כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

השימוש בביטוי ספציפי לרקמות של כתב פלואורסצנטי פוליגלוטמין ב C.elegans הוא משמעותי כי זה מאפשר גילוי ואפיון של רגולטורים פרוטאוסטזיס בהקשר של אורגניזם רב תאי שלם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה וכימות של הירידה הקשורה לגיל בפרוטוסטזיס התאי ב vivo, אשר חיוני כדי לקבל תובנה מכניסטית עמוקה יותר על איך אורגניזמים לשמור על קיפול ותפקוד נאותים של הפרוטאום ואת ההשפעות של ההזדקנות. מנגנוני פיגור המסוגלים לשמר פרוטאוסטזיס יקלו על פיתוח התערבויות ממוקדות לטיפול במחלות הקשורות להזדקנות שבהן פרוטאוסטזיס נפגע ולקדם הזדקנות בריאה.

קריסת פרוטאוסטזיס היא בעיה מסיבית במרפאה, שכן היא עומדת בבסיס ההתפתחות של מחלות תיעולים בחלבון, כולל אלצהיימר, פרקינסון, מחלת הנטינגטון וטרשת אמיוטרופית לרוחב. התחילו בשימוש בלוחות פטרי בקוטר 6 ס"מ להכנת חמש צלחות אגר לכל מצב בדיקה. לניסויים עם RNAi, לגרום לייצור dsRNA ב HT115 E.coli השתנה ולהשתמש אגר RNAi.

השתמש OP50 E.coli על אגר NGM סטנדרטי לניסויים ללא RNAi. לגדל את תרביות E.coli לילה ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 220 סל"ד. למחרת, גלולה החיידקים על ידי centrifugation ב 2, 400 G במשך 15 עד 20 דקות, ולאחר מכן לשאוף supernatant ולהשעות מחדש את הכדור בעשירית של נפח ההתחלה של lb.

Aliquot 200 מיקרוליטרים של חיידקים מרוכזים לכל צלחת ולאפשר לוחות פתוחים להתייבש בסביבה נקייה עד כל הנוזל נספג. כדי לסנכרן את C.Elegans עם טיפול hypochlorite, לשטוף הרמפרודיטים gravid פעמיים עם חוצץ M9, ולאחר מכן להעביר אותם צינור טרי ודגרה ב 5 מיליליטר של פתרון hypochlorite במשך חמש דקות, מנענע אותם כל דקה. לאחר הדגירה, לסובב את החיות ולשטוף אותם שלוש פעמים עם חוצץ M9.

אפשר לעוברים לבקוע בצינורות במהלך הלילה ב 3 מיליליטר של פתרון M9 עם סיבוב ב 20 מעלות צלזיוס. לחשב את הצפיפות של בעלי חיים L1 על ידי הפלת 10 microliters של פתרון L1 שלוש פעמים על צלחת 6 ס"מ וספירת מספר בעלי החיים L1. מעת לעת, מערבבים את פתרונות L1 כדי למנוע מבעלי החיים להתיישב.

זרע 50 L1 בעלי חיים אחד על כל צלחת, לספור ולתעד את המספר זרעים, ולהעביר את הצלחות לחממה 20 מעלות צלזיוס. לחלופין, כדי לסנכרן בעלי חיים באמצעות מטיל ביצים, מניחים חמישה עד עשרה בעלי חיים בוגרים צעירים וgravid על כל צלחת במשך ארבע עד שש שעות ולאפשר להם להטיל ביצים עד שיש כ 50 ביצים לכל צלחת. מוציאים את כל המבוגרים הגרביד ומעבירים את הצלחות עם הביצים לאינקובטור של 20 מעלות צלזיוס.

לגדל את החיות עד שלב L4, אשר ייקח כ 40 שעות ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטרים של פי 160 FUDR. כדי למדוד ירידה בפרוטוסטזיס ברקמת השריר, בחר 20 בעלי חיים והרכב אותם על שקופית מיקרוסקופ עם כרית אגרוז 3% וירידה של 5 מיקרוליטר של 10 מילימילימטר נתרן אזיד.

לאחר שכל התולעים משותקות, צלם את כל גופם של בעלי החיים באמצעות עדשת הגדלה של 10 X. השתמש במסנן FITC או YFP ובאותה חשיפה עבור כל בעל חיים. בסיום, מחק את השקופיות.

תספור את מספר המוקדים בשרירי דופן הגוף של החיה כולה. המוקדים הם אותות מנוקבים בהירים יותר שניתן להבדיל בין האות המסיס בעמעום ברקע. בימי הניקוד, הביטו בלוחות עם בעלי החיים ותיעדו את מספר בעלי החיים המשותקים, ואז הסירו בעלי חיים משותקים מהצלחת.

בסיום הניסוי, לחשב את קצב השיתוק עבור כל תנאי להתוות את התקדמות השיתוק. כדי למדוד ירידה בפרוטוסטזיס ברקמה העצבית, הר את התולעים בשקופית כפי שתואר בעבר וקח תמונות מחסנית Z של ראש החיות על מיקרוסקופ מורכב באמצעות עדשת הגדלה של 40 X. השלך את השקופיות לאחר ההדמיה.

לאחר רכישת התמונות, לשטח את ערימות Z ולהשתמש בהם כדי לכמת את מספר המוקדים בתאי עצב הממוקמים על אזור טבעת העצבים. התווה את ההתקדמות של הצטברות מוקדי YFP מימים 4, 6, 8 ו -10. ביום השני לבגרות, בחר 10 בעלי חיים מסונכרנים מהצלחת והנח אותם על טיפה של 10 מיקרוליטר של חוצץ M9 במגלשת מיקרוסקופ.

חזור על שלב זה לפחות ארבע פעמים כדי לקבל מדגם של 40 בעלי חיים או יותר. וידאו להקליט את התנועה של בעלי החיים לתקופה של 30 שניות על מיקרוסקופ סטריאו עם מצלמה מסוגל וידאו. לאחר כל קטעי וידאו עם בעלי החיים להיות מנותח מוקלטים, להפעיל את הווידאו ולהבקיע את כיפופי הגוף של כל חיה.

התווה את מספר כיפופי הגוף עבור כל חיה בגרף עמודות, כאשר כל נקודה מייצגת את מספר כיפופי הגוף ב-30 שניות על ציר ה-Y ואת התנאים השונים שנבדקו בציר X. מודל החזרה של פוליגלוטמין סייע בזיהוי גנים המסדירים את הרשת הפרוטאוסטלית. ביטוי polyQ-YFP ספציפי לשרירים גורם להצטברות של מוקדי פלורסנט שקל לכמת תחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי פשוט.

בעלי החיים הופכים משותקים במהלך אמצע החיים, כמו פרוטאום בתוך השריר מתמוטט בשל ההשפעה הפרוטאוטוקסית של הכתב. הירידה הקשורה לגיל בפרוטוסטזיס העצבי יכולה להיות מלווה בכימות ישיר של היווצרות מצטברת וירידות בכיפופי גוף מתואמים לאחר הצבת בעלי חיים בנוזל. שיטה זו שימשה כדי להראות כי הדומיין ההומיאו אינטראקציה חלבון קינאז, קופקטור תמלול, משפיע proteostasis במהלך ההזדקנות על ידי ויסות הביטוי של autophagy ומלווים מולקולריים.

אובדן HPK-1 מגדיל את מספר אגרגטים Q35-YFP המצטברים במהלך ההזדקנות. חיות בקרה הציגו בממוצע 18 אגרגטים, בעוד המוטציה האפסית HPK1 ו- HPK1 RNAi שטופלו בבעלי חיים הציגו בממוצע 28 ו -26 אגרגטים, בהתאמה. ביום השמיני לבגרות, 77 עד 78% מבעלי החיים הלקויים HPK1 היו משותקים, לעומת 50% בלבד מהבקרה.

בנוסף, ביטוי יתר של HPK1 הוכח כדי לווסת היווצרות צבירה של חלבון ולהגן על בעלי חיים מזדקנים מפני שיתוק הקשור Q35-YFP במהלך ההזדקנות. שיטה זו מודדת ירידה כללית של הפרוטאום בתוך סוג תא. קיימות שיטות רבות להערכת שינויים ברכיבים ספציפיים של רשת הערמונית.

יחד, הם מספקים תמונה מקיפה. ירידה בפרוטוסטזיס היא סימן היכר של הזדקנות. גישה זו מאפשרת לחוקרים לכמת ירידה זו.

בשילוב עם ניתוח גנטי, זה כלי רב עוצמה לגילוי.