Name: שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: חקור אינטראקציות ספציפיות לרקמות של ממלווים ב-Caenorhabditis elegans באמצעות מסכים סינתטיים ו-RNAi. שיטה זו מאפשרת לזהות תפקודים ייחודיים של חלבונים ברקמות שונות ולהבין תהליכים ביולוגיים מורכבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למרכז לגנטיקה של Caenorhabditis, במימון המרכז הלאומי למשאבי מחקר של NIH (NCRR), על חלק מזני הנמטודה. נוגדנים חד שבטיים שפותחו על ידי ה.פ. אפשטיין התקבלו מבנק ההיברידיומה למחקרים התפתחותיים שפותח בחסות ה- NICHD ומתוחזק על ידי המחלקה לביולוגיה, אוניברסיטת איווה. מחקר זה נתמך על ידי מענק של הקרן הישראלית למדע (מענק מס' 278/18) ובמענק ממשרד המדע והטכנולוגיה ומשרד החוץ ושיתוף הפעולה הבינלאומי, המנהל הכללי לקידום המדינה, הרפובליקה האיטלקית (מענק מס' 14337). אנו מודים לחברי מעבדת בן צבי על העזרה בהכנת כתב יד זה.

1. הכנת לוחות מדיה צמיחה נמטודה עבור RNAi
<ol><li>לבקבוק 1 L, הוסיפו 3 גרם של NaCl, 2.5 גרם של Bacto-Peptone, 17 גרם אגר ומים מזוקקים עד 1 L ו autoclave.</li>
	<li>בקבוק מגניב ל 55 °C (55 °F).</li>
	<li>הוסף 25 מ"ל של 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של 1 M MgSO4, ו 1 מ"ל של פתרוןכולסטרול (טבלה 1) כדי להפוך את מדיה צמיחה נמטודה (NGM).</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של אמפצילין (100 מ"ג / מ"ל) ו 0.5 מ"ל של 1 M IPTG(טבלה 1) כדי להפוך פתרון NGM-RNAi. הערה: חיידקי HT115(DE3) E. coli הנפוצים מכילים פולימראז DNA T7 שאינו ניתן לתמיכת IPTG המשמש להבעת פלסמידים קידוד dsRNA. פלסמידים אלה מקודדים גם עמידות באמפיצ'ילין.</li>
	<li>מערבבים את התמיסה החמה על ידי מערבולת הבקבוק.</li>
	<li>בשכונה או באמצעות הליכים סטריליים, יוצקים את תמיסת ה- NGM לצלחות או באמצעות משאבה פריסלטית, מחלקים את הפתרון לצלחות. השתמש 6-טוב, 12-טוב, 40 מ"מ או 60 מ"מ לוחות עבור מסך זה. אגר צריך למלא בערך 2/3 מעומק הצלחת.</li>
	<li>תן את הצלחות להתייבש לילה על הספסל בטמפרטורת החדר, שמירה על הצלחות מכוסות. לוחות NGM עבור RNAi ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד חודש.</li>
</ol>2. גידול חיידקי RNAi וזריעת הצלחות
<ol><li>בשכונה או באמצעות הליכים סטריליים, להוסיף 1 מ"ל של אמפצילין (100 מ"ג / מ"ל) ו 2.5 מ"ל של טטרציקלין (5 מ"ג / מ"ל) (טבלה 1) לפתרון 1 ליטר אוטומטי מראש של פתרון LB ומערבב. הערה: חיידקי HT115(DE3) E. coli נפוצים עמידים לטטרציקלין.</li>
	<li>בשכונה או באמצעות הליכים סטריליים, להוסיף 600 μL של פתרון LB לכל באר 2 מ"ל עמוק 96-צלחות סטריליות. עדיף להשתמש בצנרת רב ערוצית לחלוקת המדיה.</li>
	<li>באמצעות הליכים סטריליים, לחסן בארות עם חיידקי HT115(DE3) E. coli השתנה עם פלסמיד קידוד dsRNA מיקוד גן של עניין או plasmid ריק, כמו שליטה. מכסים את הצלחות ודגר ב 37 °C (50 °F) לילה. ספריות המורכבות משיבוטים חיידקיים המבטאים dsRNA, המקביל לכ -94% מהגנים החזויים C. elegans נבנו בעבר22,23 והם זמינים מסחרית. ספריית המלווה ששימשה כאן נבנתה על ידי מעבדת ד"ר ריצ'רד מורימוטו26.</li>
	<li>באמצעות הליכים סטריליים, זרע 75, 150 או 250 μL של חיידקים על 12-well, 40 מ"מ ו 6-טוב או 60 מ"מ NGM RNAi לוחות, בהתאמה. סמן בבירור את שם גן המטרה על הלוח. חיידקים צריכים לכסות 30-50% משטח אגר ולא צריך לגעת בשולי הצלחת.</li>
	<li>אפשר צלחות להתייבש לפחות 2 ימים על הספסל בטמפרטורת החדר, שמירה על הצלחות מכוסות. הערה: ניתן לדגור צלחות ב 37 °C (50 °F) לילה. ודאו שהבארות הפנימיות יבשות לפני השימוש או אחסון הצלחות. לכל המטרות לטווח ארוך (כלומר, ייבוש או אחסון) שמור את הצלחות בחושך. צלחות מיובשות, זרעים ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד חודש.</li>
</ol>3. סנכרון לא מלחיץ של עוברים
<ol><li>השתמש בבחירת תולעים כדי להעביר כ-100 ביצים מצלחת תולעת לא מסונכרנת ללוח גז טבעי נוזלי שזה עתה נזרע.</li>
	<li>לטפח בעלי חיים במשך 5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3.5 ימים ב 20 °C (5 °F) או 2.5 ימים ב 25 °C (5 °F). בעלי חיים צריכים להגיע ליום הראשון של הטלת ביצים. הערה: תולעים מעובדות בדרך כלל ב 20 °C (50 °F). עם זאת, זנים מוטנטיים מלווים שונים עשויים לדרוש טמפרטורות טיפוח ספציפיות. לדוגמה, זנים רגישים לטמפרטורה רבים מעובדים ב 15 °C (5 °F) אבל עבר 25 °C (5 °F) כדי לחשוף פנוטיפ שלהם.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של חוצץ M9(טבלה 1)לאט והרחק מהמדשאה החיידקית. סובב את הצלחת כך שהמאגר יכסה לחלוטין את הצלחת. לאחר מכן להטות אותו לצד אחד ולהסיר את הנוזל מהצלחת לשטוף את החיות מהצלחת. הערה: בעת שימוש בבעלי חיים רגישים לטמפרטורה או מוטציות ליווי, עדיף לשמור על המאגרים המשמשים בפרוטוקול בטמפרטורת הטיפוח של בעלי החיים.</li>
	<li>חזור על שלב 3.3 שלוש פעמים או עד שכל החיות נשטפות מהצלחת.</li>
	<li>בעזרת קצה פלסטיק סטנדרטי, חותכים ריבוע אגר מהצלחת השטופה שבה מרוכזות הביצים ומניחים את חתיכת אגר על צלחת NGM חדשה. הערה: ~ 200 ביצים נדרשים לייצר מספיק בעלי חיים מטילי ביצים; יותר מדי בעלי חיים צורכים את החיידקים מהר מדי. רמות מזון נמוכות יכולות להשפיע על פרוטאוסטזיס27.</li>
	<li>לטפח את בעלי החיים במשך 5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3.5 ימים ב 20 °C (5 °F) או 2.5 ימים ב 25 °C (5 °F). בשלב זה, הצלחות צריכות להיות מכוסות בביצים מסונכרנות. הערה: ניתן להעביר בעלי חיים לצלחת חדשה למשך זמן קצר לסנכרון מחמיר יותר. עם זאת, חשוב להשתמש רק במבוגרים בשלבים המוקדמים של הטלת ביצים כמו בעלי חיים יכולים לשמור ביצים ברחם שלהם המשפיעים על סנכרון.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של חוצץ M9 לאט הרחק הדשא החיידקי.</li>
	<li>סובב את הצלחת כך שהמאגר יכסה לחלוטין את הצלחת. לאחר מכן להטות אותו לצד אחד ולהסיר את הנוזל מהצלחת לשטוף את החיות מהצלחת.</li>
	<li>חזור על שלב 3.7 שלוש פעמים או עד שכל בעלי החיים נשטפים מהצלחת.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של חוצץ M9 והשתמש מגרד תא כדי לשחרר את הביצים מהצלחת.</li>
	<li>לאסוף את מאגר M9 המכיל את הביצים מהצלחות.</li>
	<li>צנטריפוגה חוצץ M9 המכיל את הביצים ב 3,000 x גרם במשך 2 דקות.</li>
	<li>הסר את supernatant ולהוסיף מאגר M9 כדי להגיע לאמצעי אחסון של 1 מ"ל.</li>
	<li>resuspend הביצים כדי לשבש כל גושים של ביצים וחיידקים.</li>
	<li>חזור על הליך הכביסה המתואר בשלבים 3.11-3.13 חמש פעמים. גלולה ביצה צריך להיראות לבן. אם הוא עדיין צהוב/חום, חזור על הכביסה עד להשגת גלולה לבנה. הערה: חיידקים שנותרו על הביצים יכולים לזהם את החיידקים המביעים dsRNA.</li>
	<li>הסר את רוב supernatant, משאיר על 200 μL. ביצים מסונכרנות ניתן להשתמש עבור מסכי RNAi.</li>
</ol>4. מבדים פנוטיפיים נפוצים
<ol><li>טיפוח בעלי חיים במהלך ניסויים<ol>
<li>מניחים טיפה של ~ 30 ביצים קרוב למדשאה החיידקית בכל צלחת זרעים RNAi. לעיון, יש גם להניח ~30 ביצים על צלחות זרעים עם חיידקים ריקים המכילים וקטור (L4440).</li>
		<li>לטפח בעלי חיים מסונכרנים לגיל על לוחות זרעי RNAi NGM. משך הניסוי יהיה תלוי בשלב שבו יש לעקוב אחר בעלי החיים וטמפרטורת הטיפוח. התאם את טמפרטורת הטיפוח בעת שימוש בחיות מוטנטיות רגישות לטמפרטורה. התאם את משך הטיפוח בעת שימוש בבעלי חיים מוטנטיים המתעכבים התפתחותית. הערה: בעוד התזמון יכול להשתנות, ברגע שבעלי חיים מגיעים לבגרות, הטלת ביצים (וצריכת המזון המהירה הנובעת מכך), כמו גם קריסת פרוטאוסטזיס תלוית גיל28, עלולה להשפיע על התוצאות. לכן מומלץ להבקיע בעלי חיים לפני תחילת הטלת הביצים (יום 1 לבגרות). חיות מסוג בר להגיע לשלב זה לאחר 4.5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3 ימים ב 20 °C (5 °F) או 2 ימים ב 25 °C (5 °F).</li>
		<li>מספר החזרות בהן נעשה שימוש יהיה תלוי בגודל ערכת הגנים שנבדקה. בספריית המלווה (97 גנים), ניסויים חוזרים לפחות ארבע פעמים. גודל האוכלוסייה תלוי באיזו נעשה שימוש. בהתקפות ההתנהגותיות שנדונו כאן, ציון >15 בעלי חיים לכל מצב ניסיוני בכל חזרה. נתונים ניתוחים סטטיסטיים גם תלויים מאוד בסוג של מבדק בשימוש. נתונים בבדקים שנדונו כאן יכולים להיות מוצגים כאמצעי ± SEM.</li>
		<li>השווה את בעלי החיים RNAi- וריק בקרה וקטורית התייחסו לאוכלוסיות עצמאיות. ניתן לחשב ערכי P באמצעות ANOVA חד-כיווני או דו-כיווני, בהתאם לשינויים שנבדקו, כלומר מחמירים או מקלים לבד או שניהם. בעת בחינת טיפול RNAi יחיד לעומת בקרה, ערכי P ניתן לחשב באמצעות חד כיווני או דו כיווני מאן-ויטני דירוג סכום הבדיקה. מלבד מובהקות סטטיסטית, שקול סף להיטים בהתבסס על מידת ההשפעה על הפנוטיפ.</li>
	</ol></li>
	<li>מעצר/עיכוב התפתחותי<ol>
<li>לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד שבעלי חיים גדלים על חיידקי בקרה ריקים המכילים וקטור להגיע לבגרות אבל לפני הטלת ביצים מתחיל.</li>
		<li>נטר בעלי חיים באמצעות סטריאומיקרוסקופ וספור את מספר הזחלים והמבוגרים כדי לקבל את אחוז בעלי החיים המתעכבים בהתפתחות. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקי בקרה ריקים המכילים וקטורים. hsp-1 או hsp-90 RNAi טיפול תוצאות מעצר התפתחותי של חיות סוג בר והוא יכול לשמש שליטה חיובית.</li>
		<li>כדי לקבל את אחוז בעלי החיים המתעכבים התפתחותית לאורך זמן, חזור על שלב 4.2.2. הערה: אם יש מבוגרים מטילי ביצים על הצלחת, להעביר את בעלי החיים המתעכבים התפתחותית לצלחת חדשה NGM-RNAi שכותרתו לאותו גן יעד כדי למנוע בלבול עם צאצאים.</li>
	</ol></li>
	<li>סטריליות או הטלת ביצים פגמים<ol>
<li>לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד בעלי חיים גדל על חיידקים ריקים וקטור שליטה להתחיל להטיל ביצים.</li>
		<li>לעקוב אחר בעלי חיים באמצעות סטריאומיקוסקופ ולהשיג את אחוז בעלי החיים ללא ביצים גלויות ברחם שלהם. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקים ריקים לשליטה וקטורית.</li>
		<li>לחלופין, לפקח על בעלי חיים באמצעות סטריאוטיקרוסקופ ולהבקיע את אחוז בעלי החיים עם רחם מלא ביצים, המוגדר EGg מטיל פגום (Egl-d) פנוטיפ29.</li>
	</ol></li>
	<li>קטלניות עוברית<ol>
<li>לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד שבעלי החיים מתחילים להטיל ביצים.</li>
		<li>מעבירים ~ 100 ביצים לצלחת ריקה. מורחים את הביצים בשורות כדי לפשט את הספירה.</li>
		<li>ציון האחוז של ביצים unhatched על הצלחת לאחר 24-48 שעות. לעיון, השווה לביצים של בעלי חיים שטופלו בחיידקים ריקים לשליטה וקטורית.</li>
	</ol></li>
	<li>שיתוק אסאי<ol>
<li>עבור יום 1 מבוגרים, לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד בעלי חיים גדל על חיידקים ריקים שליטה וקטורית להגיע לבגרות אבל לפני הטלת ביצים מתחיל.</li>
		<li>צייר קו על הגב של צלחת אגר NGM רגילה באמצעות סמן דק.</li>
		<li>מניחים 5-10 בעלי חיים על הקו המסומן.</li>
		<li>הגדר שעון זמן והמתן 10 דקות.</li>
		<li>ציון אחוז החיות שנותרו על הקו כמו תולעים משותקות. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקים ריקים לשליטה וקטורית. חיות מסוג בר שטופלו עם unc-45 RNAi להראות פנוטיפ שיתוק חמור והוא יכול לשמש שליטה חיובית. הערה: מעש זה מדגיש בעלי חיים המציגים שיתוק בינוני עד חמור. בעלי חיים כאלה בדרך כלל שוכבים ישר על הצלחת, במקום להציג את הצורה המעוקלת הנפוצה. יתר על כן, תיקון נקי מחיידקים נראה סביב ראשיהם של תולעים משותקות.</li>
	</ol></li>
	<li>חבטות אסאי<ol>
<li>לטפח בעלי חיים מסונכרנים גיל כמו בשלב 4.1 עד בעלי חיים גדל על חיידקים ריקים וקטור שליטה להגיע לבגרות אבל לפני הטלת ביצים מתחיל.</li>
		<li>צינור 100 μL של חוצץ M9 בטמפרטורת הטיפוח של בעלי החיים לתוך צלחת 96 באר.</li>
		<li>מניחים ~ 15 תולעים, אחת לבאר, לתוך בארות המכילות מאגר M9.</li>
		<li>תן לבעלי החיים להסתגל במשך 5 דקות.</li>
		<li>בדקו כל חיה מתחת לסטריאוטיקרוסקופ, התחל שעון זמן בספירה לאחור של 15 s וספור את מספר כיפופי הגוף שכל חיה מבצעת באותה תוחלת זמן. ניתן לנרמל את הערכים שנספרו לכיפופי גוף לדקה. לעיון, השווה לבעלי חיים מוטנטיים הגדלים על חיידקים ריקים לשליטה וקטורית. הערה: זה תנועתיות assay הוא רגיש מאוד והוא יכול לזהות הבדלים קלים מאוד בין טיפולים. עם זאת, תנועתיות בנוזל ותנועתיות על אגר יכול להיות שונה.</li>
	</ol></li>
</ol>5. אימות של נוקאאוט חלבון
<ol><li>הניחו 250-300 ביצים מסונכרנות על צלחת NGM-RNAi 60 מ"מ עם החיידקים הרלוונטיים המביעים dsRNA או ריקים המכילים וקטור (L4440). הערה: RNAi נוקאאוט עלול לגרום הצטברות חריגה של עוברים, בהיעדר עוברים או במעצר התפתחותי שעלול להשפיע על ביטוי הגנים. יש לקחת זאת בחשבון בעת קביעת גיל בעלי החיים שיש לבחון.</li>
	<li>עבור יום 1 מבוגרים, לטפח בעלי חיים במשך 4.5 ימים ב 15 °C (5 °F), 3 ימים ב 20 °C (55 °F) או 2 ימים ב 25 °C (5 °F).</li>
	<li>בחר והעבר בסך הכל 200 בעלי חיים צעירים למבוגרים לתוך מכסה של צינור 1.5 מ"ל מלא עם 200 μL של PBS-T. הערה: בעת שימוש בבעלי חיים רגישים לטמפרטורה או מוטציות ליווי, עדיף לשמור על המאגרים המשמשים בפרוטוקול בטמפרטורת הטיפוח של בעלי החיים.</li>
	<li>סגרו את המכסה בזהירות וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 1 דקות.</li>
	<li>הוסף 800 μL של PBS-T(טבלה 1)וצנטריפוגה ב 1,000 x g במשך 1 דקות.</li>
	<li>הסר בזהירות את 900 μL העליון.</li>
	<li>חזור על שלבים 5.4-5.6 שלוש פעמים.</li>
	<li>הסר 900 μL, משאיר 100 μL של פתרון המכיל את 200 תולעים.</li>
	<li>הוסף 25 μL של 5x מאגר מדגם(טבלה 1).</li>
	<li>מחממים את הדגימות במשך 10 דקות ב 92°C תוך רועד ב 1000 סל"ד. לאחר מכן ניתן להקפיא את הדגימות ושמר על -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>טען 20 μL של כל דגימה ולהפעיל על ג'ל SDS-PAGE.</li>
	<li>בצע ניתוח כתם מערבי באמצעות נוגדנים מתאימים כדי לקבוע את היציבות היחסית של החלבון.</li>
	<li>קבע את עוצמת הרצועות באמצעות תוכנה צפיפות, כגון מודול ג'ל ImageJ זמין באופן חופשי. נרמל את כל הערכים לאלה שנמדדו בדגימות הבקרה. הערה: המטרה של RNAi נוקאאוט במסכים שלנו היא להוריד את רמות החלבון של מלווה מסוים / מלווה שותף. לכן, הדרך הטובה ביותר להעריך את היעילות של RNAi נוקאאוט היא על ידי ניתוח כתם מערבי. זה דורש נוגדנים ספציפיים. לחלופין, ניתן להשתמש ב- qPCR כדי לכמת את רמות ה- mRNA.</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תמונה משולבת של רשת הפרוטאוסטזיס המשקפת כיצד היא מאורגנת ומתפקדת בתאים ורקמות מטזואניים שונים נותרה חסרה. כדי להתמודד עם חסרונות אלה, נדרש מידע ספציפי על האינטראקציות של רכיבים שונים של רשת זו, כגון מלווים מולקולריים, ברקמות ספציפיות במהלך ההתפתחות וההזדקנות. כאן, הראינו כיצד השימוש בהתעלות ספציפית לרקמות אפשר לנו לבחון את רשת המלווה ברקמה נתונה. כדי לחקור אינטראקציות גנטיות ספציפיות לרקמות המלווה, שלוש גישות שונות נחשבו. בגישה הראשונה, UNC-45, מלווה המתבטא מאוד בתאי שריר, שימש לסנן עבור אינטראקציות מלווה באמצעות האכלה-R...

תאים להתמודד עם נזק חלבון על ידי שימוש במכונות בקרת איכות לתקן, לבודד או להסיר חלבונים פגומים1,2. קיפול והרכבה של מתחמי חלבון נתמכים על ידי מלווים מולקולריים, קבוצה מגוונת של חלבונים שמורים מאוד שיכולים לתקן או לבודד חלבונים פגומים3,4,5,6,7. הסרת חלבונים פגומים בתיווך מערכת ubiquitin-proteasome (UPS)8 או על ידי מכונות autophagy9 בשיתוף עםמלווים 10,11,12. הומיוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס) הוא, אם כן, מתוחזק על ידי רשתות בקרת איכות המורכבות ממכונות קיפול והשפלה3,13. עם זאת, הבנת האינטראקציות בין המרכיבים השונים של רשת הפרוטאוסטזיס ב- vivo היא אתגר גדול. בעוד שמסכי אינטראקציה בין חלבון חלבון תורמים מידע חשוב על אינטראקציות פיזיות ומתחמי ליווי14,15, הבנת הארגון ומנגנוני פיצוי בתוך רשתות ליווי ספציפיות לרקמות ב- vivo חסרה.
אינטראקציות גנטיות משמשות לעתים קרובות ככלי רב עוצמה לבחינת קשר בין זוגות גנים המעורבים במסלולים ביולוגיים נפוצים או מפצים16,17,18. יחסים כאלה יכולים להימדד על ידי שילוב זוגות של מוטציות וכימות ההשפעה של מוטציה בגן אחד על החומרה הפנוטיפית הנגרמת על ידי מוטציה בגן השני16. בעוד שרוב השילובים כאלה אינם מראים כל השפעה במונחים של פנוטיפ, כמה אינטראקציות גנטיות יכול גם להחמיר או להקל על חומרת הפנוטיפ הנמדד. מוטציות מחמירות נצפות כאשר הפנוטיפ של מוטציית המחיקה הכפולה חמור יותר מהפנוטיפ הצפוי שנראה בשילוב מוטציות המחיקה הבודדות, מה שמרמז על כך ששני הגנים מתפקדים במסלולים מקבילים, יחד המשפיעים על תפקוד נתון. לעומת זאת, מוטציות מקלות נצפות כאשר הפנוטיפ של מוטציית המחיקה הכפולה הוא פחות חמור מהפנוטיפ שנראה עם מוטציות המחיקה הבודדות, מה שמרמז על כך ששני הגנים פועלים יחד כמורכב או משתתפים באותו מסלול16,18. בהתאם לכך, פנוטיפים מגוונים שניתן לכמת, כולל פנוטיפים רחבים, כגון קטלניות, שיעורי צמיחה וגודל הגוזל, כמו גם פנוטיפים ספציפיים, כגון כתבים תמלול, שימשו לזיהוי אינטראקציות גנטיות. לדוגמה, Jonikas ואח ' הסתמכו על כתב מתח ER לבחון אינטראקציות של Saccharomyces cerevisiae ER פתחה רשת פרוטאוסטזיס תגובת חלבון באמצעות ניתוחי מחיקת גנים זוגגנים 19.
מסכי אינטראקציה גנטית כרוכים בחצייה שיטתית של מוטציות מחיקה זוגיות כדי ליצור קבוצה מקיפה של מוטציות כפולות20. עם זאת, במודלים של בעלי חיים, ובמיוחד ב- C. elegans, גישה רחבת היקף זו אינה ריאלית. במקום זאת, זנים מוטנטיים יכולים להיבדק לדפוסי האינטראקציה הגנטית שלהם על ידי זיהוי גנים מווסת באמצעות הפרעות RNA (RNAi)21. ג. אלגנס היא מערכת רבת עוצמה למסכים המבוססת על RNAi22,23. ב C. elegans, משלוח RNA כפול גדילים (dsRNA) מושגת על ידי האכלה חיידקית, מה שמוביל להתפשטות של מולקולות dsRNA לרקמות רבות. באופן זה, מולקולות dsRNA הציג להשפיע על החיה באמצעות הליך מהיר ופשוט21. מסך אינטראקציה גנטית באמצעות RNAi יכול, אם כן, לחשוף את ההשפעה של ויסות מטה קבוצה של גנים או רוב C. elegans קידוד גנים באמצעות ספריות RNAi24. במסך כזה, להיטים המשפיעים על ההתנהגות של מוטציה של עניין אבל לא זן סוג פראי הם מכפילים פוטנציאליים של פנוטיפ להיות במעקב25. כאן, אנו מיישמים שילוב של מוטציות והקרנת RNAi כדי למפות באופן שיטתי אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמות ב- C. elegans.

<table><tbody><tr><td>צלחות 12 בארות</td><td>SPL</td><td>BA3D16B</td><td></td></tr><tr><td>40 מ"מ</td><td>לוחות גריינר ביו-וואן</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>96 באר 2 מ"ל 128.0/85 מ"מ</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>780278</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>פורמדיום</td><td>AGA03</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Formedium</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>Sigma</td><td>BO126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>Qimaging</td><td>q30548</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>אמרסקו</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>קונפוקלי</td><td>Leica</td><td>DM5500</td><td></td></tr><tr><td>מסנן (0.22 ומיקרו; m)</td><td>Sigma</td><td>SCGPUO2RE</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>MZ165FC</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פרוטרום</td><td>2355519000024</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Bio-Lab</td><td>001649029100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher</td><td>22189-08-8</td><td>מתנה ממעבדת Morimoto</td></tr><tr><td>Myosin MHC A (MYO-3) נוגדן</td><td>Hybridoma Bank</td><td>5-6</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>s-0751</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>001903029100</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck</td><td>61930705001730</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזיגת צלחות</td><td>אינטגרה</td><td>עושה את זה p920</td><td></td></tr><tr><td>ספריית מלווה RNAi</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA SDS</td><td>VWR Life Science</td><td>0837-500</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;- מרקפטואתנול</td><td>ביו וורלד</td><td>41300000-1</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>טטרציקלין</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>64-75-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Lab</td><td>002009239100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש באלגנים של caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

קיפול והרכבה נכונים של חלבונים ומתחמי חלבון חיוניים לתפקוד התא. תאים משתמשים במסלולי בקרת איכות המתקנים, מבודדים או מבטלים חלבונים פגומים כדי לשמור על פרוטאום בריא, ובכך מבטיחים פרוטאוסטזיס תאי ומונעים נזק נוסף לחלבון. בגלל פונקציות יתירות בתוך רשת proteostasis, הקרנה עבור פנוטיפים לגילוי באמצעות נוקאאוט או מוטציות בגנים קידוד מלווה באורגניזם הרב תאי Caenorhabditis elegans תוצאות גילוי של פנוטיפים קלים או ללא ברוב המקרים. פיתחנו אסטרטגיית סינון ממוקדת לזיהוי מלווים הנדרשים לפונקציה מסוימת ובכך לגשר על הפער בין פנוטיפ לתפקוד. באופן ספציפי, אנו עוקבים אחר אינטראקציות מלווה חדשניות באמצעות מסכי אינטראקציה סינתטית RNAi, הבעת ביטוי מלווה, מלווה אחד בכל פעם, בבעלי חיים הנושאים מוטציה בגן קידוד מלווה או הבעת יתר של מלווה של עניין. על ידי שיבוש שני מלווים כי בנפרד להציג פנוטיפ ברוטו, אנו יכולים לזהות מלווים להחמיר או לחשוף פנוטיפ מסוים כאשר שניהם מוטרדים. אנו מדגימים כי גישה זו יכולה לזהות קבוצות ספציפיות של מלווים הפועלים יחד כדי לווסת את הקיפול של קומפלקס חלבון או חלבון הקשורים פנוטיפ נתון.

שימוש במוטציות רגישות לטמפרטורה ב-UNC-45 כדי לסנן להחמיר או להקל על אינטראקציות בתנאים מתירניים או מגבילים, בהתאמה הרכבה ותחזוקת שרירים מציעים מערכת יעילה לחקר אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמות. היחידה התפקודית של שרירים מתכווצים, הסרקומר, מציגה סידור דמוי גבישי של חלבונים מבניים ורגולטוריים. היציבות של מיוסין חלבון מוטורי ושילובו לתוך חוטים עבים של sarcomeres שרירים מתכווצים תלוי בשיתוף פעולה של מלווים ורכיבי UPS30. דוגמה של מלווה אחד כזה הוא מלווה מיוסין שמור ומיוחד UNC-45 המ...

כדי לחקור אינטראקציות מלווה מלווה מלווה-מצע, אנו מבצעים מסכי אינטראקציה סינתטית ב elegans Caenorhabditis באמצעות הפרעות RNA בשילוב עם מוטציות קלות או ביטוי יתר של מלווים ולנטר תפקוד לקוי של חלבון ספציפי לרקמות ברמה האורגנית.

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא בתכנון הניתן למעקב גנטי Caenorhabditis elegans היא לזהות אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת מבחנים קלים לשימוש כגון התאמת בינה מלאכותית של גולן וקריאות התנהגותיות כדי לחשוף אינטראקציות ספציפיות לרקמות חדשות. לסנכרון עוברים לא מלחיץ, השתמש בקוטף תולעים כדי להעביר כ-100 ביצים מצלחת תולעת לא מסונכרנת לצלחת NGM חדשה ולטפח את החיות בהתאם ללוח הזמנים הניסיוני המתאים.כאשר בעלי החיים מגיעים ליום הראשון של הטלת הביצים, הוסיפו לאט לאט מיליליטר אחד של מאגר M9 לצלחת, הרחק ממדשאת החיידקים, וסובבו את הצלחת כך שהמאגר יכסה לחלוטין את הצלחת. הטה את הצלחת לצד אחד כדי להסיר את הנוזל ולשטוף את בעלי החיים מהצלחת. לאחר שכל התולעים נשטפו מהצלחת, השתמש בקצה פיפטה מפלסטיק רגיל כדי לחתוך ריבוע אגר סביב המקום שבו מרוכזות הביצים ולהניח את חתיכת האגר על צלחת NGM חדשה.מטפחים את הביצים באותם תנאי תרבות. בתום הדגירה יש לכסות את הצלחת בביצים מסונכרנות. לאחר שטיפת כל החיות מהצלחת כפי שהודגם זה עתה, הוסף מיליליטר אחד של מאגר M9 טרי והשתמש במגרד תאים כדי לשחרר את הביצים מהצלחת.לאחר ניתוק כל הביצים, העבירו את כל נפח החיץ מהצלחת לצינור חרוטי לצנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינור והשליכו את הסופרנטנט. לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסיפו עד מיליליטר אחד של מאגר M9 טרי לצלחת ופיפטה כדי להשהות מחדש את הביצים.שטפו את הביצים חמש פעמים נוספות כפי שהודגם זה עתה. לאחר הכביסה האחרונה, כדור הביצה אמור להיראות לבן וניתן להסיר את כל המיקרוליטרים מלבד 200 המיקרוליטרים האחרונים של סופרנטנט. כדי לגדל נמטודות מסונכרנות לניסוי, הניחו טיפה של כ-30 ביצים קרוב לדשא החיידקים וכל צלחת RNA הפרעה וכ-30 ביצים על צלחת שיושבת עם וקטור ריק המכיל חיידקים.לאחר מכן לטפח את בעלי החיים בתנאי התרבות המתאימים על פי פרוטוקול הניסוי. כדי להעריך את הקטלניות העוברית של בעלי החיים המסונכרנים, כאשר בעלי החיים מתחילים להטיל ביצים, העבירו כ-100 ביצים לצלחת ריקה ופזרו את הביצים לשורות כדי לפשט את הספירה. לאחר 24 עד 48 שעות, קלעו את אחוז הביצים שלא בקעו.לעיון, השוו את ביצי חיות הניסוי לביצים של בעלי חיים שטופלו בחיידקי בקרת וקטור ריקים. כדי להקים מבחן שיתוק, טפחו בעלי חיים מסונכרנים עם גיל על חיידקי בקרת וקטור ריקים, עד שהחיות מגיעות לבגרות, אך לפני תחילת הטלת הביצים. השתמש בטוש עדין כדי לצייר קו על גב צלחת אגר NGM רגילה, והנח חמש עד עשר חיות על הקו המסומן.הגדר טיימר ל-10 דקות וציין את אחוז החיות שנותרו על הקו כתולעים משותקות. לעיון, השווה נתונים אלה לאחוז בעלי החיים המוטנטיים שגדלו על חיידקי בקרת וקטור ריקים. לצורך אימות נוקדאון חלבון, הנח 250 עד 300 ביצים מסונכרנות על לוחית RNA הפרעה של 60 מילימטר NGM היושבת עם ביטוי RNA דו-גדילי רלוונטי או וקטור ריק המכיל חיידקים, וגדל את הביצים לתקופת הניסוי המתאימה.בתום הדגירה, העבירו בסך הכל 200 בעלי חיים בוגרים צעירים לתוך מכסה של צינור של 1.5 מיליליטר המכיל 200 מיקרוליטר PBST הנשמר בטמפרטורת הגידול של בעלי החיים. סגור את המכסה בזהירות, וצנטריפוגה את בעלי החיים ב 1000 פעמים G למשך דקה. בתום הצנטריפוגה, הוסיפו 800 מיקרוליטר PBST טרי לצינור וצנטריפוגה שוב את התולעים.הסר בזהירות את 900 המיקרוליטרים העליונים של הסופרנטנט, ושטוף את הנמטודות ב-PBST טרי 3 פעמים נוספות כפי שהודגם זה עתה. לאחר הכביסה האחרונה, הסר את כל המיקרוליטרים מלבד 100 המיקרוליטרים האחרונים של הסופרנטנט והוסף 25 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 5 לבעלי החיים. מחממים את הדגימות במשך 10 דקות בחום של 92 מעלות צלזיוס ו-1000 סיבובים לדקה, לפני טעינת 20 מיקרוליטר מכל דגימה על ג'ל דף SDS.לאחר מכן בצע ניתוח כתמים מערביים באמצעות הנוגדנים המתאימים כדי לקבוע את היציבות היחסית של החלבון המבוקש, והשתמש בתוכנה צפופה כדי לקבוע את עוצמת האיסור. HSP6 שנפל במהלך ההתפתחות גורם לעצירה התפתחותית חזקה בחיות בר. יחד עם זאת, HSP6 שהופל בזן RNA הפרעה ספציפית לשריר המבטא RDE1 מסוג פרא ברקמת השריר אינו גורם לעצירת התפתחות.בעוד ש-HSP6 הפיל זן RNAI ספציפי למעי המבטא RDE1 מסוג פרא בתאי המעי, גורם לעצירת התפתחות חזקה ופנוטיפ. מוטציה ב-HSP6 MG585 הגורמת לעיכוב גדילה קל, יכולה, לפיכך, לשמש לבדיקת החמרה או הקלה על אינטראקציות צ'פרון על ידי חציית זן הנושא את הגן המוטנטי לזן RNA הפרעות ספציפיות במעי, וסינון ספריית ה-RNA של הפרעות המלווה . ארגון המיוזין ובעלי חיים מוטנטיים UNC45 שטופלו ב-RNA הפרעות STI1 AHSA1 או DAF41, דומה לזה של תולעים מסוג בר בשלב הזחל הרביעי.למרות שהמוטאנטים מציגים סרקומרים משובשים לאחר שהגיעו לבגרות. לעומת זאת, הן בעלי החיים המוטנטיים UNC45 שטופלו בבקרת וקטור ריק והן חיות בר נותרות ללא פגיעה. אינטראקציות גנטיות אינן מעידות על אינטראקציה פיזית.לפיכך, יש לבצע ניסויי מעקב באמצעות מסך אינטראקציה גנטית כדי לאמת ולבחון ישירות את אופי האינטראקציות שזוהו.

using-caenorhabditis-elegans-to-screen-for-tissue-specific-chaperone

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הליך culturing נוזלי מבוסס מחלק...

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה...

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

כדי לחקור את הקשר בין הומאוסטזיס חלבון, מתח והזדקנות, עקבנו אחר שינויים בקיפול החלבון על ידי מעקב אחר תפקוד לקוי של חלבון, לוקליזציה של חלבון בתא ויציבות החלבון ברמת האורגניזם, התא והחלבון, תוך שימוש במטזואן Caenorhabditis elegans הניתן לטיפול גנטי כמערכת מודל.

שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

התפשטות דמוית פריון של אגרגטים חלבוניים התגלתה לאחרונה כמעורבת במחלות ניווניות רבות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש בנמטודה C. elegans כמערכת מודל לניטור התפשטות חלבון ולחקירת תופעות דמויות פריון.

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

שיטה זו מתארת פרוטוקול להכנת תמצית חלבון בתפוקה גבוהה מדגימות אלגנים של Caenorhabditis ו- co-immunoprecipitation לאחר מכן.

הכנת תמצית חלבון ושיתוף חיסוני מאלגנים של קנורהאביטיס

אלגנס נמטודה מתיחה גנטית Caenorhabditis יכול לשמש מודל פשוט וזול לגילוי תרופות. מתואר כאן פרוטוקול לזיהוי טיפולי נגדים המעכבים את האיתות במורד הזרם של חלבוני RAS ו- EGFR.

זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת הפעילויות הנוירו-הגנתיות של תרכובות בדיקה ב - Caenorhabditis elegans, כולל צבירה של פוליגלוטמין, מוות עצבי והתנהגות כימואבואידית, כמו גם שילוב מופתי של פנוטיפים מרובים.

Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לגילוי תרכובות ביו-אקטיביות נגד רעילות עצבית בתיווך פוליגלוטמין

חיידקי מעיים עשויים להשפיע באופן חיובי או שלילי על בריאות המארח שלהם באמצעות מנגנונים ספציפיים או שמורים. Caenorhabditis elegans היא פלטפורמה נוחה לסינון עבור חיידקים כאלה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר סינון בתפוקה גבוהה של 48 חיידקים מבודדים להשפעה על עמידות לעקה של נמטודה, המשמשים כפרוקסי לבריאות התולעים.

הקרנה בתפוקה גבוהה של מבודדים מיקרוביאליים עם השפעה על בריאות Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ATAC-seq מהיר ופשוט שיושם בתולעת שלמה בשלב L4 Caenorhabditis elegans באמצעות 30 מיקרו-ליטר של כדור תולעת בלבד.

פרופיל נגישות כרומטין בזחלים שלמים של Caenorhabditis elegans L4

חקור אינטראקציות ספציפיות לרקמות של ממלווים ב-Caenorhabditis elegans באמצעות מסכים סינתטיים ו-RNAi. שיטה זו מאפשרת לזהות תפקודים ייחודיים של חלבונים ברקמות שונות ולהבין תהליכים ביולוגיים מורכבים.

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

גלה סרטונים נוספים