הפרדת מולקולות ביו-אקטיביות קטנות, פפטידים ממקורות טבעיים וחלבונים מחיידקים על ידי שיטת התמקדות איזואלקטריים

הפרוטוקול שלנו מתאר את הממצאים החדשים על ההפרדה והטיהור של מולקולות פעילות מתמצית צמחים. מדענים יכולים להשתמש בשיטות אלה כדי לבודד מולקולות קטנות ופפטידים ממקורות מוצר טבעיים עבור משתמשים טיפוליים. היכרות עם רכיבי המכשיר ושיטות ההרכבה שלהם.

חשוב להיות בטוח, כי המדגם להיות מופרד מוכן על ידי ההנחיות המוצעות. שיטה זו כוללת תהליכי הרכבה מרובים של המכשיר. וההדגמה החזותית תסייע למשתמשים לעקוב אחריהם ולהחיל אותם בהצלחה על המחקר.

לאחר הרכבת השלב הנוזלי, יחידת IEF כמתואר במדריך ההוראות, לצייד את קרום חילופי אניון עם 0.1 נתרן הידרוקסיד טוחן ואת קרום חילופי הקטיון עם 0.1 חומצה זרחנית טוחנת. יישר את אטמים גומי כך שלושת החורים מלבני גדול להישאר נעול על ידי הגומי. זה יעזור להחליף את היונים בין האלקטרודה לתאי הדגימה דרך הממברנה במהלך אלקטרופורזה.

להרכיב את החלק הפנימי החיצוני של האלקטרודה על ידי יישור שלושת החורים מלבני אטמים חילופי יון. ואז למלא את האלקטרודות עם האלקטרוליטים שלהם בהתאמה כדי למנוע את הממברנות שלהם להתייבש. לאחר מכן, הדקו את מחזיק בורג הפלסטיק כדי להבטיח הרכבה נטולת דליפה.

כסו את לוחות איסוף הדגימה בקלטת איטום. לאחר מכן להרכיב את החלקים של תא ההתמקדות מעל אצבע קירור קרמיקה ברצף הבא: אלקטרודה אנודה, ליבת קרום ניילון, תא התמקדות ואלקטרודה קתודה. בעזרת מזרק 50 מיליליטר, מלאו את תא ההתמקדות במים מזוקקים מקורר מראש.

לתא IEF סטנדרטי, יש להוסיף 60 מיליליטר מים. חבר את יחידת ה- IEF למחזור מי קירור בארבע מעלות צלזיוס. הפעילו את היחידה ב-15 וואט ו-3000 וולט עד שהמתח יתייצב, כשלוש עד חמש דקות.

לאחר מכן, כבה את מקור החשמל. באמצעות אספן השבר, להסיר את המים מהתא. לאטום מחדש את לוחות האיסוף עם סרט איטום.

הוסף 0.6 גרם של תמצית צמח ג'ימא סילבסטרה, ל 60 מיליליטר של מים מזוקקים. ממיסים את תמצית הצמח על ידי ערבוב בצינור רולר במשך חמש דקות. כדי להסיר את החלקיקים המסיסים, צנטריפוגה פתרון זה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות.

מעבירים את העל-טבעי ל-150 מיליליטר זכוכית ומוסיפים אמפיוליט ליצירת פתרון של 1% לפי נפח, כ-0.6 מיליליטר. באמצעות מזרק 50 מיליליטר עם 1.5 אינץ ' 19 מד מחט קצה קהה, לטעון פתרון זה לתוך תא IEF דרך לוחות איסוף מדגם. לאחר מכן הסר את התא מהדוכן והקש על תא האלקטרודה, כדי לסלק ולהסיר בועות.

חבר את היחידה למים המתקררים. עם אספקת החשמל קבוע 15 וואט להתחיל שבר. הפעל את יחידת IEF עד שהמתח יגיע לערך קבוע, כשלוש שעות.

לאחר לחיצה על הקציר על כפתור ליישר את סיכות אספן שבר עם לוחות האיסוף. לדחוף את הסיכות דרך סרט האיטום כדי להתחיל לאסוף את שברי ג'ימא סילבסטרה. לגדל מושבה אחת של C.albicans ושמרים פפיטון דקסטרוז מרק לילה ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד.

מעבירים את התרבות לצינור צנטריפוגה ולאסוף את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר הסרת supernatant, להשעות את תאי השמרים במאגר ולסובב את ההשעיה בצינור רולר במשך שעה אחת בחמש מעלות צלזיוס. כדי להסיר את תאי השמרים, צנטריפוגה ההשעיה ב 10, 000 פעמים G במשך חמש דקות.

לאחר מכן סנן את תמצית החלבון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.45. מעבירים את תמצית החלבון לצנרת דיאליזה ומדיאליזה נגד מים למשך 15 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הערכת ריכוז החלבון, לאסוף נפח של תמצית חלבון המכיל 500 מיליגרם של חלבון הכולל.

מדללים את 500 מיליגרם החלבון ב-60 מיליליטר מים המכילים 1%ampholyte לפי נפח. באמצעות מזרק, לטעון את תמצית החלבון מדולל לתוך תא IEF ולהפעיל את היחידה קבוע 15 וואט במשך ארבע שעות. מכיוון שמכשיר זה משתמש באספקה חשמלית במתח גבוה, על המשתמש לנקוט בכל אמצעי הזהירות כדי להימנע ממגע ישיר עם האלקטרודות החיות.

אספן השבר מכיל 20 צינורות פלסטיק, כל אחד 12 מילימטרים על ידי 75 מילימטרים. והוא מחובר למשאבת הוואקום. היכונו לאסוף את השברים על ידי לחיצה על הקציר על כפתור.

לאחר מכן ליישר את 20 סיכות אוסף על אספן שבר עם לוח אוסף 20 כך תא מיקוד אטום. לדחוף את סיכות האיסוף דרך סרט האיטום ובו זמנית להפעיל את משאבת ואקום. כל צינור יאסוף שבר חלבון של כשלושה מיליליטר.

לאחר צמצום והרתיחה של שברי החלבון, נתח אותם על ג'ל דף SDS 12.5%. מכתימים את הג'ל בצבע כחול קומאסי וממקמים אותו על נדנדה בטמפרטורת החדר. לאחר שעתיים עד שלוש שעות יש לבטל את הג'ל.

לאחר מכן הקליטו את תמונת הג'ל בעזרת תמונה של ג'ל. הכן השעיה של תאי שמרים על ידי דילול תרבות לילה של C.albicans ביחס של 1:1000 בתרבות התאים של RPMI בינוני בתוספת 50 מילימולר גלוקוז. הוסף 90 microliters של ההשעיה התא לכל באר של צלחת 96 היטב.

לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של כל שבר G.sylvestre להפריד בארות. כבקרה שלילית, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מים עם 1%ampholyte לתוך בארות נפרדות. לאחר הדגירה של צלחת 96 באר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות, לצפות בצלחת תחת מיקרוסקופ.

חוסר צמיחה filamentous מציין את העיכוב של C.albicans שמרים להיפ המרה. עשרים שברים של תמצית G.sylvestre הושגו על ידי IEF שלב נוזלי. מולקולות בצבע כהה, החומצות הג'ימנסמיות, היגרו והועשרו בקצה האנודה של היחידה.

שברים צהובים בהירים שקופים נצפו בקצה הקתודה. אליקוטים מכל שבירת G.sylvestre הופחתו, מבושלים ונפתרו על ידי דף SDS. כתם כחול קומאסי הראה רצועת פוליפפטיד שונה בערך חמישה קילודלטון, מועשר בשברים 16 עד 19.

החומצות הגימנסיות בשבריר 1, והשברים הבאים לא זוהו מכיוון שהם אינם חלבונים. עם זאת, מולקולות אלה ניתן להפריד על ידי TLC ו שזוהה תחת אור UV. שבר 10 לא הכיל כמות ניכרת של מולקולות קטנות אלה המצביעות על כך שרוב המולקולות הקטנות האורגניות הועשרו בשברים 1 עד 3.

כל 20 שברי G.sylvestre הועידו על עיכוב של המרת שמרים ליפ וצמיחה מקף ב C.albicans. העיכוב הגדול ביותר נצפתה בשבריר אחד ומעט עד ללא עיכוב נצפתה בשברים 10 ומעלה. חלבונים משטח התא מ C.albicans היו מופרדים באמצעות שלב נוזלי IEF.

ואליקוטים מ-18 שברים נותחו על ידי דף SDS. חלבונים מועשרים נראו בכמה שברים. ההתחלה, מולקולות קטנות לא ניתן היה להפריד על ידי התמקדות isoelectric כי הם האמינו להיות לא אמבולטורי.

המחקרים שלנו מראים שהם אמבולטוריים, לפחות שבועיים, ושיטת זו ניתן לחקור עוד יותר עבור מולקולות קטנות אחרות.