Name: התקנה של ספקטרומטריה של מסת פלזמה (CE-ICP-MS) לכמת את מיני ברזל רדוקס (Fe(II), Fe(III) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: למדו שיטת CE-ICP-MS לכימות מיני ברזל רדוקס Fe(II) ו-Fe(III) בביוכימיה אנליטית. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר ורגישות גבוהה לחקר תהליכים תלויי ברזל ומחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VV נתמך על ידי מענק המחקר התוך-מוראלי (Forschungsförderung) של המרכז הרפואי האוניברסיטאי גטינגן ותכנית המחקר Else Kröner של אלז קרונר-פרסניוס-Stiftung.

<ol><li>Hare, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+early-life+iron+exposure+critical+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Is early-life iron exposure critical in neurodegeneration.</a> Nature Reviews Neurology. 11 (9), 536-544 (2015).</li>
<li>Ashraf, A., Clark, M., So, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aging+of+Iron+Man%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Aging of Iron Man.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 10, (2018).</li>
<li>Hare, D. J., Cardoso, B. R., Szymlek-Gay, E. A., Biggs, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+effects+of+iron+supplementation+in+infancy%3A+finding+the+balance+between+health+and+harm+in+iron-replete+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Child+Adolesc+Health%22%5BJournal%5D)">Neurological effects of iron supplementation in infancy: finding the balance between health and harm in iron-replete infants.</a> Lancet Child Adolesc Health. 2 (2), 144-156 (2018).</li>
<li>Torti, S. V., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%3A+more+ore+to+be+mined%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer: more ore to be mined.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).</li>
<li>Kehrer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Haber-Weiss+reaction+and+mechanisms+of+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity.</a> Toxicology. 149 (1), 43-50 (2000).</li>
<li>Gaschler, M. M., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxidation+in+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxidation in cell death.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 482 (3), 419-425 (2017).</li>
<li>Michalke, B., Halbach, S., Nischwitz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JEM+Spotlight%3A+Metal+speciation+related+to+neurotoxicity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Monitoring%22%5BJournal%5D)">JEM Spotlight: Metal speciation related to neurotoxicity in humans.</a> Journal of Environmental Monitoring. 11 (5), 939-954 (2009).</li>
<li>Solovyev, N., Vinceti, M., Grill, P., Mandrioli, J., Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+speciation+of+iron%2C+manganese%2C+and+copper+in+cerebrospinal+fluid+by+strong+cation+exchange+chromatography+-+sector+field+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Redox speciation of iron, manganese, and copper in cerebrospinal fluid by strong cation exchange chromatography - sector field inductively coupled plasma mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 973, 25-33 (2017).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+excess+iron+on+oxidative+stress+and+gluconeogenesis+through+hepcidin+during+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutritional+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of excess iron on oxidative stress and gluconeogenesis through hepcidin during mitochondrial dysfunction.</a> Journal of Nutritional Biochemistry. 26 (12), 1414-1423 (2015).</li>
<li>Dixon, S. J., Lemberg, K. M., Lamprecht, M. R., Skouta, R., Zaitsev, E. M., Gleason, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+an+iron-dependent+form+of+nonapoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death.</a> Cell. 149 (5), 1060-1072 (2012).</li>
<li>Stockwell, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+A+Regulated+Cell+Death+Nexus+Linking+Metabolism%2C+Redox+Biology%2C+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: A Regulated Cell Death Nexus Linking Metabolism, Redox Biology, and Disease.</a> Cell. 171 (2), 273-285 (2017).</li>
<li>Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Halbach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+speciation+in+human+cerebrospinal+fluid+using+CZE+coupled+to+inductively+coupled+plasma+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS.</a> Electrophoresis. 28 (9), 1380-1386 (2007).</li>
<li>Fernsebner, K., Zorn, J., Kanawati, B., Walker, A., Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+leads+to+an+increase+in+markers+of+oxidative+stress+as+well+as+to+a+shift+in+the+ratio+of+Fe%28II%29%2F%28III%29+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Manganese leads to an increase in markers of oxidative stress as well as to a shift in the ratio of Fe(II)/(III) in rat brain tissue.</a> Metallomics. 6 (4), 921-931 (2014).</li>
<li>Neth, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manganese%3A+Species+Pattern+and+Mechanisms+of+Brain+Injury%22">Manganese: Species Pattern and Mechanisms of Brain Injury</a>. , Technical University of Munich, Analytical Food Chemistry. Doctoral Dissertation (2015).</li>
<li>Neth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Brain+Metallome%2FMetabolome+Pattern+due+to+a+Single+i.v.+Injection+of+Manganese+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Changes in Brain Metallome/Metabolome Pattern due to a Single i.v. Injection of Manganese in Rats.</a> Plos One. 10 (9), (2015).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+causes+neurotoxic+iron+accumulation+via+translational+repression+of+Amyloid+Precursor+Protein+%28APP%29+and+H-Ferritin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Manganese causes neurotoxic iron accumulation via translational repression of Amyloid Precursor Protein (APP) and H-Ferritin.</a> Journal of Neurochemistry. 147 (6), 831-848 (2018).</li>
<li>Willkommen, D., Lucio, M., Schmitt-Kopplin, P., Gazzaz, M., Schroeter, M., Sigaroudi, A., Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+fractionation+in+a+case-control+study+concerning+Parkinson%27s+disease%3A+Cu-amino+acids+discriminate+CSF+of+PD+from+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Trace+Elements+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Species fractionation in a case-control study concerning Parkinson's disease: Cu-amino acids discriminate CSF of PD from controls.</a> Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 164-170 (2018).</li>
<li>Thibault, P., Dovichi, N. J. General instrumentation and detection systems including mass spectrometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThibault%2C+P+%22Capillary+Electrophoresis+-+Theory+and+Practice%22">Capillary Electrophoresis - Theory and Practice</a>. Camilleri, P. , CRC Press. Boca Raton, Boston, New York, Washington D.C., London. 23-89 (1998).</li>
<li>Iliff, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Paravascular+Pathway+Facilitates+CSF+Flow+Through+the+Brain+Parenchyma+and+the+Clearance+of+Interstitial+Solutes%2C+Including+Amyloid+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A Paravascular Pathway Facilitates CSF Flow Through the Brain Parenchyma and the Clearance of Interstitial Solutes, Including Amyloid beta.</a> Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).</li>
<li>Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+speciation+using+capillary+electrophoresis-ICP-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Manganese speciation using capillary electrophoresis-ICP-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1050 (1), 69-76 (2004).</li>
<li>Kuhn, R., Hofstetter-Kuhn, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuhn%2C+R+%22Capillary+electrophoresis%3A+Principles+and+practice%22">Capillary electrophoresis: Principles and practice</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1993).</li>
<li>Michalke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoretic+methods+for+a+clear+identification+of+selenoamino+acids+in+complex+matrices+such+as+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoretic methods for a clear identification of selenoamino acids in complex matrices such as human milk.</a> Journal of Chromatography A. 716 (1-2), 323-329 (1995).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156 (1-2), 317-331 (2014).</li>
<li>Shimada, K., Hayano, M., Pagano, N. C., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Line+Selectivity+Improves+the+Predictive+Power+of+Pharmacogenomic+Analyses+and+Helps+Identify+NADPH+as+Biomarker+for+Ferroptosis+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-Line Selectivity Improves the Predictive Power of Pharmacogenomic Analyses and Helps Identify NADPH as Biomarker for Ferroptosis Sensitivity.</a> Cell Chemical Biology. 23 (2), 225-235 (2016).</li>
</ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

מאז ברזל ממלא תפקיד בולט בהתקדמות מערכת ההפעלה, ובכך להקל על תפקוד מיטוכונדריאלי או FTP, שיטה כמותית מבוססת CE-ICP-MS רב-תכליתי עבור Fe(II)/Fe(III) הדגימה בו זמנית מוצג במאמר זה והיישום שלה מוצג למופת בתא lysates. השיטה סיפקה זמן ניתוח קצר ואת הנתונים של כשרון (LOQ, דיוק, התאוששות) מתאימים דגימות להיות רלוונטי עבור דגימה רדוקס ברזל במיוחד במחקר ניווניות וסרטן. בהשוואה לשיטות קודמות המבוססות על LC, שיטה זו מבוססת CE אינה תלויה כמעט בקבוצות עמודות ובעיות רבייה שנצפו בעבר לאחר שינוי עמודות LC. הכנת נימה לפני כל ריצה היא <4 דקות וזמן ניתוח לכל מדגם עם ממליוח מתון עד 3 דקות. מלבד טעינה וגודל מולקולה, זמן ההעברה ב- CZE תלוי מוליכות בתקע המדגם, אשר גורם וריאציה זמן העברה או משמרות כאשר דגימות עצמם להשפיע על מוליכות במידה ניכרת. שינויים כאלה בזמן הנדידה ידועים היטב באלקטרופורזה נימה. זוהי בעיה CZE-immanent, ידוע הספרות21,22. לסטנדרטים ולתאי SH-SY5Y הייתה מוליכות מתונה והומוגנית. כתוצאה מכך, זמני ההעברה הראו רק שינויים קטנים בדיוק טוב. עם זאת, עבור דגימות עם מוליכות גבוהה, ניתן לצפות זמני הגירה ממושכים עד 5 דקות. לכן, תוספות סטנדרטיות מומלצות לזיהוי מינים ברורים.
בעיה קריטית במפרט redox ברזל היא יציבות מינים (כלומר, תחזוקה של Fe(II)/(III) equilibria)במהלך הכנת מדגם 8,,13. כימיקלים לא הולמים מסוג pH או chelating, כמו גם תנאי אחסון בלתי הולמים כגון חמצן (אוויר) במגע עם מדגם או הפסקה באחסון קפוא עמוק, יכולים לשנות בקלות את יתרת Fe(II)/(III). לכן, להכנת תאי SH-SY5Y, נבחר מאגר ליסיס ללא כל כימיקלים, pH פיזיולוגי, אבל כיסוי גז אינרטי במהלך הכנת מדגם, במכולות מדגם והקפאה עמוקה מיידית הוחל עבור דגימות אלה.
בספרות, ניתן למצוא גישות חצי כמותיות כדי לפקח על Fe(II). להבנה משופרת של תפקידו של ברזל ב סטרס חמצוני, מספר קבוצות מחקר פיתחו Fe(II)בדיקות ספציפיות כדי לפקח חצי כמותית ולדמיין גובה חריג של ברזל ברזל ברזל במבחנה. עם זאת, חשוב לציין, בדיקות כאלה אינן מחשיבות את Fe(III) ולא מכמתות אלא מדווחות רק על "יותר" או "פחות" Fe(II). עד כה, רק כמה סמנים ביולוגיים זמינים כדי לקבוע מערכת ההפעלה ו- FPT, בשל היעדר שיטות אמינות כדי לכמת בו זמנית את Fe(II)/Fe(III) redoxמינים 23,24. לאחר שכך, השיטה המוצגת - הקלה על כימות מהיר של שניהם, Fe(III) ו-Fe(II) בריצה אחת - עשויה להפוך לכלי מבטיח להעמיק את התובנה בתהליכים מולקולריים תלויי ברזל.

כיום, זה ברור ביותר כי סטרס חמצוני בתיווך ברזל (OS) ממלא תפקיד מכריע בהפרעות מרובות במיוחד בהפרעות מוחיות ניווניות, כמו אלצהיימר ומחלת פרקינסון, כמוגם בסרטן 1,,2,,3,,4. מערכת ההפעלה קשורה קשר הדוק למצב ולאיזון של הזוג הרדוקס Fe(II)/Fe(III). בעוד Fe(III) הוא redox-לא פעיל, Fe(II) מייצרת בעוצמה מינים חמצן תגובתי (ROS) על ידי פירוק H2O2 פירוק ואחריו ייצור רדיקלי hydroxyl ו peroxidation שומנים קרום5,,6. ברמה המולקולרית, FE(II)שנוצר ROS ו פוספוליפידים peroxidized הם התקפה חזקה לשלמות של חלבונים, שומנים ו-DNA7,,8. תפקוד תאי מזיק כזה הוכח כדי לגרום לתפקוד מיטוכונדריאלי עם ירידה ATP-תוכן9 ואפילו יכול לעורר מוות מתוכנת של תא נמק, המכונה פרופטוזיס (FPT)10,,11. לכן, ספקטורציה כמותית Fe(II)/(III) redox היא בעלת חשיבות רבה בספקטרום רחב של הפרעות הקשורות רדוקס.
ספקולציה כימית היא כלי מבוסס היטב לחקר של עקבות אלמנטים תפקיד ביולוגי וחילוףחומרים בכלל 7,,8, כמו גם בתנאים ניווניות12,13,,14,,15,16,17., שיטות לתווה Fe-redox שנמצאו בספרות מבוססות בדרך כלל על הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית (LC). חלק מהספרות משתמשות בספקטרומטריה של מסת פלזמה (ICP-MS) כגלאי סלקטיבי של אלמנט. עם זאת, בעבודה שגרתית LC, זמני טיהור מוגזמים היו נחוצים בין ריצות. וריאציה בעייתית אף יותר של עמודות LC כפתה מיטוב מחדש של תנאי ההתעלות לאחר כל שינוי עמודה. בעיות אלה פוגעות בתפוקה גבוהה. זמן נוסף נדרש כדי להשיג אמינות קבילה ולהעריך ביסודיות את השיטה שוב.
כדי לעקוף חסרונות אלה, שיטה מוצגת כאן עבור Fe(II)/Fe(III) ספקולציה redox המבוססת על אלקטרופורזה נימה בשילוב ספקטרומטריה מסת פלזמה (CE-ICP-MS). CE מציעה יתרונות שונים בהשוואה ל-LC18. נימים אין שלב נייח ולכן תלוי (כמעט) לא על זהות אצווה. כאשר הם מזדקנים או חסומים, הם מוחלפים במהירות, ובדרך כלל מציגים ביצועים ללא שינוי. שלבי הטיהור והניקוי בין הדגימות יעילים וקצרים, וזמן הניתוח לכל דגימה הוא קצר גם כן.
השיטה המוצגת אמינה עם דמויות טובות של כשרון. כהוכחה של עיקרון, השיטה מוחלת על נוירובלסטומה דופאמין אנושי (SH-SY5Y) תא lysate, סוג מדגם חשוב ניוון עצבי, כמוגם מחקר סרטן 19.

<table><tbody><tr><td>CE נימי</td><td>CS-Chromatographie Service, Langerwehe, גרמניה</td><td>105180-25</td><td></td></tr><tr><td>מערכת CE</td><td>PrinCe technolgies</td><td>0005.263</td><td>דגם PrinCe 760</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים סופרקלירים 15 מ"ל</td><td>Analytics-shop.com מאת Altmann Analytik</td><td>PEN0777704</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סופרקלירים חרוטיים 50 מ"ל</td><td>Analytics-shop.com מאת Altmann Analytik PEN0777694</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeCl2 * 4H2O</td><td>Merck</td><td>103861</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Merck</td><td>803945</td><td></td></tr><tr><td>Fluidflex Silikon HG-Schlauch</td><td>ProLiquid</td><td>4001106HG</td><td></td></tr><tr><td>נימי סיליקה התמזגו OD 360 ומיקרו; מ', תעודת זהות 50 ומיקרו; m</td><td>Chromatographie Service GmbH</td><td>105180-25</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית, 1 M</td><td>Merck</td><td>1101652500</td><td>קורוזיבית</td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Perkin Elmer</td><td>N814003</td><td></td></tr><tr><td>Luer, נקבה תלת כיוונית</td><td>BioRad</td><td>7318229</td><td></td></tr><tr><td>Luer, חרוט זכר</td><td>neoLab Migge</td><td>2-1895</td><td></td></tr><tr><td>Luer, זכר</td><td>neoLab Migge</td><td>2-1880</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת הערכת שיא Peakfit</td><td>Systat</td><td>PeakFit 4.12</td><td></td></tr><tr><td>חוט PT</td><td>קארל רוט</td><td>0737.1</td><td></td></tr><tr><td>צינור PVC</td><td>ProLiquid</td><td>6000002</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylammoniumhydroxide, 25</td>% <td>Merck</td><td>814748</td><td>קורוזיבי</td></tr><tr><td>TYGON-tube R-3607</td><td>ProLiquid</td><td>3700203A</td><td></td></tr></tbody></table>

התקנה של ספקטרומטריה של מסת פלזמה (ce-icp-ms) לכמת את מיני ברזל רדוקס (fe(ii), fe(iii)

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis של חילוף החומרים ברזל הוא בחשבון במסגרת פתופיזיולוגית של מחלות רבות, כולל סרטן ומספר מצבים ניווניות. ברזל מוגזם תוצאות Fe(II) redox-פעיל חינם והוא יכול לגרום להשפעות הרסניות בתוך התא כמו סטרס חמצוני (OS) ומוות על ידי חמצון שומנים המכונה ferroptosis (FPT). לכן, מדידות כמותיות של ברזל ברזל ברזל (Fe(II) ו ferric (Fe(III) ולא נחישות Fe מוחלטת היא המפתח לתובנה קרובה יותר לתוך תהליכים מזיקים אלה. מאז Fe(II)/(III) החלטות יכול להיות מעוכב על ידי משמרות מצב redox מהירה וריכוזים נמוכים בדגימות רלוונטיות, כמו נוזל מוחי שדרתי (CSF), שיטות צריך להיות זמין לנתח במהירות ולספק מגבלות נמוכות של כימות (LOQ). אלקטרופורזה נימה (CE) מציעה את היתרון של הפרדה מהירה Fe(II)/Fe(III) ועובדת ללא שלב נייח, מה שעלול להפריע לאיזון הרדוקס או לגרום להידבקות אנליטית. CE בשילוב עם ספקטרומטריה מסת פלזמה בשילוב השראתי (ICP-MS) כמו גלאי מציע שיפור נוסף של רגישות זיהוי וסלקטיביות. השיטה המוצגת משתמשת ב-20 mM HCl כאלקטרוליט רקע ולחץ של +25 kV. צורות שיא ומגבלות זיהוי ריכוז משופרות על-ידי מוליכות-pH-סידור בערימה. להפחתת 56[ArO]+, ICP-MS הופעל במצב תא תגובה דינמי (DRC) עם NH3 כגז תגובה. השיטה משיגה מגבלה של זיהוי (LOD) של 3 μg / L. עקב סידור בערימה, נפחי הזרקה גבוהים יותר היו אפשריים מבלי לפגוע בהפרדה אלא לשפר את LOD. כיולים הקשורים לאזור השיא היו ליניאריים עד 150 μg / L. דיוק מדידה היה 2.2% (Fe(III)) כדי 3.5% (Fe(II).). דיוק זמן הנדידה היה <3% עבור שני המינים, נקבע 1:2 lysates מדולל של תאי נוירובלסטומה אנושית (SH-SY5Y). ניסויי התאוששות עם תוספת סטנדרטית חשפו דיוק של 97% Fe(III) ו 105 % Fe(II). בדגימות ביולוגיות בחיים האמיתיים כמו CSF, זמן הנדידה יכול להשתנות בהתאם ל מוליכות משתנה (כלומר, ממליות). לפיכך, זיהוי שיא מאושר על ידי תוספת סטנדרטית.

מדידות של תקנים ו כיול זמני ההעברה הוברעו על-ידי זריקות סטנדרטיות בודדות: תקן Fe(III) היה במעקב ב- 118 שניות של זמן העברה ותקן Fe(II) ב- 136 שניות של זמן העברה. מגבלות הזיהוי חושבו באמצעות קריטריון 3大 המתייחס לרעש בסיסי וריכוז סטנדרטי של 50 μg/L. LOD(Fe(II) היה 3.1 μg/ L ו LOD(Fe(III) היה 3.2 μg / L. אזור שיא מבוסס כיול עבור שני מיני ברזל היה ליניארי מ LOD ל 150 μg / L. בעוד הליניאריות של Fe(III) הוכח גם עבור ריכוז גבוה יותר, השיפוע של עקומת כיול עבור Fe(II) ירד. מגבלת ריכוז עליון של 150 μg / L נחשב מספיק מאז דגימות ביולוגיות רלוונטי Fe(II)/(III) קביעה בדרך כלל יש ריכוז Fe נמוך יותר. במקרה של ריכוז גבוה יותר, דגימות עשויות להיות מדוללות בהתאם. כיול גובה שיא נבדק עד 600 μg / L והראה ליניאריות על פני כל הטווח שנבדק. פעולה זו מוצגת באות 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61055/61055fig2v2.jpg"> איור 2: עקומות כיול (גובה שיא) של Fe(III) ו- Fe(II). כיול שיא הקשור לגובה של שני מיני Fe redox הם ליניאריים עם מדרון של ca. 161 *X <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61055/61055fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
ניתוח של תאי SH-SY5Y הניתוח של תאי SH-SY5Y הראה נדידה מעט איטית יותר עבור מיני רדוקס ברזל בשל מוליכות גבוהה במקצת. Fe(III) היה במעקב ב- 124 s של זמן העברה, Fe(II) ב 158 s של זמן העברה. דיוק זמן ההעברה בתא SH-SY5Y היה 2% עבור Fe(III) ו-3% עבור Fe(II). מדידות כמותיות Fe(II) ו-Fe(III) בשיטה זו חשפו ריכוז Fe(III) של ריכוז 330 μg/L ו-Fe(II) 84 μg/L, שניהם וכתוצאה מכך יחס Fe(II)/Fe(III) של 0.25. 56אלקטרופירוגרמה Fe סלקטיבית בהתאמה מדגים איור 3.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61055/61055fig3v2.jpg"> איור 3: 56אלקטרו-פרוגרמה ספציפית ל-FE של תאי SH-SY5Y. Fe(III) מנוטרת ב 123 s להגיע 58025 cps שיא גובה, להיות מופרד בבירור Fe(II) ב 158 s, להגיע 22800 cps <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61055/61055fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

שיטת הדגימה של רדוקס ברזל מבוססת על ספקטרומטריה של מסת פלזמה בשילוב עם דגימה בשילוב עם ניתוח קצר בריצה אחת. השיטה מנתחת במהירות ומספקת מגבלות נמוכות של כימות עבור מיני רדוקס ברזל על פני מגוון רחב של רקמות ודגימות נוזל ביולוגי.

התקנה של ספקטרומטריה של מסת פלזמה (CE-ICP-MS) לכמת את מיני ברזל רדוקס (Fe(II), Fe(III)

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

תוצאות ברזל מוגזמות ברזל חינם redox פעיל שני פלוס שיכול לגרום להשפעות הרסניות בתוך התא, כגון מתח חמצוני ומוות של תאים על ידי חמצון השומנים המכונה פרופטוזיס. מדידות כמותיות של ברזל ברזלי ו ferric הוא המפתח לתובנה קרובה יותר לתהליכים מזיקים אלה. טכניקת CE-ICP-Ms זו מספקת הן:ניתוח מהיר והן מגבלות כימות נמוכות, ששניהם נחוצים לכמת מינים של ברזל-redox.התחל על ידי בחירת nebulizer עם נפח שאפתן עצמי נמוך והכנת החלקים המתאימים כדי לטעון את הממשק תוצרת בית. חבר שני מחברים נקביים תלת-כיוון עם מחבר לואר חרוט זכר על-ידי חיבור הקצה השמאלי של סרגל הלוטרה התחתון תלת-כיוון למחבר הזכרי והמחבר הזכר לחיבור האמצעי של הלוטרה העליונה. לאחר מכן, לשים צינור סנטימטר אחד מעל חוט הפלטינה ולהשתמש צינור סיליקון סנטימטר אחד כדי לחבר את הצינור הראשון ואת הזרבובית של מחבר luer זכר.תקן את ההרכבה לחיבור האמצעי של מחבר הלוטרה התחתון בשלושה כיוון על-ידי סיבוב בורג. לדחוף צינור סנטימטר אחד מעל השקע של נימי CE ולמקם בשמונה עד תשעה סנטימטרים מהסוף, ולאחר מכן לחבר אותו לזרבובית של מחבר luer זכר עם צינור סיליקון. שים את כל ההרכבה דרך הסרס של מחבר T תלת-כיוון העליון ותקן את מחבר הלוטר הגברי ואת הקצה השמאלי של מחבר הלוטרה תלת-כיוון הנשי על-ידי סיבוב בורג.לאחר מכן תקן את צינור הסיליקון באורך 25 ס"מ בזרבובית של מחבר לואר זכר ותקן את כל ההרכבה בתחתית הרף ממחבר הפיתוי התחתון. לדחוף בחוזקה את צינור הסיליקון אחד סנטימטר, חמישה מילימטרים על קצה nebulizer. בעוד מחבר חרוט לודר הזכר השני מחובר לחלק הבולט של הצינור.הזז את חלק הממשק עם נימי CE בולט אל הקונוס הגברי ב nebulizer, ולאחר מכן בזהירות להכניס את נימי דרך הקונוס הגברי ואת החלק הרחב יותר של נימי nebulizer. במידת הצורך, להתאים את אורך נימי בולט על ידי unscrewing את luer זכר שמאלי, הזזת luer עם צינורות מחוברים לתוך המיקום הנדרש והתקנה מחדש של זה. מחברי הלוטרה הנקבה העליונה צריכים להתאים בחוזקה לקוטרה הגברית.בסיום ההתקנה, המשך בהתקנה עם ICP-Ms. עקומות כיול נוצרו עבור ברזל שלוש וברזל שני מינים redox. גבולות הגילוי היו 3.1 מיקרוגרם לליטר עבור ברזל 2 ו 3.2 מיקרוגרם לליטר עבור ברזל שלוש ליניאריות הוכח עד 150 מיקרוגרם לליטר.הניתוח של SH-SY5Y Cell Lysate הראה נדידה מעט איטית יותר עבור מינים redox ברזל בשל מוליכות גבוהה במקצת. הריכוזים הנמדדים של ברזל 3 וברזל 2 היו 330 מיקרוגרם לליטר ו-84 מיקרוגרם לליטר, בהתאמה. וכתוצאה מכך יחס ברזל 2-3 של 0.25.השלב החשוב ביותר של פרוטוקול זה הוא החדרה זהירה של נימי CE בולט באמצעות ממשק רכוב המיקום המתאים שלה הקשורים נימי nebulizer. השיטות המוצגות כאן עשויות להפוך לכלי מבטיח להעמיק את התובנה לתהליכים מולקולריים תלויי ברזל. מחקרים שתוכננו בקפידה נדרשים כדי לאמת אם ברזל שני פלוס, ברזל שלוש פלוס כימות יכול לשמש סמן ביולוגי פוטנציאלי כדי לאתר רקמות בסיכון לנזק קטלני מתווך ברזל בהקשר של מחלות ניווניות וסרטן.

setup-capillary-electrophoresis-inductively-coupled-plasma-mass

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

Size exclusion chromatography עם פלזמה מצומדת אינדוקטיבית - ספקטרומטריית מסה (ICP-MS) היא כלי רב עוצמה למדידת שינויים בשפע של מטאלופרוטאינים ישירות מדגימות ביולוגיות. כאן אנו מתארים קבוצה של תקני מטאלופרוטאין המשמשים להערכת המסה המולקולרית וכמות המתכת הקשורה לחלבונים לא ידועים.

התקנים עבור כמותי Metalloproteomic ניתוח באמצעות גודל הרחקת ICP-MS

פרוטוקול עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסת נימים באמצעות עיצוב ממשק טיפ נקבובי sheathless מוצג.

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

בעבודה זו מדריך מעשי מסופק, המתאר את הצעדים השונים כדי להקים צימוד של מערכות SMPS ו- ICPMS, וכיצד להשתמש בהם. מוצגות שלוש דוגמאות תיאוריות.

מדריך מעשי על צימוד סריקה ניידות סורק ו מצמידים אינדוקטיבית פלזמה מסה ספקטרומטר (SMPS-ICPMS)

כאן נתאר שיטת תפוקה גבוהה למעקב סמים מקיף המאפשר רזולוציית משופרת וזיהוי של לוחות גדולים של סמים של התעללות מטבוליטים שלהם, עם בקרת איכות המבוססת על הזרקת multisegment-נים אלקטרופורזה-ספקטרומטריית.

מעקב סמים תפוקה גבוהה ומקיף באמצעות ספקטרומטר מסה אלקטרופורזה הזרקה-נימי Multisegment

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון קורונה ביומולקולרית מלאה, חלבונים ומטבוליטים, שנרכשו על ידי ננו-חומרים מביופלואידים באמצעות אלקטרופורזה נימית – גישת ספקטרומטריית מסה.

ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזיס נימית גישות לאפיון החלבון וקורונה מטבולית שנרכשו על ידי ננו-חומרים

מתואר הליך לאלקטרופורזה נימית אלקטרופורזה ספקטרומטריית מסת יינון עבור הכמות המוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים מתמציות תאי יונקים.

כמות מוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים על ידי אלקטרופורזה נימית אלקטרוספריי ספקטרומטריית מסה יינון

הפרוטוקול המוצג מתאר הומוגניזציה של דגימות עם מערבל מעבדה, עיכול חומצה של דגימות מזון באמצעות תערובת של 68 wt% HNO3 ו- 30 wt% H2O2 באמצעות עיכול חומצה רטובה בסיוע מיקרוגל, וקביעה מרובת אלמנטים המבוצעת עם ספקטרומטריית מסות פלזמה מצומדת אינדוקטיבית.

הכנת דגימות מזון באמצעות הומוגניזציה ועיכול חומצה רטובה בסיוע מיקרוגל לקביעת רב-אלמנטים עם ICP-MS

שיטה לזיהוי מינים של חומר בוטני על ידי ניתוח ישיר ב ספקטרומטריית מסה ברזולוציה זמן-גבוה אמיתי ניתוח סטטיסטי רב משתני מוצג.

ראפיד תפוקה גבוהה זיהוי מינים של חומר הבוטני באמצעות ניתוח ישיר בזמן אמת רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה

כאן, אנו מתארים assay כרומטוגרפי בשילוב עם ההפרדה ניידות יון של פפטיד מבשרי ואחריו ברזולוציה גבוהה (~ 30,000) MS-הזיהוי של פפטיד קטעים על כימות של פפטיד מחודדים הסטנדרטים של נוגדן חד שבטי תקציר.

וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

פרוטוקול עבור אפיון ההרכב הכימי של והבל הפה בזמן אמת באמצעות nanoelectrospray משני יינון מצמידים ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה הוכח.

אנליזת נשימה בזמן אמת באמצעות Nanoelectrospray משני יינון מצמידים ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה

למדו שיטת CE-ICP-MS לכימות מיני ברזל רדוקס Fe(II) ו-Fe(III) בביוכימיה אנליטית. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר ורגישות גבוהה לחקר תהליכים תלויי ברזל ומחלות נוירודגנרטיביות.

התקנה של ספקטרומטריה של מסת פלזמה (CE-ICP-MS) לכמת את מיני ברזל רדוקס (Fe(II), Fe(III)

גלה סרטונים נוספים