Name: חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למד פרוטוקול חיסון אשכי Drosophila melanogaster בשלמות לצורך מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת מימדית. השיטה משפרת חדירת נוגדנים ומאפשרת ניתוח כמותי של חלבונים בזרעונים גדולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לפ. וריג'ייזר, ג'יי יוהנסן ה., אוקהורה על נוגדנים וא. דבק, מרכזי המניות של בלומינגטון וינה לזבובים. תודה לסי ג'קסון על הצעות ודיונים מעוררים.

1. אוסף האשכים של דרוזופילה
הערה: זכרים צעירים (0-15 שעות לאחר eclosion) נחוצים לבדיקת תאי נבט דיפלואיד (כלומר, זרעונים וזרע).
<ol><li>בחר זבובים צעירים ככל האפשר כדי למזער את ההפרעה מפיתוח spermatids.</li>
	<li>הרדמה זבובים על ידי חשיפה קצרה פחמן דו חמצני ולהעביר כרית זבוב14,15.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ מנתח (הגדלה 10x), השתמש במלקחיים כדי להסיר את הראש.</li>
	<li>העבר 5 עד 10 זבובים ערופים ל 100 μL של חיץ של רינגר (183 mM KCI, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, 1 מ"מ EDTA, מעכב חלבון מלא, pH 6.8) על שקופית זכוכית מצופה סיליקון על תמיכה ברקע שחור.</li>
	<li>עם ניתוח מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40, השתמש בזוג אחד של מלקחיים מספר 5 כדי להחזיק זבוב בין בית החזה לבטן, ועם מלקחיים אחרים, משוך את הבטן מבית החזה. לבודד במהירות את האשכים ואת הרקמות הסמוכות מן פגר זבוב15 ומניחים טיפה חדשה של חיץ של רינגר על אותה שקופית.</li>
	<li>לאחר כל האשכים מוכנים, לנקות את האשכים מן הרקמות הנותרות (בלוטת עזר ואברי מין חיצוניים).</li>
	<li>הסר מאגר עודף מהשחרור המכיל את האשכים המנותחים. בדרך כלל, השתמש פיפטה p200 עם קצה μL 10 מצויד על גבי קצה 200 μL. זה מאפשר הסרת עודף נוזלי דרך צמצם קטן. מניחים טיפה של 4% תיקון paraformaldehyde על גבי טיפה המכילה את האשכים מנותח, ולאחר מכן להעביר במהירות את האשכים לצינור המכיל פתרון קיבוע טרי.</li>
</ol>2. קיבעון פרפורמלדהיד
<ol><li>הכן 2 מ"ל של פתרון קיבוע ממש לפני השימוש: 600 μL של 4% paraformaldehyde מדולל מלוחים אגירה פוספט (PBS) עם 30 μL של NP40 20% בתוספת 1200 μL של heptane בצינור מיקרוצנטריפוגה סיליקון 2 mL. השתמש 4% paraformaldehyde ב PBS מוכן 600 μL aliquots ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס. זהירות: הפטן ופרפורמלדהיד רעילים ויש לטפל בהם במכסה המנוע. יש להשליך אותם בהתאם לתקנות המכון המארח.</li>
	<li>העבר את האשכים באמצעות מיקרופיפט p200 עם קצה צמצם רחב לפתרון PFA / NP40 / heptane. לנער את הצינור למעלה ולמטה במשך 30 s ביד. ממשיכים לתקן את האשכים על מערבל סיבובי בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
	<li>עצרו את המיקסר הסיבובי והניחו את הצינור בארון תקשורת צינורי כדי לאפשר הפרדת פאזה ואת האשכים להתיישב לתחתית הצינור.</li>
	<li>הסר את כל heptane ואת הפתרון התיקון ולשטוף את האשכים במהירות שלוש פעמים עם 1x PBS.</li>
	<li>העבר לצינור בודד נקי של 200 μL. בצע את כל הדגירות בצינורות קטנים אלה כדי למזער את כמויות הנוגדנים המועסקים.</li>
	<li>הסר מאגר עודף באמצעות מיקרופיפט 200 μL עם P200 וגם קצה P10 מצורף. היזהר לא לשאוף אשכים.</li>
	<li>יש לשמור את האשכים ב-1x PBS על הקרח עד שכל הדגימות יהיו מוכנות.</li>
</ol>3. כתמי נוגדנים בתמיסה
<ol><li>להשליך את PBS ולהשאיר אשכים ב 0.3% PBS-T במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל קרום התא.</li>
	<li>טרום דגירה באותו חיץ בתוספת 5% סרום עיזים רגיל (NGS) במשך 1 שעות.</li>
	<li>הוסף 200 μL של הנוגדן העיקרי מדולל ב 0.3% PBS-T בתוספת 5% NGS(שולחן החומרים).</li>
	<li>דגירה הנוגדן העיקרי לילה ב 4 °C (או טמפרטורת החדר) עם תסיסה עדינה על נדנדה.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים ב 0.3% PBS-T במשך 15 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. אפשר האשכים להתיישב לתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה.</li>
	<li>הוסף 200 μL של נוגדן משני מדולל 1:500 מהסדרה מצומד DyLight.</li>
	<li>דגירה הנוגדן המשני בתא כהה במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף 0.3% PBS-T במשך 15 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן חזרו על הפעולה עם 0.2% PBS-T ו-0.1% PBS-T, בכל פעם למשך 30 דקות על נדנדה בטמפרטורת החדר. בצע שטיפה סופית ב 1x PBS במשך 30 דקות כדי להסיר את חומר הניקוי.</li>
	<li>הוסף 180 μL של פתרון DAPI ב 1 מיקרוגרם / מ"ל ב 1x PBS במשך 15 דקות. פתרון המניה הוא 10 מ"ג / מ"ל ב H2O. הימנעו מפתרון מלאי ב- PBS, אשר יכול להפחית את אות הכתמת DAPI על כרומטין מפוזר בזרע גדול יותר.</li>
	<li>לשטוף 3x במשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול על שקופית נקייה.</li>
	<li>שאפתן אשכים ולשים אותם על השקופית. שטיפת קצה הצמצם הרחב ב-0.1% PBS-T מונעת מה האשכים להידבק לקצה. הסר PBS עודף.</li>
	<li>הוסף טיפה (כ 100 μL) של Citifluor AF1.</li>
	<li>מניחים בעדינות כיסוי זכוכית על הרקמה, מקפידים להימנע מלכידה של בועות אוויר.</li>
	<li>לאטום את הכיסוי לשקופית באמצעות לק ברור.</li>
	<li>שים לב לשקופיות במיקרוסקופ.</li>
</ol>4. ניתוחי קולוקליזציה
<ol><li>השג תמונות קונפוקל. השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקל Zeiss LSM 710 (63x Plan שמן אפוכרומטי) ברזולוציית z של 0.5 או 1 מיקרומטר.</li>
	<li>בחר תאים שונים מתוך אשכים עצמאיים.</li>
	<li>יבא תמונות לתוכנת עיבוד (למשל, Imaris).</li>
	<li>הגדר את הגרעין לפי פילוח ידני כדי לא לכלול את הגרעינים השכנים. השתמש בתוכנת קולוק; הוא אוסף את מקדמי המתאם (PCCs) של פירסון בתוך כל אמצעי האחסון בין 2 פלואורופורים.</li>
</ol>

<ol><li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+in+Drosophila+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).</li>
<li>Fabbretti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+Analysis+of+Nuclear+Lamina+Behavior+during+Male+Meiosis+and+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0151231(2016).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).</li>
<li>Hiller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testis-specific+TAF+homologs+collaborate+to+control+a+tissue-specific+transcription+program%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program.</a> Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).</li>
<li>Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+TAFs+counteract+Polycomb+to+turn+on+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation.</a> Science. 310 (5749), 869-872 (2005).</li>
<li>White-Cooper, H., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+aspects+of+transcription+regulation+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique aspects of transcription regulation in male germ cells.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).</li>
<li>Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAD1%3A+Kinetochore+Receptors+and+Catalytic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51(2018).</li>
<li>Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+checkpoint+protein+Xmad1+recruits+Xmad2+to+unattached+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).</li>
<li>Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+checkpoint+proteins+HsMAD1+and+HsMAD2+are+associated+with+nuclear+pore+complexes+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase.</a> Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).</li>
<li>Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+Drosophila+nuclear+envelope+components%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).</li>
<li>Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad1+influences+interphase+nucleoplasm+organization+and+chromatin+regulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila.</a> Open Biology. 8 (10), (2018).</li>
<li>Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smurf-mediated+differential+proteolysis+generates+dynamic+BMP+signaling+in+germline+stem+cells+during+Drosophila+testis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development.</a> Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).</li>
<li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+started%3A+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2641(2011).</li>
<li>Gigliotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nup154%2C+a+new+Drosophila+gene+essential+for+male+and+female+gametogenesis+is+related+to+the+nup155+vertebrate+nucleoporin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene.</a> Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).</li>
<li>Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+lamina+regulates+germline+stem+cell+niche+organization+via+modulation+of+EGFR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).</li>
<li>Fawcett, D. W., Chemes, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+distribution+of+nuclear+pores+during+differentiation+of+the+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells.</a> Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).</li>
<li>Bolte, S., Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue%2C+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Immunostaining+of+Drosophila+testes%22">Immunostaining of Drosophila testes</a>. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%22">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes</a>. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis%3A+analysis+of+meiosis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis.</a> Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).</li>
<li>Theofel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tBRD-1+and+tBRD-2+regulate+expression+of+genes+necessary+for+spermatid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation.</a> Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).</li>
<li>Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+dany+is+essential+for+transcriptional+control+and+nuclear+architecture+in+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes.</a> Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מספק שיטה לאימונולאבלינג מוצלח של אשכי דרוזופילה בוגרים בכל ההר. כפי שדווח בהליכים אחרים יש להשתמש בזכרים צעירים (אפילו קיצרנו את הגיל לפחות מ -20 שעות לאחר eclosion) כדי למזער את נוכחותם של זרע מתפתח, אשר מסתכן בשיבוש הזרע. הניתוח צריך להיות מהיר ואת דילול הנוגדן חייב להיות מותאם כדי לייעל את יחס אות לרעש21,22,23. מכיוון ששימוש בפרוטוקולים אחרים, לא ראינו כתמים לאורך כל עומק האשכים, פיתחנו שיטת קיבוע המשלבת PFA יחד ...

אשכי דרוזופילה הם מודל בעל ערך לחקר האדריכלות הגרעינית. בתאי זרע מיטוטיים, הנפח הגרעיני תפוס במידה רבה על ידי כרומטין. תאים אלה עוברים ארבעה סבבים של חלוקה, לייצר ציסטה של 16 זרעונים ראשוניים. במהלך הימים הבאים, spermatocytes לעבור 6 שלבים התפתחותיים (S1-S6), גדל מאוד בנפח, בקירוב 20-פי1,2. הם גם משנים את המורפולוגיה הגרעינית שלהם. קווי המתאר של הגרעין, המתגלה על ידי למין Dm0, הופך לא סדיר ומראה invaginations עמוק1,3. זה מלווה בשינויים ושינויים נרחבים בביטוי גנים בארגון כרומטין1,4,5,6,7. הכרומוזומים הבין-פאזיים מוגדרים היטב בשלב S4-S5, ויוצרים שלוש מסות נפרדות המתאימות ל-2 האוטוסומים הדו-כיווניים העיקריים ולזוג ה-X-Y המעוגן בגרעין.
Mad1 היה מבודד במקור כמרכיב מרכזי במחסום המיטוטי (נבדק בשנת8). ב interphase, הוא מתואר כממוקם בעיקר על המעטפה הגרעינית, אלא גם בגרעין9,10,11. במבחן דרוזופילה, דיווחנו כי Mad1 בולט בגרעין, הקשור באופן אינטימי עם שתי מסות כרומטין אוטוזומליות גדולות ובמידה פחותה עם כרומטין XY. הגדרנו מבנה זה הקשור לכרומטין כ- MINT (טריטוריה תוך-גרעינית המכילה Mad1)12. ארבעה חלבונים אחרים היו קשורים MINTs ב spermatocytes: הגרעין Mtor / Tpr, פפטידאז SUMO Ulp1, חלבון מחסום מיטוטי Mad2 ו subunit של קומפלקס דמוי פוליקומב Raf212.
כדי להשלים את התיאור של MINTs, היינו צריכים להשתמש בנוגדנים והתמודדנו עם הבעיות הטכניות שנתקלו בדרך כלל עם immunostaining ב testis: חדירות ירודה וכתוצאה מכך אי אחידות משמעותית של כתמים בעומק האשכים, במיוחד בזרעונים הגדולים. ההכנות המודלגות הגבירו את הגישה לנוגדנים אך הובילו לתמונות דחוסות, הגבילו את הניתוחים התלת-ממדיים ומניעת מדידה של פלואורסצנטיות כמותית, כולל קולוקליזציה. הבעיה של חדירת נוגדנים יכולה להיות מטופלת גם על ידי סוכנים מחלחלים כגון 0.3% Na deoxycholate13, אבל הליך זה לא בידיים שלנו להניב תוצאות לשחזור. מכיוון שביצענו ניסויים רבים בתיוג משותף, חיפשנו לשפר את פרוטוקול ההחלחלה. השילוב של 1% NP40 בתוספת הפטאן הביא לשחזור רב יותר, במיוחד בחקר הזרעונים הגדולים.
פרוטוקול זה מבצע קיבעון ו immunostaining של האשכים בהשעיה, שיפור איכות המדגם, כמו גם שיפור הרבייה, ועיבוד זה מתאים מיקרוסקופיה confocal. השתמשנו בפרוטוקול כדי להגדיר טוב יותר את היחסים המרחביים של חלבוני מעטפה גרעינית מסוימים עם המבנים הגרעיניים של זרעונים גדולים. שיטה זו תאפשר חקירות טובות יותר של השינויים המלווים את התפתחות הזרע, למשל השינויים המבניים הדינמיים של הגרעין כולל כרומטין, גרעין והנקבוביות הגרעיניות.

<table><tbody><tr><td>Drosophila srains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO</td><td></td><td></td><td>Gift from A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)</td></tr><tr><td>Mad1-GFP</td><td></td><td></td><td>J Cell Sci. 2011 May 15; 124 (Pt 10): 1664-71.</td></tr><tr><td>מטור RNAi&nbsp;</td><td>מזהה VDRC</td><td>110218</td><td>מרכז RNAi דרוזופילה וינה</td></tr> <tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>יש להכין תמיסת מלאי</td> <td>Thermo</td><td>D1306</td> ב- H2O</tr><tr><td>Dumont # 5 Fine Forseps&nbsp;</td>כלי <td></td><td></td><td>מדע עדינים</td></tr><tr><td>MBP קידוח רחב טיפים פיפטה</td><td>פיברנד</td><td>11917744</td><td>קצה צמצם רחב</td></tr><tr><td>תרמו מדעי&nbsp; 0.2 מ"ל צינור בודד</td><td>תרמו</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל צינורות מיקרו צנטריפוגה&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>T3531-200EA&nbsp;</td><td>שפופרת סיליקון 2 מ"ל</td></tr><tr><td>Citifluor AF1</td><td>Citifluor</td><td>AF1</td><td></td></tr><tr><td>Dakopen&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>Z377821-1EA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל (NGS)</td><td>Sigma</td><td>NS02L-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 4%</td> <td>Sigma</td><td>P6148-500G&nbsp;</td><td>פרפורמלדהיד (4%) מומס ב-PBS 1X&nbsp;; aliquot ב-600 מ"ל&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>תרמו</td><td>14190094</td><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td></tr><tr><td>0.1% (0.2 או 0.3%) PBS-T&nbsp;</td><td></td><td></td><td>PBS 1X&nbsp; מכיל 0.1% (0.2% או 0.3%) טריטון X-100</td></tr><tr><td>טריטון X-100, לביולוגיה מולקולרית,&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td><חזק>נוגדנים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP מאיץ</td><td>Chromotek</td><td>gba488</td><td>1/200</td></tr><tr><td>עכבר נגד Mtor</td><td></td><td></td><td>1/40 מתנה מג'יי ג'והנסן, אוניברסיטת איווה</td></tr><tr><td>סטייט חולדה אנטי-Nup62</td><td></td><td></td><td>1/200 מתנה מ H. Ohkura (אוניברסיטת אדינבורו, בריטניה</td></tr><tr><td>שרקן ניסיונות אנטי-Ulp1</td><td></td><td></td><td>1/200 מתנה מ- C. P. Verrijzer, אוניברסיטת ארסמוס, רוטרדם</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-Raf2</td><td></td><td></td><td>1/200 מתנה מ- C. P. Verrijzer, אוניברסיטת ארסמוס,</td></tr><tr><td>סדרת DyLight Rotterdam מצומדת&nbsp;</td><td>תרמו</td><td></td><td>1/500 חמור אנטי (שרקן, עכבר, &nbsp; ארנב או חולדה) כנוגדנים שניים</td></tr></tbody></table>

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

Immunostaining of Whole-Mount Drosophila Testes for 3D Confocal Analysis of Large Spermatocytes

אשכי דרוזופילה הם מערכת מודל רבת עוצמה לחקר תהליכים ביולוגיים כולל ביולוגיה של תאי גזע, ארכיטקטורה גרעינית, מיוזיס והתפתחות זרע. עם זאת, immunolabeling של האשכים Drosophila כולו קשורה לעתים קרובות עם אי אחידות משמעותית של כתמים עקב חדירת נוגדנים. ההכנות מעוכות רק חלקית להתגבר על הבעיה שכן הוא מקטין את איכות 3D של הניתוחים. בזאת, אנו מתארים פרוטוקול הרכבה שלם באמצעות NP40 והפטן במהלך הקיבעון יחד עם immunolabeling במדיה נוזלית. הוא משמר את עוצמת הקול המתאימה למיקרוסקופיה קונפוקלית יחד עם תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו מראים דוגמאות שונות של שחזור תלת מימדי של גרעיני זרע מחלקים קונפוקליים. השחזור התוך-אשכים והבין-אשכים מאפשר כימות תלת-ממדי והשוואה של פלואורסצנטיות בין תאים בודדים מגנוטיפים שונים. השתמשנו ברכיבים שונים של מבנה MINT תוך-גרעיני (הטריטוריה הגרעינית התוך-גרעינית המכילה Mad1) כמו גם בשני רכיבים הקשורים למתחם הנקבוביות הגרעיניות כדי להמחיש פרוטוקול זה ויישומים שלו על התאים הגדולים ביותר של האשכים, הזרעונים S4-S5.

המכשול העיקרי להשגת כתמים נאותים של אשכי Drosophila הוא חדירה מוגבלת של נוגדנים, אשר נפתרה חלקית באמצעות הכנות מעוכות אבל במחיר של גרימת הגבלה של ניתוחים 3D (למשל ייצוג 3D או מידה של colocalization). הנוהל מאפשר תיוג אחיד ומשמר את נפח כל תאי האשכים. כאן מיקדנו את האיור של השיטה על ייצוג 3D של זרע S4-S5, כפי שהם התאים הגדולים ביותר ולכן רגישים יותר עיוות מן הסקווש. השתמשנו בסמנים גרעיניים שונים, כולל נוקלאופורינים ותיוג תחום MINT תוך-גרעיני (הטריטוריה הגרעינית התוך-גרעינית המכילה Mad1) המתואר על ידי החלבון המיטוטי Mad1<su...

אנו מציגים כאן פרוטוקול משופר להכנה וחיסון של כל ההר של אשכי דרוזופילה, מתאים למיקרוסקופיה קונפוקלית וגם מאפשר תיוג ניתן לשחזור ואמין. אנו ממחישים פרוטוקול זה על ידי ייצוג תלת מימדי וכימות של ניסויי קולוקליזציה על זרעונים S4-S5 גדולים.

Drosophila testes are a powerful model system for studying biological processes including stem cell biology, nuclear architecture, meiosis and sperm ...

צביעה שלמה של רקמות דרוזופילה, כגון דגימות אשכים, היא לרוב בעייתית עקב חדירת נוגדנים מוגבלת. פרוטוקול הקיבוע שלנו באמצעות NP40 והפטן מאפשר תיוג אחיד וניתן לשחזור. על ידי שמירה על צורת הרקמה תוך מתן אפשרות לחדירה עמוקה של נוגדנים, הליך זה מקל על רכישה ניתנת לשחזור ולכימות של צביעה חיסונית בתלת מימד, הן בנפרד והן במחקרי קו-לוקליזציה.להערכת תאי נבט דיפלואידים, אפס עד 15 שעות לאחר האקלוזיה, יש להרדים את הזבובים על ידי חשיפה קצרה לפחמן דו חמצני, ולהעביר את הזבובים למשטח זבובים. הניחו את הכרית מתחת למיקרוסקופ מנתח בהגדלה של פי 10, והשתמשו במלקחיים כדי להסיר את הראשים מחמישה עד עשרה זבובים זכרים. העבירו את גופי הזבוב ערופי הראש ל-100 מיקרוליטר של המאגר של רינגר על מגלשת זכוכית מצופה סיליקון על רקע שחור, והשתמשו בהגדלה של פי 40 ובזוג מלקחיים מספר חמש כדי לתפוס זבוב בין בית החזה לבטן.לאחר מכן משוך את הבטן הרחק מבית החזה ובודד במהירות את האשכים והרקמות הסמוכות מפגר הזבוב. לאחר איסוף כל האשכים, נקה את הדגימות מכל הרקמה שנותרה והשתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר את המאגר העודף מסביב לאשכים המנותחים. לאחר מכן הניחו טיפה של 4% פרפורמלדהיד על האשכים והעבירו במהירות את הרקמות לצינור המכיל שני מיליליטר של תמיסת 4% פרפורמלדהיד טרייה שהוכנה בתוספת 20% NP40 והפטן.לקיבוע יסודי של דגימות האשכים, יש לנער את הצינור אנכית למשך 30 שניות לפני דגירה של האשכים על מערבל סיבובי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בתום הדגירה, העבירו את הצינור למתלה צינורות ואפשרו לאשכים להתיישב בתחתית הצינור. הסר את כל תמיסת ההפטן והקיבוע ושטוף במהירות את האשכים שלוש פעמים עם PBS.לאחר הכביסה האחרונה, העבירו את האשכים לצינור חדש של 200 מיקרוליטר והשתמשו בפיפטה של 200 מיקרוליטר המצוידת בקצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להסיר כל חיץ עודף. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטר PBS טרי לצינור והניחו את האשכים על קרח. לתיוג נוגדנים של דגימות האשכים, החלף את ה-PBS ב-200 מיקרוליטר של 0.3% PBS-T למשך 30 דקות דגירה בטמפרטורת החדר.לאחר חדירה, חסום כל קשירה לא ספציפית עם 0.3% PBS-T בתוספת 5% סרום עיזים רגיל למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר לפני הוספת 200 מיקרוליטר של הנוגדן העיקרי המעניין מדולל ב-0.3% PBS-T בתוספת 5% סרום עיזים רגיל לדגירת לילה בארבע מעלות צלזיוס או בטמפרטורת החדר עם נדנדה. למחרת בבוקר, שטפו את הדגימות בשלוש שטיפות של 15 דקות עם 0.3% PBS-T טרי ונדנוד בטמפרטורת החדר לכל שטיפה ואפשרו לאשכים להתיישב בתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה. הוסף 200 מיקרוליטר של נוגדן משני מתאים לצינור לדגירה של ארבע שעות עם נדנוד בטמפרטורת החדר מוגן מאור לפני שטיפת הדגימות ב-0.3% PBS-T טרי לכל שטיפה, כפי שהודגם.לאחר הכביסה של 0.3% PBS-T, שטפו את הדגימות פעם אחת ב-0.2% PBS-T ופעם אחת ב-0.1% PBS-T למשך 30 דקות לכל שטיפה על הנדנדה, ולאחר מכן שטיפה אחרונה של 30 דקות ב-PBS בלבד. לאחר שטיפת ה-PBS, סמן את הדגימות ב-180 מיקרוליטר של תמיסת DAPI של מיקרוגרם אחד למיליליטר ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור, ולאחר מכן שלוש שטיפות של 5 דקות ב-PBS טרי לכל כביסה. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול על מגלשה נקייה, והשתמש בקצה פיפטה מוכן של 0.1% PBS-T כדי להעביר את האשכים לשקופית.שאפו את כל ה-PBS העודף והוסיפו 100 מיקרוליטר של Citifluor AF1. הנח בעדינות החלקה של כיסוי זכוכית מעל הרקמה, הקפד להימנע מלכידת בועות אוויר, והשתמש בלק שקוף כדי לאטום את החלקת הכיסוי למגלשה לפני התבוננות בשקופיות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי. לאחר רכישת תמונות קונפוקליות של הדגימות, ייבא את התמונות לתוכנת ניתוח תמונה מתאימה.לאחר מכן השתמש בפילוח ידני כדי להגדיר את הגרעין בתוך כל תא ולקבוע את מקדמי המתאם של פירסון בתוך כל הנפח בין שני פלואורופורים. פרוטוקול זה מאפשר רכישת תמונות קונפוקליות באיכות מספקת לטיפול לצורך בנייה מחדש של תלת מימד. לדוגמה, בארבעת החלקים הסדרתיים הסמוכים הללו של זרע בשלב S5, נצפית רמה נמוכה של Mad1 במעטפת הגרעין וניתן לדמיין הצטברות ברמה גבוהה של Mad1 בשילוב עם צביעת DAPI בתוך הגרעין.בתמונה משוחזרת תלת מימדית זו, ניתן לראות את הנוכחות ברמה הנמוכה של Mad1 על פני השטח הגרעיני והצטברות ברמה גבוהה של Mad1 בתוך הגרעין יחד עם ה-DNA. בבנייה מחדש תלת מימדית זו, ניתן להבחין בזרעונים גדולים של S5 המוכתמים בנוקלאופורין 62 ו-Mad1 או Importin-beta ו-DAPI. בשני השחזורים, נראה כי הרכיבים הקשורים לנקבוביות הגרעין מפוזרים באופן לא אחיד על פני שפת הגרעין כנקודות בגודל לא סדיר.תוך שימור הנפח התלת-ממדי של התאים, פרוטוקול זה מאפשר גם חדירה אחידה של נוגדנים מעניינים לעומק של כל תא, ומאפשר ניתוחים כמותיים, כגון קולוקליזציה. מכיוון שהפרוטוקול מאפשר מדידה אמינה של קולוקליזציות מאשכים עצמאיים, ניתן להשתמש בו גם להשוואת צביעה בגנוטיפים שונים של זבובים. כמות ה-NP40 המשמשת היא קריטית לחדירות מספקת.אם מקפידים על הנוהל, ניתן להשיג תיוג הניתן לשחזור ושימור מבנה גרעיני תלת מימדי. למרות שצביעה שלמה של רקמות בתוך דרוזופילה יכולה להיות מסובכת, ניתן להתאים פרוטוקול זה בקלות לדגימות אחרות.

immunostaining-whole-mount-drosophila-testes-for-3d-confocal-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כמה נישות ותאי גזע צורה במהלך הפיתוח היא שאלה חשובה עם השלכות מעשיות.

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

כדי להבין כיצד צורות תאים מורכבים, כגון דנדריטים עצביים, מושגות במהלך הפיתוח, חשוב להיות מסוגל הארגון במדויק microtubule assay. כאן אנו מתארים את שיטת תיוג חזקים immunohistological לבחון ארגון microtubule הדנדריטים של נוירון דנדריטים arborization חושית, קנה הנשימה, שריר,...

תיוג Immunohistological של microtubules ב דנדריטים Neuron חושי, Tracheae, והשרירים של תסיסנית גוף Larva הכותל

הדמיה של חלבוני centrosomal במהלך spermatogenesis דרוזופילה היא שיטה רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לביולוגית centrosome, כמו גם על מנת להבהיר את הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליך זה.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים

צביעה חיסונית היא טכניקה יעילה להמחשת סוגי תאים וחלבונים ספציפיים בתוך רקמות. על ידי שימוש בסוניקציה, הפרוטוקול המתואר כאן מקל על הצורך לנתח רקמות Drosophila melanogaster מעוברים וזחלים בשלב מאוחר לפני צביעה חיסונית. אנו מספקים מתודולוגיה יעילה לצביעה חיסונית של זחלי הר שלמים קבועים בפורמלדהיד.

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

המטרה של פרוטוקול זה היא לנתח את חלוקת התא ברקמה שלמה על ידי מיקרוסקופ התאים החיים והקבוע באמצעות דרוסוילה מיוטיק מאיוציטים. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד את כל האשכים שלמים, מזחלים מדרוזופילה ומהגלמים המוקדמים, וכיצד לעבד ולטעון אותם למיקרוסקופיה.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

פרוטוקול מוצג המאפשר הדמיה של Drosophila melanogaster שלם בכל שלב של פיתוח באמצעות טומוגרפיה מיקרו מחשב.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית תאים חיים ברזולוציית-על ברקמה שלמה. התקנו את התנאים להדמיית אוכלוסיית תאי גזע בוגרים רגישים מאוד בסביבת הרקמה הטבעית שלה. טכניקה זו כרוכה באיזון רזולוציה זמנית ומרחבית כדי לאפשר תצפית ישירה של תופעות ביולוגיות ברקמה חיה.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

פרוטוקול זה נועד לדמיין אגרגטים הטרוקרומטין בתאי טוריטנה Drosophila.

כתמים אימונופלואורסצנטיים להדמיה של חלבונים הקשורים הטרוכרומטין בבלוטות הרוק של דרוסופילה

פרוטוקולים אלו מתארים כיצד לאפיין את הארגון ותפקוד החסימה של צמתקי מחיצה מקופלים באפיתל העוברי של דרוזופילה.

ניסויי צביעת חיסון וחדירת צבע להגדרת חלבוני צומת ספטט מקופלים בליבה באפיתל עוברי של דרוזופילה

למד פרוטוקול חיסון אשכי Drosophila melanogaster בשלמות לצורך מיקרוסקופיה קונפוקלית תלת מימדית. השיטה משפרת חדירת נוגדנים ומאפשרת ניתוח כמותי של חלבונים בזרעונים גדולים.

חיסון של אשכי דרוזופילה הר שלם לניתוח קונפוקלי תלת מימדי של זרעונים גדולים

גלה סרטונים נוספים