מודל אדם רב-תאי המורכב מתאי אפיתל ותאי מערכת החיסון העיקריים להערכת סיכונים

מודל אודיו אנושי אינדיבידואלי זה משתמש בתאי חיסון רלוונטיים ככלי רב עוצמה לחיזוי תגובה חיסונית חריפה של חומרים כולל ננו-חומרים ותרופות ידע. תרופות אלה משלבת תאי אפיתל אנושיים ותאי חיסון ראשוניים אנושיים כדי להעריך את התגובות הספציפיות האלה. השימוש במונוציטים טריים וקפואים מספק גמישות לתוכנית הניסוי.

מחקרים רבים הראו כי מודל זה יכול לספק תובנה על התקשורת הבין-כוכבית בין חוש התנהגות לחוש החיסוני. כמו הדגמה זו כוללת את כל הפרטים החשובים עבור הרבעה המודל תכונה אישית בתרבות התא, הוראות חזותיות לשכפל ניסויים. מספר שלבים בפרוטוקול שלפוחית השתן מורכבים ודורשים טיפול מיוחד.

לכן הם הוכחו עם כל הפרטים הנדרשים כי הם יכולים בקלות אחריו. לבידוד מונוציטים של דם היקפי מעילים אנושיים של באפי, פצלו את תכולת שקית המעיל של באפי, באופן שווה בין 250 צינורות חרוטיים מיליליטר. בזהירות להביא את הנפח הכולל בכל צינור 250 מיליליטר עם PBS ומערבבים את הצינורות עם שלושה היפוכים עדינים.

לאחר מכן לפצל את פתרון PBS מעיל באפי באופן שווה בין ארבעה צינורות חדשים 50 מיליליטר, ולאחר מכן להוסיף 10 microliters של CD 14 חרוזים מגנטיים חיוביים התאים הכולל השביעי לצינור ומערבבים היטב על ידי צינורות. עם מילוי, לנתק את פיפטה מן הצינור ומיד חיבר את הפתח העליון של פיפטה עם אגודל ואז הניח את פיפטה מלא בתחתית צינור אחד לנתק את פתיחת פיפטה כדי לאפשר בינוני שיפוע צפיפות לזרום לאט מתחת לתערובת PBS מעיל באפי, עד מיליליטר אחד של מדיום שיפוע צפיפות נשאר בתוך פיפי. כאשר בינוני שיפוע צפיפות נוספה לכל צינור באותו אופן להפריד את התאים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות ולהשתמש פיפטה סרולוגית לאיסוף לבן 2-3 מילימטר עבה שכבת תאים חד-גרעיניים דם היקפיים בין הפלזמה לבין שכבות בינוניות שיפוע צפיפות.

הדרך הטובה ביותר לחבר את השכבה היא להסיר את הפלזמה תחילה ואז אתה מדכא את הפיפסות הלוגיות שלנו כדי לאסוף את התאים. משוך את התאים mononuclear הדם ההיקפיים מכל קבוצה של שני צינורות לתוך צינור אחד חדש 50 מיליליטר ולשטוף את התאים פעמיים עם נפח כולל של 50 מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף. ואז להשליך supernatant ולתלות את פיפטה בכל אחד בחמישה מיליליטר של PBS טרי בריכה מתלים התא לתוך צינור אחד לספירה.

לאחר הספירה, צנטריפוגה התאים שוב resuspend pelette ל 80 מיליליטר של חיץ הפרדה מגנטית לכל לטפל בתאים השביעיים. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של CD 14 חרוזים מגנטיים חיוביים לכל להשתתף בתאים הכולל השביעי לצינור ומערבבים היטב על ידי צינורות. לאחר דגירה של 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס שוטפים עמוד מגנטי עם שלושה מיליליטר של חיץ הפרדה מגנטית ומוסיפים את התאים לעמודה.

לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם שלושה כמויות מיליליטר של חיץ לכל לשטוף ולהעביר את העמוד לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של חיץ הפרדה מגנטית טרי. לאחר מכן השתמש הבוכנה וחמישה מיליליטר של חיץ כדי לשטוף את התקליטור 14 תאים חיוביים לתוך הצינור. האם לגרום התביור של תקליטור מבודד חרוז מגנטי 14 תאים חיוביים.

ראשית, להשתמש מחדש את התאים פעם אחת לטפל ששת התאים לריכוז מיליליטר במדיום תאים. או הבחנה MDDC, להוסיף 10 ננוגרם למיליליטר של מושבת מקרופאג אתר גרנולה גורם מגרה לצינור ולהוסיף שלושה מיליליטר של תאים לכל באר של צלחת תרבות תאים שש היטב, או דידול MDM להוסיף 10 ננוגרם למיליליטר של מושבת מקרופאג מגרה גורם לתאים צלחת התאים כפי שהודגם רק. כדי להקים מודל אנושי של רקמת תא אפיתל מכתשית משולשת, העבר תחילה 1.5 מיליליטר של מדיום תרבות תאים טרום-חמה למספר המתאים של בארות של צלחת 12 היטב והצבת תרבות תאים מוכנסת לתוך כל באר.

הבא להוסיף 500 microliters של השעיה תא אפיתל בצפיפות של חמש פעמים 10 לתאים החמישי למיליליטר לתוך הצד apical של כל הכנס לכסות את הצלחת עבור אינקובציה ארבעה ימים באינקובטור תרבות התא. או זריעת MDDC מחליף supernatant מן הבאר של שש צלחות גם המשמשים התברות MDDC, עם מיליליטר אחד של מדיום תרבות תאים חמים טריים ולהשתמש מגרד תאים כדי לנתק את תאי הדבקה מכל באר. לשטוף כל טוב שלוש פעמים עם supernate ובכל באר ולשלב את כל פתרונות התא לתוך צינור צנטריפוגה אחת.

MDDC שנקטף על ידי צנטריפוגה ו tweezers סטריליים למקם את מוסיף מ 12 צלחות גם במהופך בצלחת פטרי סטרילית. לגרד את כל תאי האפיתל מהצד הבסיסי של הכנס ולתלות מחדש את MDDCs במדיום תרבות תאים טריים לעשות ריכוז של 4.2 פעמים 10 של תאים אלה למיליליטר. לאחר מכן להוסיף 150 microliters של תאים על כל הכנס, כך פני השטח הבסיסיים כולו של הכנס מכוסה באותה מידה עם הנוזל ללא בועות.

עבור זריעת MDDM לאחר קצירת MDDMs מבודל כפי שהודגם עבור MDDCs, לדלל את התאים 2.5 פעמים 10 לארבעה תאים למיליליטר של ריכוז בינוני של תאים טריים ולהוסיף 500 microliters של תאים במורד הקיר של כל תא אפיתל MDDC המכיל תא תרבות להוסיף, ולאחר מכן למקם את המכסה על הצלחת ולמקם את הצלחת בממגר תרבות התא עבור 24 שעות. למחרת שאף את העל-טבעי הן מאזורי האפיקל והן מאזורי הבזל של כל תכלית תאים והן מ- Wells. לאחר מכן אתה מעקר פינצטה כדי להרים את התוספות מה בארות ולהוסיף 600 microliters של טרום המלחמה טריים לתרבות התא בינוני לכל באר.

לאחר שישה ימים של התבלטות, ה- MDMs מופיעים עגולים בצורתם בעוד MDDCs יוצרים אשכולות מורכבים מתאים עם צורה מוארכת יותר ובלטים ניתנים לצפייה. לאחר שלושה ימים של צמיחה על ממברנה מוסיף, תאי האפיתל יוצרים צפוף עלייה משמעותית שחרור לקטט דהידרוגנאז נצפתה במדיום תא התרבות של התא הבסיסי עם חשיפה לשליטה חיובית על קרע קרום, להוכיח את ההיענות של המודל לחומר ציטוקקסי. אין עלייה בשחרור לקטט דהידרוגנאז כפי שנמדד על גירוי אפי עם אלפא TNF או LPS.

עליות מובהקות סטטיסטית בשחרור IL6 ו IL8 נצפים הן LPS ו TNF אלפא שטופלו דגימות לעומת שליטה בתאים מטופלים. אין הבדלים במורפולוגיה של התאים נצפו בין המודלים של תרבות-משותף באמצעות MDDMs ו- MDDCs ממונוציטים טריים של דם היקפי בהשוואה לאלה המשתמשים בתאים מופשרים בתרבות ה- LPS ו- TNF אלפא חשופה, נצפתה שכבת אפיתל משובשת. ניתן להשתמש בסוגים אחרים של תאים אנושיים כגון דרכי הנשימה או תאים bronchiolar, נקודות קצה אחרות ניתן גם לנתח.

בעיקר חוקרים קיבלו השראה מטכניקה זו באמצעות דומה להגדיר אבל עם סוגי תאים שונים.