהו.ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן דאוטריום מספקת מידע ברמת הפפטיד ושינויים קונפורמטיביים דינמיים של חלבון. יש לאמת את הרלוונטיות הפונקציונלית של כל חילופי מימן דאוטריום עבור Meter Genesis. ומבחני פעילות אורתוגונלית.

a-hydrogen-deuterium-exchange-mass-spectrometry-hdx-ms-platform-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה נוצל בהצלחה כדי לפקח על חילופי אמיד מימן / דאוטריום בהפעלת חלבון kinase Pak2.

אמיד מימן / דאוטריום Exchange &amp; MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ניתוח של הפעלת Pak2

קונפורמציה בחלבון ודינמיקה הן מפתח להבנת הקשר בין מבנה חלבון ותפקודו. חילופי מימן יחד עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה הוא שיטה תכליתית כדי ללמוד את הדינמיקה קונפורמציה של חלבונים כמו גם באפיון אינטראקציות החלבון ליגנד וחלבונים, כוללים ממשקי מגע ואפקטי allosteric.

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לספקטרומטריית מסה של חילופי מימן/דאוטריום במצב מוצק (ssHDX-MS) וספקטרומטריית מסה של תיוג פוטוליטי במצב מוצק (ssPL-MS) עבור חלבונים באבקות מוצקות. השיטות מספקות מידע ברזולוציה גבוהה על קונפורמציה של חלבונים ואינטראקציות במצב מוצק אמורפי, שעשוי להיות שימושי בתכנון ניסוח.

Mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות Lyophilized

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

אחד התנאים המאתגרים ביותר מתח כי אורגניזמים נתקלים במהלך חייהם כרוכה ההצטברות של חמצון. במהלך סטרס חמצוני, תאים בכבדות להסתמך על מלווים מולקולרית. כאן, אנו מציגים שיטות השתמשו כדי לחקור את מוסדר חמצון-חיזור צבירת נגד הפעילות, כמו גם כדי לעקוב אחר שינויים מבניים המסדירים את הפונקציה המלווה באמצעות HDX-MS.

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור אלקטרופורזה מבוססת אלקטרופורזה נימית מימן / דיוטריום חילופי (HDX) גישה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. גישה זו מאפיינת את ההבדל במבנים מסדר גבוה יותר בין מיני חלבונים שונים, כולל חלבונים במצבים שונים ופרוטאופורמים שונים, על ידי ביצוע HDX דיפרנציאלי בו זמנית והפרדה אלקטרופורטית.

חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה

ההרכב המבני של אלפא-סינוקלאין מונומרי משפיע על תפקודו הפיזיולוגי ועל תכונותיו הפיזיקוכימיות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבצע ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה וניתוחי נתונים מאוחרים יותר כדי לקבוע מידע קונפורמי על המונומר של חלבון זה בעל הפרעה פנימית בתנאים פיזיולוגיים.

ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה לחקר הדינמיקה המבנית של אלפא-סינוקלאין בתנאים פיזיולוגיים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

טיפות ליפידים הם אברונים חשובים עבור שכפול של מספר פתוגנים, כולל וירוס הפטיטיס C (HCV). אנו מתארים שיטה לבודד טיפות השומנים עבור ספקטרומטריית מסה כמותית של חלבונים הקשורים; ניתן להשתמש בו תחת מגוון של תנאים, כגון זיהום וירוס, לחץ סביבתי, או טיפול תרופתי.

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

שיטות שונות כדי לתפעל אדריכלות תלת מימדי המבוסס על חלבון hydrogels מוערכים פה לגבי תכונות החומר. הרשתות macroporous הן functionalized עם פפטיד תא-דבק, הכדאיות שלהם בתרבות תא מוערך באמצעות שתי שורות תאים מודל שונה.

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

למדו את שיטת HDX-MS לניתוח דינמיקת קונפורמציה של אנזימים ביוסינתטיים פפטידיים. טכניקה זו מאפשרת זיהוי אזורים פונקציונליים חשובים בתנאים קרובים לטבעיים ללא צורך בסימון.

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

גלה סרטונים נוספים