Name: כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: למדו כיצד לכמת ירידה פרוטאוסטטית ברקמות שריר ועצבים ב-Caenorhabditis elegans באמצעות דיווח פלואורסצנטי של פוליגלוטמין. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגולטורים של פרוטאוסטזיס בתהליכי הזדקנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לחברי מעבדת סמואלסון בעבר ובהווה על עזרתם בחידוד שיטה זו ו/או דיון שסייעו בפיתוח כתב יד זה. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי להזדקנות המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרס RF1AG062593 ו- R21AG064519. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

ההזדקנות מאופיינת בירידה הדרגתית בפרוטוסטזיס. פרוטאוסטזיס מתוחזקת על ידי מערכת מורכבת, הרשת הפרוטאוסטקטית, לשליטה מתואמת, דינמית, מגיבה ללחץ של קיפול חלבונים, השפלה ותרגום. מדוע פרוטאוסטזיס נכשל במהלך ההזדקנות אינו מובן היטב, אך אפיגנום מתפורר, ירידה בזינוק בתגובות הלחץ, ואובדן צליבה מפצה כל בקנה אחד עם התמוטטות זו. ב C. elegans, התמלול של צורות מרובות של תגובת מתח במהירות לרדת בתוך כמה שעות לאחר תחילת הרבייה עקב היווצרות של סימני כרומטין דיכוי בלחץ loci2,34</...

הומאוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס) מוגדר כיכולת התאית לשמור על תפקוד תקין וקיפול הפרוטאום. האתגר המובנה בפרוטוסטזיס הוא להבטיח שכל החלבונים מקופלים ומתוחזקים כראוי בקונפורמציה מקומית, המוגברת עוד יותר על ידי האופי המגוון של גודל החלבון, הרכב חומצות האמינו, קונפורמציה מבנית, יציבות, מחזור, ביטוי, מידור תת-תאי ושינויים1. Proteostasis נשמר באמצעות פעולה מתואמת של רשת פרוטאוסטטיקה גדולה, המורכבת מכ -2000 חלבונים ייחודיים, המסדירים סינתזה נכונה, קיפול, סחר והשפלה בתוך הפרוטאום2,3. רכיבי סוס העבודה של הרשת הפרוטאוסטאטית הם תשע משפחות עיקריות שלמלווים מולקולריים 4. כל רקמה וסוג תא מעדיף להשתמש בתת-קבוצות ספציפיות של מלווים מולקולריים, ככל הנראה בקנה אחד עם הדרישות השונות של פרוטאומים נפרדים5.
סימן היכר אחד של הזדקנות אורגניזמית נורמלית הוא הירידה המתקדמת והתמוטטות הפרוטאוסטזיס התאי, אשר נחשב כבסיס להתפרצות והתקדמות של מספר גדל והולך של מחלות הקשורות לגיל. לדוגמה, מחלת אלצהיימר, פרקינסון, מחלת הנטינגטון וטרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) חולקות מאפיין משותף: בכל מקרה ביטוי של ניוון עצבי מונע על ידי שינויים גנטיים הנטיות חלבון מוטנטי לצבירה (עמילואיד-β/טאו, α-סינוקלין, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, בהתאמה)6,7,8,9,10 . במהלך ההזדקנות, השלמות וחוסר ההגבלות של הרשת הפרוטאוסטקטית יורדת, מה שגורם להצטברות של אגרגטים פרוטאוטוקסיים הגורמים לתפקוד לקוי של התאים ולדגנרציה עצבית. ראוי לציין, מחלות קונפורמציה חלבון אינם ייחודיים נוירונים, להתרחש על פני רקמות מרובות, כפי מודגש על ידי סוכרת מסוג II, מיאלומה נפוצה, סיסטיק פיברוזיס11,12,13,14. לכן, מנגנונים מובהרים המסוגלים לשמר פרוטאוסטזיס יקלו על פיתוח התערבויות ממוקדות לטיפול במחלות ולקדם הזדקנות בריאה.
אלגנס האדמה הקטנה Nematode Caenorhabditis (C. elegans) סייעה בגילוי גנים ובמסלולים מבהירים המשנים פרוטאוסטזיס. רכיבים רבים של הרשת הפרוטאוסטקטית ומסלולי התמרת האות המווסתים את הפרוטאוסטזיס נשמרים מבחינה אבולוציונית. יתר על כן, C. elegans הפחיתה את המורכבות והיתירות ביחס למערכות בעלי חוליות, מה שהופך אותה למקובלת יותר לניתוח גנטי ולגילוי גנים. יתרונות נוספים של C. elegans שהובילו אותו להיות בשימוש נרחב כמערכת מודל לחקר פרוטאוסטזיס כוללים: גנומיקה גנטית ותפקודית רבת עוצמה, מחזור חיים קצר (3 ימים) ותוחלת חיים (3 שבועות), גנום קומפקטי ומובהר היטב, הזמינות של מגוון רחב של מוטציות גנטיות, ואת הקלות של הדמיית שינויים ספציפיים לרקמות בביולוגיה של התא באמצעות כתבים פלואורסצנטיים.
ניתן לכמת בקלות את הריקבון המתקדם של פרוטאוסטזיס במהלך ההזדקנות ב- C. elegans. מעבדת מורימוטו הוכיחה לראשונה כי הרחבת פוליגלוטמין התמזגה לחלבון פלואורסצנטי צהוב (polyQ::YFP) יכולה לשמש לכימות ירידה פרוטאוסטקטית ב- C. elegans במהלך הזדקנות15,16,17,18. היתוך YFP ל-35 חזרות על גלוטמין או יותר גורמות להיווצרות הקשורה לגיל של מוקדי פלורסנט יחד עם סימנים לפתולוגיה תאית. ראוי לציין, טווח זה של הרחבת גלוטמין משקף את אורך מערכת הפוליגלוטמין של חלבון הנטינגטון שבו הפתולוגיה של מחלת הנטינגטון מתחילה להיות נצפתה בבני אדם (בדרך כלל >35 CAG חוזר)19. זנים עם ביטוי של polyQ::YFP בתוך תאים שריריים, מעיים או תאי עצב נוצלו כדי לאשר כי הירידה הקשורה לגיל של פרוטאוסטזיס מתרחשת על פני סוגי תאים ורקמות שונים. ביטוי YFP ספציפי לשרירים (כלומר, unc-54p::Q35::YFP) היה הכתב הספציפי לרקמות הנפוץ ביותר, שכן קל לכמת מוקדי פלורסנט מצטברים בימים הראשונים של הבגרות באמצעות מיקרוסקופ פשוט של ניתוח פלואורסצנטי (איור 1A-1B). בנוסף, בעלי חיים הופכים משותקים במהלך אמצע החיים, כמו פרוטאום בתוך השריר מתמוטט בשל ההשפעה הפרוטאוטוקסית של הכתב (איור 1C). באופן דומה, ניתן לעקוב אחר הירידה הקשורה לגיל בפרוטוסטזיס העצבי (rgef-1p::Q40::YFP) על ידי כימות ישיר של היווצרות מוקדים/צבירה וירידות הקשורות לגיל בכיפופי גוף מתואמים לאחר הצבת בעלי חיים בנוזל (איור 2).
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על איך למדוד את ההתקדמות תלוית הגיל של הצטברות צבירה חלבון ואת proteotoxicity הקשורים המושרה על ידי הביטוי של פוליגלוטמין חוזר בתוך רקמת נוירונים ושרירים C. elegans. אנו מספקים דוגמאות לתוצאות אופייניות שנוצרו באמצעות זנים ושיטות אלה. יתר על כן, אנו מראים כיצד השתמשנו בשיטות אלה כדי ללמוד רגולציה תמלול של הרשת proteostatic. אנו דנים בדרכים נוספות שבהן ניתן לשלב כתבים אלה בקלות עם ריאגנטים קיימים אחרים או להתאים אותם למסכים גדולים יותר.

<table><tbody><tr><td>24 צלחות תרבית באר</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#662102</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל צלחות 96 בארות</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>#780286</td><td></td></tr><tr><td>600 ומיקרו; L צלחות 96 בארות</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#786261</td><td></td></tr><tr><td>משכפל צלחות 96 פינים</td><td>Nunc</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>אטם צלחת חדיר אוויר</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>אגר בקטריולוגי</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>בקטו-פפטון</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans ספריית שיבוט RNAi בחיידקי HT115- Ahringer</td><td>מקור: Bioscience</td><td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td><td>ראה גם Kamath et al, Nature 2003.</td></tr><tr><td>C. elegans ספריית שיבוט RNAi בחיידקי HT115- Vidal</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans משאב ORF-RNAi (Vidal)</td><td>ראה גם Rual et al, מחקר גנום 2004. ספרייה זו זמינה גם מ-Dharmacon.</td></tr><tr><td>FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497</td><td></td></tr><tr><td>מחליפי כיסוי מיקרוסקופ זכוכית</td><td>VWR</td><td>48404-455</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ זכוכית</td><td>VWR</td><td>160004-422</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (איזופרופיל בטא-D-1-thigalactopyranoside)</td> <td>Gold Bio</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>צלחת מלבנית חד-בארית לא מטופלת, 128x86 מ"מ</td><td>תרמו-פישר</td><td></td><td></td>242811</tr><tr><td>נתרן אזיד, CAS #26628-22-8</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Zeiss Axio Imager M2m עם תוכנת AxioVision v4.8.2.0</td><td></td><td>Zeiss לא ידוע</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss StemiSV11 M2 מיקרוסקופ Bio Quad</td><td>Zeiss</td><td>לא ידוע</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans caenorhabditis

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

היכולת לשמור על תפקוד תקין וקיפול הפרוטאום (הומיאוסטזיס חלבון) יורדת במהלך ההזדקנות הרגילה, מה שמקל על תחילתן של מספר גדל והולך של מחלות הקשורות לגיל. לדוגמה, חלבונים עם הרחבות פוליגלוטמין נוטים לצבירה, כפי שמדגים את חלבון הנטטין ואת התפרצות במקביל של מחלת הנטינגטון. ההידרדרות הקשורה לגיל של הפרוטאום נחקרה בהרחבה באמצעות אלגנים מהונדסים של Caenorhabditis המבטאים חזרות polyQ הותכו לחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). מודל זה של בעלי חיים מהונדסים מסייע לכימות ישיר של הירידה הקשורה לגיל של הפרוטאום באמצעות הדמיית היווצרות מתקדמת של מוקדי פלורסנט (כלומר, אגרגטים של חלבונים) והתפרצות מאוחרת יותר של פגמים בקטר המתפתחים כתוצאה מקריסת הפרוטאום. יתר על כן, הביטוי של polyQ::YFP transgene יכול להיות מונע על ידי מקדמים ספציפיים לרקמות, המאפשר הערכה של פרוטאוסטזיס על פני רקמות בהקשר של אורגניזם רב תאי שלם. מודל זה נוח מאוד לניתוח גנטי, ובכך מספק גישה לכימות ההזדקנות המשלימה לבדיקות תוחלת חיים. אנו מתארים כיצד למדוד במדויק polyQ::YFP היווצרות מוקדים בתוך נוירונים או שריר דופן הגוף במהלך ההזדקנות, ואת תחילתו של פגמים התנהגותיים הבאים. לאחר מכן, אנו מדגישים כיצד ניתן להתאים גישות אלה לתפוקה גבוהה יותר, ויישומים עתידיים פוטנציאליים באמצעות אסטרטגיות מתפתחות אחרות לניתוח גנטי C. elegans.

ב C. elegans, מודל חוזר פוליגלוטמין כבר אינסטרומנטלי לזיהוי של גנים המסדירים את הרשת הפרוטאוסטלית. לדוגמה, הראינו בעבר כי הומיודומיין אינטראקציה חלבון קינאז (HPK-1),קופקטור תמלול, משפיע על פרוטאוסטזיס במהלך ההזדקנות על ידי ויסות הביטוי של autophagy ומלוויםמולקולריים 31. מצאנו כי אובדן של HPK-1, או על ידי השתקת RNAi או ב- HPK-1 (pk1393) בעלי חיים מוטנטיים ריקים, מגדיל את מספר צבירי Q35::YFP המצטברים במהלך ההזדקנות. חיות שליטה בוגרות ביום 2 מציגות 18.0 ± ...

ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

השימוש בביטוי ספציפי לרקמות של כתב פלואורסצנטי פוליגלוטמין ב C.elegans הוא משמעותי כי זה מאפשר גילוי ואפיון של רגולטורים פרוטאוסטזיס בהקשר של אורגניזם רב תאי שלם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הדמיה וכימות של הירידה הקשורה לגיל בפרוטוסטזיס התאי ב vivo, אשר חיוני כדי לקבל תובנה מכניסטית עמוקה יותר על איך אורגניזמים לשמור על קיפול ותפקוד נאותים של הפרוטאום ואת ההשפעות של ההזדקנות. מנגנוני פיגור המסוגלים לשמר פרוטאוסטזיס יקלו על פיתוח התערבויות ממוקדות לטיפול במחלות הקשורות להזדקנות שבהן פרוטאוסטזיס נפגע ולקדם הזדקנות בריאה.קריסת פרוטאוסטזיס היא בעיה מסיבית במרפאה, שכן היא עומדת בבסיס ההתפתחות של מחלות תיעולים בחלבון, כולל אלצהיימר, פרקינסון, מחלת הנטינגטון וטרשת אמיוטרופית לרוחב. התחילו בשימוש בלוחות פטרי בקוטר 6 ס"מ להכנת חמש צלחות אגר לכל מצב בדיקה. לניסויים עם RNAi, לגרום לייצור dsRNA ב HT115 E.coli השתנה ולהשתמש אגר RNAi.השתמש OP50 E.coli על אגר NGM סטנדרטי לניסויים ללא RNAi. לגדל את תרביות E.coli לילה ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 220 סל"ד. למחרת, גלולה החיידקים על ידי centrifugation ב 2, 400 G במשך 15 עד 20 דקות, ולאחר מכן לשאוף supernatant ולהשעות מחדש את הכדור בעשירית של נפח ההתחלה של lb.Aliquot 200 מיקרוליטרים של חיידקים מרוכזים לכל צלחת ולאפשר לוחות פתוחים להתייבש בסביבה נקייה עד כל הנוזל נספג. כדי לסנכרן את C.Elegans עם טיפול hypochlorite, לשטוף הרמפרודיטים gravid פעמיים עם חוצץ M9, ולאחר מכן להעביר אותם צינור טרי ודגרה ב 5 מיליליטר של פתרון hypochlorite במשך חמש דקות, מנענע אותם כל דקה. לאחר הדגירה, לסובב את החיות ולשטוף אותם שלוש פעמים עם חוצץ M9.אפשר לעוברים לבקוע בצינורות במהלך הלילה ב 3 מיליליטר של פתרון M9 עם סיבוב ב 20 מעלות צלזיוס. לחשב את הצפיפות של בעלי חיים L1 על ידי הפלת 10 microliters של פתרון L1 שלוש פעמים על צלחת 6 ס"מ וספירת מספר בעלי החיים L1. מעת לעת, מערבבים את פתרונות L1 כדי למנוע מבעלי החיים להתיישב.זרע 50 L1 בעלי חיים אחד על כל צלחת, לספור ולתעד את המספר זרעים, ולהעביר את הצלחות לחממה 20 מעלות צלזיוס. לחלופין, כדי לסנכרן בעלי חיים באמצעות מטיל ביצים, מניחים חמישה עד עשרה בעלי חיים בוגרים צעירים וgravid על כל צלחת במשך ארבע עד שש שעות ולאפשר להם להטיל ביצים עד שיש כ 50 ביצים לכל צלחת. מוציאים את כל המבוגרים הגרביד ומעבירים את הצלחות עם הביצים לאינקובטור של 20 מעלות צלזיוס.לגדל את החיות עד שלב L4, אשר ייקח כ 40 שעות ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטרים של פי 160 FUDR. כדי למדוד ירידה בפרוטוסטזיס ברקמת השריר, בחר 20 בעלי חיים והרכב אותם על שקופית מיקרוסקופ עם כרית אגרוז 3% וירידה של 5 מיקרוליטר של 10 מילימילימטר נתרן אזיד.לאחר שכל התולעים משותקות, צלם את כל גופם של בעלי החיים באמצעות עדשת הגדלה של 10 X. השתמש במסנן FITC או YFP ובאותה חשיפה עבור כל בעל חיים. בסיום, מחק את השקופיות.תספור את מספר המוקדים בשרירי דופן הגוף של החיה כולה. המוקדים הם אותות מנוקבים בהירים יותר שניתן להבדיל בין האות המסיס בעמעום ברקע. בימי הניקוד, הביטו בלוחות עם בעלי החיים ותיעדו את מספר בעלי החיים המשותקים, ואז הסירו בעלי חיים משותקים מהצלחת.בסיום הניסוי, לחשב את קצב השיתוק עבור כל תנאי להתוות את התקדמות השיתוק. כדי למדוד ירידה בפרוטוסטזיס ברקמה העצבית, הר את התולעים בשקופית כפי שתואר בעבר וקח תמונות מחסנית Z של ראש החיות על מיקרוסקופ מורכב באמצעות עדשת הגדלה של 40 X. השלך את השקופיות לאחר ההדמיה.לאחר רכישת התמונות, לשטח את ערימות Z ולהשתמש בהם כדי לכמת את מספר המוקדים בתאי עצב הממוקמים על אזור טבעת העצבים. התווה את ההתקדמות של הצטברות מוקדי YFP מימים 4, 6, 8 ו -10. ביום השני לבגרות, בחר 10 בעלי חיים מסונכרנים מהצלחת והנח אותם על טיפה של 10 מיקרוליטר של חוצץ M9 במגלשת מיקרוסקופ.חזור על שלב זה לפחות ארבע פעמים כדי לקבל מדגם של 40 בעלי חיים או יותר. וידאו להקליט את התנועה של בעלי החיים לתקופה של 30 שניות על מיקרוסקופ סטריאו עם מצלמה מסוגל וידאו. לאחר כל קטעי וידאו עם בעלי החיים להיות מנותח מוקלטים, להפעיל את הווידאו ולהבקיע את כיפופי הגוף של כל חיה.התווה את מספר כיפופי הגוף עבור כל חיה בגרף עמודות, כאשר כל נקודה מייצגת את מספר כיפופי הגוף ב-30 שניות על ציר ה-Y ואת התנאים השונים שנבדקו בציר X. מודל החזרה של פוליגלוטמין סייע בזיהוי גנים המסדירים את הרשת הפרוטאוסטלית. ביטוי polyQ-YFP ספציפי לשרירים גורם להצטברות של מוקדי פלורסנט שקל לכמת תחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי פשוט.בעלי החיים הופכים משותקים במהלך אמצע החיים, כמו פרוטאום בתוך השריר מתמוטט בשל ההשפעה הפרוטאוטוקסית של הכתב. הירידה הקשורה לגיל בפרוטוסטזיס העצבי יכולה להיות מלווה בכימות ישיר של היווצרות מצטברת וירידות בכיפופי גוף מתואמים לאחר הצבת בעלי חיים בנוזל. שיטה זו שימשה כדי להראות כי הדומיין ההומיאו אינטראקציה חלבון קינאז, קופקטור תמלול, משפיע proteostasis במהלך ההזדקנות על ידי ויסות הביטוי של autophagy ומלווים מולקולריים.אובדן HPK-1 מגדיל את מספר אגרגטים Q35-YFP המצטברים במהלך ההזדקנות. חיות בקרה הציגו בממוצע 18 אגרגטים, בעוד המוטציה האפסית HPK1 ו- HPK1 RNAi שטופלו בבעלי חיים הציגו בממוצע 28 ו -26 אגרגטים, בהתאמה. ביום השמיני לבגרות, 77 עד 78% מבעלי החיים הלקויים HPK1 היו משותקים, לעומת 50% בלבד מהבקרה.בנוסף, ביטוי יתר של HPK1 הוכח כדי לווסת היווצרות צבירה של חלבון ולהגן על בעלי חיים מזדקנים מפני שיתוק הקשור Q35-YFP במהלך ההזדקנות. שיטה זו מודדת ירידה כללית של הפרוטאום בתוך סוג תא. קיימות שיטות רבות להערכת שינויים ברכיבים ספציפיים של רשת הערמונית.יחד, הם מספקים תמונה מקיפה. ירידה בפרוטוסטזיס היא סימן היכר של הזדקנות. גישה זו מאפשרת לחוקרים לכמת ירידה זו.בשילוב עם ניתוח גנטי, זה כלי רב עוצמה לגילוי.

quantifying-tissue-specific-proteostatic-decline-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת אורך החיים של נמטודות שמרו על התקשורת עם מזון מוצק-UV הרג חיידקים.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת הדמיה in vivo כדי לקבוע ירידה בפרוטאוסטזיס עקב הזדקנות. הבדיקה משתמשת ב- Caenorhabditis elegans המבטא חלבון היתוך YFP פוליגלוטמין בשרירי דופן הגוף כדי למדוד את הצבירה הקשורה לגיל של פוליגלוטמין והשראת פרוטאוטוטוקסיות, מה שמוביל לשיתוק.

בדיקת שיתוק מבוססת כתב פלואורסצנטי: טכניקה להערכת היווצרות פרוגרסיבית הקשורה לגיל של כתב פלואורסצנטי פוליגלוטמין ושיתוק נלווה ב- Caenorhabditis elegans

כדי לחקור את הקשר בין הומאוסטזיס חלבון, מתח והזדקנות, עקבנו אחר שינויים בקיפול החלבון על ידי מעקב אחר תפקוד לקוי של חלבון, לוקליזציה של חלבון בתא ויציבות החלבון ברמת האורגניזם, התא והחלבון, תוך שימוש במטזואן Caenorhabditis elegans הניתן לטיפול גנטי כמערכת מודל.

שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

מטרת השיטה המובאת כאן היא לבחון חלבון צבירת במהלך הזדקנות נורמלית בתוך האורגניזם דגם C. elegans. הפרוטוקול מייצג כלי רב עוצמה כדי ללמוד מצרפי גדול מאוד מסיסים היוצרים עם הגיל וכדי לקבוע כיצד משפיעים השינויים פרוטוסטאזיס חלבון צבירת.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

כאן נתאר שיטת עותקים משוכפלים, גישה באופן כמותי מודדים C. elegans תוחלת החיים/הישרדות, healthspan באופן תפוקה גבוהה וחזק, ובכך לאפשר הקרנה של מצבים רבים מבלי להתפשר על איכות הנתונים. פרוטוקול זה מפרט את האסטרטגיה, ומספק כלי תוכנה לניתוח של נתונים המשוכפלים.

השיטה קבע עותק משוכפל: בגישה תפוקה גבוהה באופן כמותי מידה Caenorhabditis elegans תוחלת החיים

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של RNA DNA, חלבונים מדגם זהה, פרוטוקול, במאמץ להפחית את הווריאציה לשפר הפארמצבטית, להקל על פרשנויות.

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מאפיינים את התגובות הסלולר מדגיש התגובה התאית ב-נמטודות C. אלגיה על ידי מדידת ההפעלה של כתבים פלורסנט ההמרה ולומר רגישות ללחץ פיזיולוגי.

מדידות התגובות הפיזיולוגיות של הלחץ בג. אלגיה

כאן, אנו מציגים ומתארים שיטה לא רדיואקטיבית ולא פולשנית כדי להעריך סינתזת חלבון דה נובו ב vivo, ניצול elegans caenorhabditis נמטודה והתאוששות פלואורסצנציה לאחר photobleaching (FRAP). שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מסכים גנטיים ו/או תרופתיים כדי לזהות אפנונים חדשניים של סינתזת חלבונים.

הערכה של דה נובו חלבון סינתזה שיעורי Caenorhabditis elegans

כאן, שיטה מוצגת לניתוח של קינטיקה הצטברות חלבון נמטודה Caenorhabditis elegans. בעלי חיים מאוכלוסייה מסונכרנת גיל הם בתמונה בנקודות זמן שונות, ואחריו ספירת הכללה חצי אוטומטית CellProfiler והתאמה למודל מתמטי באמילופיט.

ניטור הצטברות חלבונים קינטיקה ב Vivo באמצעות ספירת הכללה אוטומטית ב Elegans Caenorhabditis

Caenorhabditis elegans משמשים כמערכת מודל מצוינת עם שיטות חזקות ובעלות נמוכה לסקר את תוחלת החיים, תוחלת החיים והחוסן ללחץ.

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

למדו כיצד לכמת ירידה פרוטאוסטטית ברקמות שריר ועצבים ב-Caenorhabditis elegans באמצעות דיווח פלואורסצנטי של פוליגלוטמין. שיטה זו מאפשרת זיהוי רגולטורים של פרוטאוסטזיס בתהליכי הזדקנות.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

גלה סרטונים נוספים