שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא בתכנון הניתן למעקב גנטי Caenorhabditis elegans היא לזהות אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת מבחנים קלים לשימוש כגון התאמת בינה מלאכותית של גולן וקריאות התנהגותיות כדי לחשוף אינטראקציות ספציפיות לרקמות חדשות. לסנכרון עוברים לא מלחיץ, השתמש בקוטף תולעים כדי להעביר כ-100 ביצים מצלחת תולעת לא מסונכרנת לצלחת NGM חדשה ולטפח את החיות בהתאם ללוח הזמנים הניסיוני המתאים.

כאשר בעלי החיים מגיעים ליום הראשון של הטלת הביצים, הוסיפו לאט לאט מיליליטר אחד של מאגר M9 לצלחת, הרחק ממדשאת החיידקים, וסובבו את הצלחת כך שהמאגר יכסה לחלוטין את הצלחת. הטה את הצלחת לצד אחד כדי להסיר את הנוזל ולשטוף את בעלי החיים מהצלחת. לאחר שכל התולעים נשטפו מהצלחת, השתמש בקצה פיפטה מפלסטיק רגיל כדי לחתוך ריבוע אגר סביב המקום שבו מרוכזות הביצים ולהניח את חתיכת האגר על צלחת NGM חדשה

מטפחים את הביצים באותם תנאי תרבות. בתום הדגירה יש לכסות את הצלחת בביצים מסונכרנות. לאחר שטיפת כל החיות מהצלחת כפי שהודגם זה עתה, הוסף מיליליטר אחד של מאגר M9 טרי והשתמש במגרד תאים כדי לשחרר את הביצים מהצלחת.

לאחר ניתוק כל הביצים, העבירו את כל נפח החיץ מהצלחת לצינור חרוטי לצנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינור והשליכו את הסופרנטנט. לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסיפו עד מיליליטר אחד של מאגר M9 טרי לצלחת ופיפטה כדי להשהות מחדש את הביצים.

שטפו את הביצים חמש פעמים נוספות כפי שהודגם זה עתה. לאחר הכביסה האחרונה, כדור הביצה אמור להיראות לבן וניתן להסיר את כל המיקרוליטרים מלבד 200 המיקרוליטרים האחרונים של סופרנטנט. כדי לגדל נמטודות מסונכרנות לניסוי, הניחו טיפה של כ-30 ביצים קרוב לדשא החיידקים וכל צלחת RNA הפרעה וכ-30 ביצים על צלחת שיושבת עם וקטור ריק המכיל חיידקים.

לאחר מכן לטפח את בעלי החיים בתנאי התרבות המתאימים על פי פרוטוקול הניסוי. כדי להעריך את הקטלניות העוברית של בעלי החיים המסונכרנים, כאשר בעלי החיים מתחילים להטיל ביצים, העבירו כ-100 ביצים לצלחת ריקה ופזרו את הביצים לשורות כדי לפשט את הספירה. לאחר 24 עד 48 שעות, קלעו את אחוז הביצים שלא בקעו.

לעיון, השוו את ביצי חיות הניסוי לביצים של בעלי חיים שטופלו בחיידקי בקרת וקטור ריקים. כדי להקים מבחן שיתוק, טפחו בעלי חיים מסונכרנים עם גיל על חיידקי בקרת וקטור ריקים, עד שהחיות מגיעות לבגרות, אך לפני תחילת הטלת הביצים. השתמש בטוש עדין כדי לצייר קו על גב צלחת אגר NGM רגילה, והנח חמש עד עשר חיות על הקו המסומן.

הגדר טיימר ל-10 דקות וציין את אחוז החיות שנותרו על הקו כתולעים משותקות. לעיון, השווה נתונים אלה לאחוז בעלי החיים המוטנטיים שגדלו על חיידקי בקרת וקטור ריקים. לצורך אימות נוקדאון חלבון, הנח 250 עד 300 ביצים מסונכרנות על לוחית RNA הפרעה של 60 מילימטר NGM היושבת עם ביטוי RNA דו-גדילי רלוונטי או וקטור ריק המכיל חיידקים, וגדל את הביצים לתקופת הניסוי המתאימה.

בתום הדגירה, העבירו בסך הכל 200 בעלי חיים בוגרים צעירים לתוך מכסה של צינור של 1.5 מיליליטר המכיל 200 מיקרוליטר PBST הנשמר בטמפרטורת הגידול של בעלי החיים. סגור את המכסה בזהירות, וצנטריפוגה את בעלי החיים ב 1000 פעמים G למשך דקה. בתום הצנטריפוגה, הוסיפו 800 מיקרוליטר PBST טרי לצינור וצנטריפוגה שוב את התולעים.

הסר בזהירות את 900 המיקרוליטרים העליונים של הסופרנטנט, ושטוף את הנמטודות ב-PBST טרי 3 פעמים נוספות כפי שהודגם זה עתה. לאחר הכביסה האחרונה, הסר את כל המיקרוליטרים מלבד 100 המיקרוליטרים האחרונים של הסופרנטנט והוסף 25 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 5 לבעלי החיים. מחממים את הדגימות במשך 10 דקות בחום של 92 מעלות צלזיוס ו-1000 סיבובים לדקה, לפני טעינת 20 מיקרוליטר מכל דגימה על ג'ל דף SDS.

לאחר מכן בצע ניתוח כתמים מערביים באמצעות הנוגדנים המתאימים כדי לקבוע את היציבות היחסית של החלבון המבוקש, והשתמש בתוכנה צפופה כדי לקבוע את עוצמת האיסור. HSP6 שנפל במהלך ההתפתחות גורם לעצירה התפתחותית חזקה בחיות בר. יחד עם זאת, HSP6 שהופל בזן RNA הפרעה ספציפית לשריר המבטא RDE1 מסוג פרא ברקמת השריר אינו גורם לעצירת התפתחות.

בעוד ש-HSP6 הפיל זן RNAI ספציפי למעי המבטא RDE1 מסוג פרא בתאי המעי, גורם לעצירת התפתחות חזקה ופנוטיפ. מוטציה ב-HSP6 MG585 הגורמת לעיכוב גדילה קל, יכולה, לפיכך, לשמש לבדיקת החמרה או הקלה על אינטראקציות צ'פרון על ידי חציית זן הנושא את הגן המוטנטי לזן RNA הפרעות ספציפיות במעי, וסינון ספריית ה-RNA של הפרעות המלווה . ארגון המיוזין ובעלי חיים מוטנטיים UNC45 שטופלו ב-RNA הפרעות STI1 AHSA1 או DAF41, דומה לזה של תולעים מסוג בר בשלב הזחל הרביעי.

למרות שהמוטאנטים מציגים סרקומרים משובשים לאחר שהגיעו לבגרות. לעומת זאת, הן בעלי החיים המוטנטיים UNC45 שטופלו בבקרת וקטור ריק והן חיות בר נותרות ללא פגיעה. אינטראקציות גנטיות אינן מעידות על אינטראקציה פיזית.

לפיכך, יש לבצע ניסויי מעקב באמצעות מסך אינטראקציה גנטית כדי לאמת ולבחון ישירות את אופי האינטראקציות שזוהו.