Name: שחזור חתימות פלואורסצנטיות מולדות חד-תאיות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: למדו שחזור חתימות פלואורסצנטיות מולדות בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית רב-ערוצית. שיטה זו מאפשרת ניתוח תאים בודדים ללא תיוג פולשני במיקרואורגניזמים ובתאים איקריוטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק סיוע למחקר מדעי ממשרד החינוך, התרבות, הספורט והטכנולוגיה של יפן (18K04843) ל- Y. Yawata, ה- JST ERATO (JPMJER1502) ל- N. Nomura.

1. הכנת המדגם
<ol><li>מניחים אטם סיליקון בעובי 1 מ"מ עם בארות על מגלשת זכוכית.</li>
	<li>מניחים לוח אגרוז בעובי 1 מ"מ (w/v) בבאר אטם הסיליקון.</li>
	<li>לדלל את צפיפות התא של תרבית תאים מיקרוביאליים שרירותית לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD660) = 1.0.</li>
	<li>מניחים 5 μL aliquot של השעיית תא על לוח אגרוז.</li>
	<li>מכסים בעדינות עם כיסוי זכוכית.</li>
</ol>2. התקנה של מיקרוסקופ
הערה: טכניקת CRIF משלבת מיקרוסקופיה של השתקפות קונפוקלית (CRM) ומיקרוספקטרוסקופיה קונפוקלית רב-ערוצית. CRM משמש כמקור המידע למורפולוגיה תאית ולוקליזציה מרחבית, שאינה תלויה בפלואורסצנטיות מולדת תאית. מיקרוספקטרוסקופיה קונפוקלית רב-ערוצית מספקת את המידע הספקטרלי של פלואורסצנטיות תאית מולדת. בפרוטוקול הבא, כל תמונה שנרכשה עם CRM או מיקרוספקטרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית מכונה תמונת CRM או תמונה מיקרוספקטרוסקופית קונפוקלית רב ערוצית, בהתאמה.
<ol><li>חבר מיקרוסקופ קונפוקלי עם ערוצים ספקטרליים מסולקים לצינור פוטומולטיפלייר (PMT) או גלאי GaAsP. הערה: הגדרות אלה זמינות ממספר יצרנים.</li>
	<li>צייד את המיקרוסקופ במטרה צמצם מספרי גבוה (NA) בהגדלה נאותה. הערה: יעד 63x עם NA &gt; 1.4 מומלץ לניתוח תאים חיידקיים.</li>
	<li>צייד את המיקרוסקופ במראה חצי השתקפות (למשל, NT 80/20) כדי להתאים ל- CRM, הנשען על הפיזור התאי של אור האירוע כדי לדמיין את המורפולוגיה של התאים.</li>
	<li>למיקרוספקטרוסקופיה קונפוקלית רב-ערוצית, ציידו את המיקרוסקופ במראות דיכרואיות. לדוגמה, השתמש ב- MBS InVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543 או מפצלי קרן MBS 488/543/633 עבור 405, 458, 488, 514, 543 או 633 ננומטר עירור, בהתאמה.</li>
	<li>התאם את עוצמת התאורה עבור כל אורך גל עירור באמצעות מד כוח לייזר. שמור על הפלט מתחת לקוביות המיקרוסקופ דרך אורכי גל עירור (למשל, השתמש ב- 50 μW עם המטרה 63x).</li>
</ol>3. רכישת תמונות
<ol><li>הגדר את גודל חור הסיכה ל- 1 AU באמצעות תוכנת המיקרוסקופ.</li>
	<li>הגדר את זמן השתהות הפיקסלים (כלומר, מהירות הסריקה) עבור כל אורך גל של עירור. הערה: זמן השתהות של פיקסלים ארוך מדי עלול לגרום נזק לתאים. הימנעו מזמן השתהות פיקסלים ארוך מדי כדי למזער פוטודאם לתאים. עבור דגימות חיידקים, זמן התעכבות פיקסל &lt;55.6 μm2 (כאשר פלט ההקרנה מתחת למיקרוסקופ הוא ~ 17 μW / cm2) מתאים בדרך כלל כדי למנוע עיכוב צמיחה. פרמטר זה עשוי להשתנות בהתאם לאורגניזמים ולהגדרות ניסיוניות.</li>
	<li>הגדר את רזולוציית הסריקה. עבור תאים קטנים כגון חיידקים, השתמש באזור סריקה של 1,024 x 1,024.</li>
	<li>הגדר את טווח סריקת Z כך שאזור העניין יכוסה. הערה: עבור דגימות תאי חיידקים ושמרים המופצות על לוח אגרוז, טווח סריקת Z של ~ 15 מיקרומטר הוא בדרך כלל מספיק.</li>
	<li>הגדר את הגלאי descanned כדי ללכוד את טווח אורך הגל הנראה (למשל, 416−691 ננומטר). השתמש בחלון ספקטרלי של 8−10 ננומטר.</li>
	<li>לרכוש תמונות מיקרוספקטרוסקופיה קונפוקלית רב ערוצית ברצף מאורכי גל עירור הארוכים ביותר עד הקצרים ביותר כדי ליצור ערימות Z של תמונות פלואורסצנטיות.</li>
	<li>השג תמונות CRM.</li>
	<li>שמור את התמונות שנרכשו כקבצי tiff של 16 סיביות בספריה. תן שם לקבצים באמצעות מוסכמות מתן השמות XXXcYYZZZ.tif, כאשר XXX הוא אורך הגל של העירור, YY הוא מספר ערוץ הגלאי, ZZ הוא מספר פרוסת Z, ו- "c" ו- "z" הן קידומת עבור מספר הגלאי ומספר פרוסת Z, בהתאמה.<ol>
<li>לדוגמה, אם תמונה מיקרוספקטרוסקופית קונפוצלית רב-ערוצית צולמה עם אורך גל של 405 ננומטר, ערוץ גלאי ראשון של מערך הגלאים, והיא הפרוסה החמישית של מחסנית Z, קרא לה "405c01z05.tif". עבור תמונות CRM, השתמש במחרוזת "CRM" במקום XXX (לדוגמה, "CRMc01z05.tif"). הערה: החלט אם פילוח 2D או תלת-ממדי מתאים ביותר לנתוני התמונה. השתמש בשיטת פילוח דו-ממדית במצבים שבהם תאים קטנים מוגבלים למישור דו-ממדי (למשל, אוכלוסייה חיידקית הנצמדת למשטח זכוכית). השתמש בשיטת הפילוח התלת-ממדית במצבים שבהם אוכלוסיית התאים מופצת במרחב תלת מימדי (למשל, ביופילמים ודגימות רקמות) או שגודל התא גדול מעובי הפרוסה האופטית (למשל, תאי שמרים, תאי יונקים). עבור פילוח 2D עיין בסעיף 4; עבור פילוח תלת-ממדי, עיין בסעיף 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניתוח תמונה 2D
<ol><li>צייד תחנת עבודה בתוכנת ניתוח תמונה (למשל, MATLAB).</li>
	<li>בצע פילוח תאים ושחזור של חתימות פלואורסצנטיות מולדות חד-תאיות.<ol>
<li>פתח את תוכנת ניתוח התמונות.</li>
		<li>לחץ פעמיים ופתח את אחד מהקבצים שסופקו "Script2D.m".</li>
		<li>עבור לכרטיסיה עורך ולאחר מכן לחץ על הפעל. אמור להופיע חלון בחירת תיקיה.</li>
		<li>בחר את הספריה שנוצרה בשלב 3.8 ולאחר מכן לחץ על פתח כדי להמשיך. תיבת דו-שיח המבקשת את הקלט של פרמטר הפילוח תופיע באופן אוטומטי. הערה: למטרות בדיקה בחר את ערכת הנתונים שסופקה ("Sample_2D"). ערכת הנתונים לדוגמה מסופקת כקובץ דחוס ויש לחלץ אותה מראש.</li>
		<li>הזן את פרמטרי הפילוח: סף הבינאריזציה של התמונה (0−1) עבור בינאריזציה של תמונה = 0.45, סף עליון עבור אזור תא (בפיקסלים) = 200, סף תחתון עבור אזור תא (בפיקסלים) = 10 ומספר הגלאים = 32. לחץ על אישור כדי להמשיך. הערה: פרמטרים אלה עשויים לדרוש התאמה בהתאם לאיכות התמונה.</li>
		<li>חלון תמונה חדש המציג תמונת CRM אמור להופיע. בחר אזור רקע שרירותי (כלומר, אזור שבו תאים נעדרים) לשימוש עבור חיסור רקע. צייר מלבן בתוך תמונת CRM על-ידי גרירת עכבר. לחץ פעמיים בתוך האזור הנבחר כדי לאשר את הבחירה.</li>
		<li>חפש ספריה חדשה בשם חתימה באותה ספריה שנבחרה בשלב 4.2.4. הערה: הקוד שסופק יוצר ספריה זו באופן אוטומטי. הספריה "חתימה" מאחסנת את חתימת הפלואורסצנטיות המולדת של כל תא מיקרוביאלי באוכלוסייה .png קבצים ממוספרים באופן סדרתי לאחר קידומת נפוצה "חתימה".</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.3D ניתוח תמונה
<ol><li>צייד תחנת עבודה בתוכנת ניתוח התמונה (טבלת חומרים).</li>
	<li>בצע פילוח תאים ושחזור של חתימות פלואורסצנטיות מולדות חד-תאיות.<ol>
<li>פתח את תוכנת ניתוח התמונות.</li>
		<li>לחץ פעמיים ופתח את קובץ ה- Script שסופק "Script3D.m".</li>
		<li>עבור לכרטיסיה עורך ולאחר מכן לחץ על הפעל. אמור להופיע חלון בחירת תיקיה.</li>
		<li>בחר את הספריה שנוצרה בשלב 3.8 ולאחר מכן לחץ על פתח כדי להמשיך. תיבת דו-שיח המבקשת את הקלט של פרמטרי הפילוח תופיע באופן אוטומטי. הערה: למטרות בדיקה בחר את ערכת הנתונים שסופקה ("Sample_3D"). ערכת הנתונים לדוגמה מסופקת כקובץ דחוס ויש לחלץ אותה מראש.</li>
		<li>הזן את פרמטרי הפילוח: סף הבינאריזציה של התמונה (0-1) עבור בינריזציה של תמונה = 0.01, סף עליון עבור אמצעי אחסון של תאים (בפיקסלים) = 1,000, סף תחתון עבור אזור תא (בפיקסלים) = 20, גודל פיקסל X [μm/pixel] = 0.26, גודל פיקסל Y [μm/פיקסל] = 0.26, פיקסל Z Size [μm/pixel] = 0.42 ומספר הגלאים = 32. לחץ על אישור כדי להמשיך; תופיע תיבת דו-שיח המבקשת את הקלט עבור מספר אורכי הגל של העירור. הערה: פרמטרים אלה עשויים לדרוש התאמה בהתאם לאיכות התמונה.</li>
		<li>הזן את מספר אורכי הגל המשמשים לרכישת תמונה (לדוגמה, אם נעשה שימוש ב- 405, 488, 561, 630, הזן 4 בתיבת הדו-שיח). לחץ על אישור.</li>
		<li>הזן את אורכי הגל של העירור ברצף מהקצר ביותר (כלומר, שם תיבה: עירור מס ' 1) אל אורך הגל הארוך ביותר לתוך תיבות הדיאלוג. לחץ על אישור כדי להמשיך; חלון תמונה חדש המציג תמונת CRM אמור לצוץ.</li>
		<li>בחר את אזור הרקע השרירותי (כלומר, האזור שבו תאים נעדרים) שישמש לתחינת רקע. צייר מלבן בתוך תמונת CRM על-ידי גרירת עכבר. לחץ פעמיים בתוך האזור הנבחר כדי לאשר את הבחירה.</li>
		<li>חפש את הספריה בשם חתימה בספריה שנבחרה בשלב 5.2.4. הערה: הקוד שסופק יוצר ספריה זו באופן אוטומטי. הספריה "חתימה" מאחסנת את חתימת הפלואורסצנטיות המולדת של כל תא מיקרוביאלי בודד באוכלוסייה .png קבצים ממוספרים באופן סדרתי לאחר קידומת נפוצה "חתימה".</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ניתוח סטטיסטי
הערה: בצע טכניקות הפחתה ממדיות (למשל, ניתוח רכיבים עיקרי [PCA]) כדי לדמיין את ההתפלגות של היפרספקטרומים של אוכלוסיות התאים. קובץ ה- Script שסופק (PCA.py) מבצע PCA עבור שתי אוכלוסיות תאים (כלומר, שתי מחלקות).
<ol><li>צייד תחנת עבודה בשפת התכנות ובספריות ובמודולים הנלווים (טבלת חומרים).</li>
	<li>צור ספריה ריקה בכונן C (או שווה ערך) ותן שם לספריה "Parent_directory" (כלומר, C:/ Parent_ הספריה).</li>
	<li>אחסן את חתימות הפלואורסצנטיות (למשל, קבצי .png שנוצרו בשלב 4.2.7) של כל אחת משתי אוכלוסיות התאים לשתי ספריות נפרדות. הערה: שתי הספריות צריכות להיות ממוקמות ב"Parent_directory". ג:/Parent_directory/ <img alt="image 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">putidaKT2440/ <img alt="image 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">חתימה01.png <img alt="image 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">חתימה02.png <img alt="image 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img2.jpg"> <img alt="image 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">: <img alt="image 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img1.jpg">putidaKT2442/ 
	 <img alt="image 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">חתימה01.png 
	 <img alt="image 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">חתימה02.png 
	 <img alt="image 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61120/61120img3.jpg">:</li>
	<li>הורד PCA.py לתוך "Parent_directory".</li>
	<li>פתח את ממשק שורת הפקודה של תחנת העבודה.</li>
	<li>הקלד "python C:/Parent_directory/PCA.py" בממשק שורת הפקודה.</li>
	<li>בחר את "Parent_directory" לאחר הצגת ההודעה 'בחר ספריית יעד'.</li>
	<li>ב"C:/Parent_directory", מצא "PCA.png", המכיל עלילת PCA וכתוצאה מכך.</li>
</ol>

<ol><li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microbial metabolomics.</a> Current Genomics. 12, 391-403 (2011).</li>
<li>Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Then+and+now%3A+use+of+16S+rDNA+gene+sequencing+for+bacterial+identification+and+discovery+of+novel+bacteria+in+clinical+microbiology+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories.</a> Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).</li>
<li>Amman, R., Fuchs, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+identification+in+microbial+communities+by+improved+fluorescence+in+situ+hybridization+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques.</a> Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).</li>
<li>Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacterial+species+by+fluorescence+spectroscopy+and+classification+through+principal+components+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis.</a> Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).</li>
<li>Leblanc, L., Dufour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+identity+of+bacteria+using+their+intrinsic+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence.</a> FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).</li>
<li>Hou, X., Liu, S., Feng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autofluorescence+characteristics+of+bacterial+intracellular+and+extracellular+substances+during+the+operation+of+anammox+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor.</a> Scientific Reports. 7, 39289(2017).</li>
<li>Ramanujam, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+diagnosis+of+cervical+intraepithelial+neoplasia+using+337-nm-excited+laser-induced+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence.</a> Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).</li>
<li>Zhang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+cellular+fluorescence+reflects+alterations+in+cellular+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).</li>
<li>Gosnell, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+non-invasive+cell+characterisation+and+discrimination+based+on+multispectral+autofluorescence+features%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features.</a> Scientific Reports. 6, 23453(2016).</li>
<li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interspecies+variability+of+single-cell+innate+fluorescence+signature+of+microbial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).</li>
<li>Nelson, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+and+comparative+analysis+of+the+metabolically+versatile+Pseudomonas+putida+KT2440%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440.</a> Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).</li>
<li>Bagdasarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-purpose+plasmid+cloning+vectors.+II.+Broad+host+range%2C+high+copy+number%2C+RSF1010-derived+vectors%2C+and+a+host-vector+system+for+gene+cloning+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas.</a> Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).</li>
<li>Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+analysis+of+DNA-binding+proteins+by+yeast+one-hybrid+and+one-two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems.</a> Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).</li>
<li>Yawata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+biofilm+development+in+a+microfluidic+device+using+modified+confocal+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy.+Third+edition%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition</a>. , Springer. Germany. (2006).</li>
<li>Blacker, T. S., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitochondrial+redox+state+using+NADH+and+NADPH+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence.</a> Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).</li>
<li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+spectroscopy+and+imaging%3A+A+tool+for+biomedical+research+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461(2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ישנן שתי נקודות קריטיות בשיטה זו שיש לעקוב אחריהן מקרוב כדי להשיג תוצאות ניתנות לשחזור: 1) לשמור על תפוקת כוח הלייזר תחת מטרת המיקרוסקופ עקבית באמצעות אורכי גל עירור וניסויים, ו -2) לבצע פילוח תאים מדויק.
הנקודה הראשונה חשובה במיוחד כאשר משווים את חתימת הפלואורסצנטיות המולדת בין ניסויים שונים. הימנע פשוט מהחלת אותן הגדרות "אחוז פלט" על אורכי הגל של העירור (כלומר, שימוש בתפוקת הספק של 5% עבור כל קווי הלייזר 405, 488, 514 ו- 530 ננומטר), מכיוון שפלט הכוח המרבי יכול להיות שונה עד לסדר גודל בין קו...

ביומולקולים מגוונים בתוך תא 1 פולטים אותות פלואורסצנטיות אוטומטית, וחתימת הפלואורסצנטיות המולדת של תא מורכבת מהרכבה של אותות אלה. פלואורסצנטיות חתימה זו משקפת תכונות תאיות שונות וגם הבדלים במצב הפיזיולוגי. ניתוח של פלואורסצנטיות מולדת הוא זעיר פולשני ויכול להשלים בדיקות מיקרוביולוגיות מסורתיות ו פולשניות יותר שמשאירות מגוון של עקבות משינוי מטבולי קל להרס תאים מלא. בעוד טכניקות מסורתיות כגון DNA או חילוץ תוכן תא2,3, פלואורסצנטית בהכלאה במקום4, והכנסת גנים עיתונאי פלואורסצנטי לגנום יעילים בקביעת סוג התא או מצב פיזיולוגי, הם בדרך כלל דורשים מניפולציה של התאים או תיוג פולשני.
מחקרים על הפלואורסצנטיות המולדת של מושבות מיקרוביאליות חיות ושלמות שונות, כולל השעיות של תרבית מיקרואורגניאלית בתפזורת5,6, בוצה פעילה7, רקמות יונקים8,9 ותאי יונקים1,10, הראו כי ניתוח פלואורסצנטיות מולד מאפשר ניתוח ללא תגים של סוגי תאים ומצב פיזיולוגי. חתימות פלואורסצנטיות מולדות נותחו באופן מסורתי ברמת האוכלוסייה ולא ברמת התא הבודד, ולכן מחייבות תרבות כלונסאות. לעומת זאת, טכניקת ה-innate fluorescence של innate (CRIF) בסיוע מיקרוסקופיה confocal,11 המתוארת כאן משחזרת ומקטלגת את חתימת הפלואורסצנטיות התאית המולדת של כל תא מיקרוביאלי חי. יתר על כן, CRIF יכול לאסוף באופן שיטתי את חתימת הפלואורסצנטיות המולדת של תא מיקרוביאלי יחיד בתוך אוכלוסייה המופצת במרחב תלת מימדי (תלת-ממדי).

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Wako Chemicals</td><td>312-01193</td><td></td></tr><tr><td>מפצלי קרן</td><td>קרל זייס, ניקון</td><td></td><td>MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, או MBS 488/543/633 מפצלי קרן (קארל זייס)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>קרל זייס, ניקון</td><td></td><td>דגם LSM 880 (קארל זייס), דגם A1R (ניקון)</td></tr><tr><td>החלקות כיסוי</td> זכוכית <td>מטסונאמי</td><td>C024601</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית</td><td>Matsunami Glass</td><td>S011120</td><td></td></tr><tr><td>מראה חצי השתקפות</td><td>קארל זייס, Nikon</td><td></td><td>NT80/20</td></tr><tr><td>מד כוח לייזר</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>PM400 (קונסולת מד כוח) ו-S175C (חיישן)</td></tr> <tr><td>LB Broth</td><td>Nacalai tesque</td><td>20066-95</td><td>לתרבית חיידקים</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונות</td><td>The MathWorks</td><td></td><td>MATLAB גרסה 2019a ואילך, יש צורך בארגז כלים לעיבוד תמונה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אובייקטיבי</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td>440762-9904</td><td>למשל תוכנית 63x Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss)</td></tr><tr><td>תוכנת מיקרוסקופ</td><td>Carl Zeiss, Nikon</td><td></td><td>ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon)</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako Chemicals</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>שפת</td><td></td><td></td> <td>תכנותPython וספריות, מודולים (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) נדרשים להריץ את סקריפט ה-PCA המצורף.</td></tr><tr><td>אטם סיליקון</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P24744</td><td></td></tr><tr><td>תחנת עבודה</td><td></td><td></td><td>מומלצת תחנת עבודה בעלת ביצועים גבוהים עם GPUs נפרדים.</td></tr><tr><td>תמצית שמרים-פפטון-דקסטרוז (YPD) אגר בינוני</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Y1500-250G</td><td>לתרבית שמרים</td></tr><tr><td>מדיום YPD</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Y1375-250 גרם</td><td></td></tr></tbody></table>

שחזור חתימות פלואורסצנטיות מולדות חד-תאיות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

מתואר כאן הוא השתקפות קונפוקלית בסיוע מיקרוסקופיה ניתוח פלואורסצנטיות מולדת (CRIF), שיטה זעיר פולשנית לשחזור חתימת הפלואורסצנטיות התאית המולדת מכל תא חי בודד באוכלוסייה המופצת במרחב תלת מימדי (תלת-ממדי). חתימת הפלואורסצנטיות המולדת של תא היא אוסף של אותות פלואורסצנטיות הנפלטים על ידי ביומולקולים שונים בתוך התא. מחקרים קודמים קבעו כי חתימות פלואורסצנטיות מולדות משקפות תכונות תאיות שונות והבדלים במצב הפיזיולוגי ומהוות מקור מידע עשיר לאפיון וזיהוי תאים. חתימות פלואורסצנטיות מולדות נותחו באופן מסורתי ברמת האוכלוסייה, מה שמחייב תרבות כלונסאות, אך לא ברמת התא הבודד. CRIF מתאים במיוחד למחקרים הדורשים רזולוציה תלת-ממדית ו/או מיצוי סלקטיבי של אותות פלואורסצנטיות מתאים בודדים. מכיוון שחתימת הפלואורסצנטיות היא מאפיין מולד של תא, CRIF מתאים גם לחיזוי ללא תגים של סוג ו /או מצב פיזיולוגי של תאים שלמים ובודדים. שיטה זו עשויה להיות כלי רב עוצמה לניתוח תאים יעיל, שבו הפנוטיפ של כל תא בודד באוכלוסייה הטרוגנית יכול להיות מוערך ישירות על ידי חתימת autofluorescence שלה תחת מיקרוסקופ ללא תיוג תאים.

איור 1A מציג את חתימת הפלואורסצנטיות האופיינית לתא יחיד של תא חיידקי המוצג כעלילה מסורתית בספקטרום (למעלה) וכמפת חום (באמצע). איור 1B מציג את התוצאה של פילוח תאים 2D מדויק על גבי תמונת CRM המקורית של אוכלוסייה של חיידקי קרקע (פסאודומונס putida KT2440)12. חתימות הפלואורסצנטיות המולדות המתקבלות עבור האוכלוסייה מוצגות כמפת חום באיור 1D. שים לב כי השתנות ריבוי תוך-כבידתי הייתה מינורית יחסית לאחר פילוח תא...

כאן, מוצג פרוטוקול לחילוץ וקיטלוג אופטי של חתימות פלואורסצנטיות תאיות מולדות (כלומר, אוטופלואורסצנטיות תאית) מכל תא חי בודד המופץ במרחב תלת מימדי. שיטה זו מתאימה לחקר חתימת הפלואורסצנטיות המולדת של מערכות ביולוגיות מגוונות ברזולוציה של תא אחד, כולל תאים מחיידקים, פטריות, שמרים, צמחים ובעלי חיים.

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

טכניקה זו מציעה מחקר ייחודי להוכחת זהות התא או המאפיינים הפיזיולוגיים שלך ברמת התא הבודד ללא צורך בתיוג פולשני. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם בכך שהיא מאפשרת רזולוציה מרחבית ברמת תא בודד לניתוח שלך, ושהיא מאפשרת את ההבחנה בין תהליך הרקע לתהליך הרקע. כך שטכניקה זו יכולה לתרום לזיהוי ולניתוח פנוטיפי של חיידקים פתוגניים.ניתן ליישם טכניקה זו גם לחקר ההטרוגניות הפנוטיפית, או לניטור המצב הפיזיולוגי של אוכלוסיית המיקרואורגניזמים בעלי העניין. מי שידגים את ההליך יהיה קיוסוקה טקאבה, עוזר פרופסור מהמעבדה שלי. מערך מיקרוסקופיית ההשתקפות הקונפוקלית והמיקרוספקטרוסקופיה הקונפוקלית הרב-ערוצית.חבר את המיקרוסקופ הקונפוקלי עם תעלות ספקטרליות סרוקות לצינור מכפיל פוטו. ציידו את המיקרוסקופ במטרת צמצם מספרית גבוהה, עם הגדלה נאותה. וצייד את המיקרוסקופ במראה חצי השתקפות כדי להכיל מיקרוסקופ השתקפות קונפוקלי, המסתמך על הפיזור התאי של האור הפוגע כדי לדמיין את המורפולוגיה של התא.עבור מיקרוספקטרוסקופיה קונפוקלית רב-ערוצית, ציידו את המיקרוסקופ במראות דיכרואיות והשתמשו במד כוח לייזר כדי להתאים את עוצמת התאורה לכל אורך גל עירור. לאחר מכן הגדר את הפלט מתחת למיקרוסקופ כך שיהיה קבוע דרך אורכי גל העירור. כדי לדמות את החיידקים דרך המיקרוסקופ, הגדר את גודל חור הסיכה ליחידת שטח של 1.0 בתוכנת המיקרוסקופ והגדר את זמן השהייה של הפיקסלים עבור כל אורך גל עירור.הגדר את רזולוציית הסריקה. עבור תאים קטנים כגון חיידקים, השתמש בשטח סריקה של 1024 על 1024. הגדר את טווח Z-Scanning כך שאזור העניין יכוסה.ובאמצעות חלון ספקטרלי של שמונה עד 10 ננומטר, הגדר את גלאי D-Scan ללכוד את טווח אורכי הגל הנראה. לאחר מכן רכוש תמונות מיקרוספקטרוסקופיה קונפוקלית רב-ערוצית ברצף מאורכי גל עירור ארוכים לקצרים ביותר כדי ליצור ערימות Z של תמונות פלואורסצנטיות ותמונות מיקרוסקופיה של השתקפות קונפוקלית, ולשמור את התמונות בפורמט tiff של 16 סיביות. כדי לבצע פילוח תאים ושחזור של חתימות פלואורסצנטיות מולדות של תא בודד, פתח תוכנה מתאימה לניתוח תמונות ולחץ פעמיים כדי לפתוח את אחד הסקריפטים שסופקו.תחת לשונית העורך, לחץ על הפעל. יופיע חלון בחירת תיקיה. בחר את הספרייה שבה נשמרו תמונות Z-Stack ולחץ על Open.תיבת דו-שיח המבקשת את הקלט של פרמטר הפילוח תופיע אוטומטית. הגדר את סף בינאריזציה של תמונה ל-0-1, את בינאריזציה של התמונה ל-0.45, את הסף העליון לאזור תא ל-200, את הסף התחתון לאזור תא ל-10 ואת מספר הגלאים ל-32. תופיע תיבת דו-שיח המבקשת קלט עבור מספר אורכי הגל של העירור.הזן את מספר אורכי הגל המשמשים לרכישת התמונה ולחץ על אישור. תופיע תיבת דו-שיח המבקשת קלט עבור אורכי גל העירור. הזן את אורכי גל העירור ברצף מהקצר ביותר לארוך ביותר ולחץ על אישור.יופיע חלון תמונה חדש המציג תמונת מיקרוסקופיה של השתקפות קונפוקלית. בחר אזור רקע שרירותי לשימוש עבור חיסור הרקע וצייר מלבן בתוך תמונת מיקרוסקופ ההשתקפות הקונפוקלי. לחץ פעמיים בתוך האזור שנבחר כדי לאשר את הבחירה ולאתר ספרייה חדשה בשם חתימה.כדי לבצע טכניקות להפחתת מימדים, צור ספרייה ריקה ותן שם לספרייה parent_directory. אחסן את החתימות הפלואורסצנטיות של כל אחת משתי אוכלוסיות התאים בשתי ספריות נפרדות ופתח את ממשק שורת הפקודה של תחנת העבודה. הזן את הפקודה.כאשר בחירת ספריית יעד מוצגת, בחר את parent_directory. לאחר מכן, בתיקיית parent_directory, אתר את ה- PCA. PNG, שיכיל את עלילת ניתוח הרכיבים העיקרית המתקבלת.כאן, מוצגת חתימה פלואורסצנטית טיפוסית של תא יחיד של תא חיידקי המוצגת כעלילת ספקטרום מסורתית וכמפת חום. באיור זה, ניתן להבחין בפילוח תאים דו-ממדי לא מדויק על גבי תמונת מיקרוסקופ ההשתקפות הקונפוקלית המקורית של אוכלוסיית חיידקי קרקע. עם החתימות הפלואורסצנטיות המולדות המתקבלות עבור האוכלוסייה המוצגות כמפת חום.שימו לב שהשונות בתוך האוכלוסייה הייתה מינורית יחסית לאחר פילוח תאים מוצלח. כאן, דוגמה לפילוח תאים לא מדויק מוצגת כעל כפויה על אותה אוכלוסייה של P.putida כפי שהוצג קודם לכן. ההשפעה של פילוח התאים הלא מדויק על החתימות הפלואורסצנטיות המולדות של האוכלוסייה ניכרת בקלות מהמספר הניכר של חריגים שנצפו במפת החום המתאימה.פילוח תאים לא מדויק מביא לאשכול רופף יותר לאחר ניתוח רכיבים עיקריים, בהשוואה לאשכול הסוג המתקבל לאחר פילוח תאים מדויק. למרות השונות הקלה של חתימה פלואורסצנטית מולדת שנצפתה בתוך זני חיידקים בודדים, כל אוכלוסייה יוצרת אשכול נפרד בעלילת ניתוח הרכיבים העיקרית. באיור זה, ניתן להבחין בפילוח תאים תלת מימדי לא מדויק על גבי תמונת מיקרוסקופ ההשתקפות הקונפוקלית המקורית של אוכלוסיית שמרים ניצנים Saccharomyces cerevisiae YM4271.שימו לב להיעדר חריגים ולחתימות הפלואורסצנטיות המולדות הנובעות מכך עבור האוכלוסייה. חיוני לרכוש תמונה נקייה ככל האפשר על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית ולהימנע מרוויה בעוצמת האות מכיוון שרעש יכול לקלקל את דיוק הניתוח שלאחר מכן. אתה יכול לאמן מודלים של למידת מכונה עם מערך הנתונים המולד של החתימה המערבית לשימוש במשימות סיווג או חיזוי, המציע ניתוח אוכלוסייה ללא תגים וחיזוי פנוטיפי.

reconstruction-single-cell-innate-fluorescence-signatures-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי (FPALM) כדי לדמות בו זמנית סוגים מרובים של מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי בתוך התאים. הטכניקות המתוארות מניבות לוקליזציה של אלפי עד מאות אלפי חלבונים בודדים המסומנים בסימון פלואורסצנטי, עם דיוק של עשרות ננומטרים בתוך תאים בודדים.

הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לדמיין ולעקוב אחר קולטנים בודדים על פני תאים חיים ובכך לנתח את הניידות הרוחבית של הקולטן, גודל קומפלקסי הקולטנים וכן לדמיין אינטראקציות קולטן-קולטן חולפות. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחלבוני ממברנה אחרים.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

מחקרים של ביומולקולות in vivo חיוניים להבנת תפקוד מולקולרי בהקשר ביולוגי. כאן אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת הפנמה של ביומולקולות פלואורסצנטיות, כגון DNA או חלבונים, למיקרואורגניזמים חיים. ניתוח נתונים in vivo שנרשמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מוצג ונדון גם כן.

הפנמה והתבוננות של פלורסנט מולקולות ביולוגיים במיקרואורגניזמים שחיים דרך Electroporation

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

נוגדנים לאגד היעד הקולטנים על פני השטח של התא יכול להתייעץ קונפורמציה והשינויים קיבוץ באשכולות. שינויים דינמיים אלה יש השלכות על אפיון פיתוח תרופות בתאי המטרה. פרוטוקול זה מנצל מיקרוסקופיה קונפוקלית וספקטרוסקופיה של המתאם תמונה דרך ImageJ/פיג'י לכמת את מידת קולטן קיבוץ באשכולות על פני התא.

מיקרוסקופיה קונפוקלית מגלה התא קולטן משטח צבירת דרך התמונה המתאם ספקטרוסקופיה

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

אנו מתארים את גישת ההדמיה לקביעת המצב oligomeric הממוצע של megfp-מתויג-קולטן מתויגים oligomeric הנגרמת על ידי ליגנד קשירה ממברנה פלזמה של תאים חיים. הפרוטוקול מבוסס על סך הכל מיקרוסקופ של השתקפות פנימית (TIRF) בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות (N &amp; B).

ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות

הלבנה איטרטיבית ספקטרלית מרחיבה ריבוי (IBEX) מתבססת על טכניקת IBEX הבסיסית על ידי הוספת חסימת הפרין כדי למזער קשירה לא ספציפית ומינוף זיהוי ספקטרלי עם פירוק חישובי כדי לדכא אוטופלואורסצנטיות. גישה זו מאיצה את רכישת התמונה תוך הפחתת מקורות הרקע, ומאפשרת ניתוחים פרוטאומיים מרחביים רב-עגולים ובעלי פרמטרים גבוהים.

הדמיה גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ספקטרלית כדי למזער פלואורסצנטיות רקמות לא ספציפיות

פרוטוקול זה מפרט את יישומי ההדמיה המתקדמים ואת ניהול המשאבים המשותפים של מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי סורקת לייזר, המשולבת עם גלאי מערך מרובה לעיבוד ברזולוציה גבוהה להדמיה תאית ותת-תאית ברזולוציה גבוהה. תהליך העבודה מאפשר הדמיה מולטימודלית מקונפוקלי לרזולוציה סופר (~120 ננומטר) בתוך פלטפורמה אחת, מה שמקל על הדמיה בקנה מידה ננומטר.

דימות ברזולוציה גבוהה וניהול משותף: פרוטוקול למיקרוסקופיה קונפוקלית עם זיהוי מולטיפלקס

למדו שחזור חתימות פלואורסצנטיות מולדות בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית רב-ערוצית. שיטה זו מאפשרת ניתוח תאים בודדים ללא תיוג פולשני במיקרואורגניזמים ובתאים איקריוטיים.

שחזור חתימות פלואורסצנטיות מולדות חד-תאיות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית

גלה סרטונים נוספים