Name: זיהום זחלי זברה עם נבגי אספרגילוס לניתוח אינטראקציות מארח-פתוגן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: למדו מודל זיהום Aspergillus בזחלי דגי זברה לחקירת תגובות חיסון מולדות. שיטת מיקרו-הזרקה לאזור המוח האחורי מאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות תאי חיסון-פתוגן ומסייעת בזיהוי מטרות טיפוליות לדלקת ריאות פולשנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר K22AI134677. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Latge, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus+and+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus and aspergillosis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).</li>
<li>Denning, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Invasive aspergillosis.</a> Clinical Infectious Diseases. 26 (4), 781-803 (1998).</li>
<li>Dagenais, T. R., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Aspergillus+fumigatus+in+Invasive+Aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).</li>
<li>Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillosis+case-fatality+rate%3A+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).</li>
<li>Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+animal+models+of+aspergillosis+in+studying+immunity+against+Aspergillus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Mycologie+M%C3%A9dicale%22%5BJournal%5D)">Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections.</a> Journal de Mycologie Médicale. 29 (1), 84-96 (2019).</li>
<li>Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+protection+against+conidia+by+mononuclear+and+against+mycelia+by+polymorphonuclear+phagocytes+in+resistance+to+Aspergillus.+Observations+on+these+two+lines+of+defense+in+vivo+and+in+vitro+with+human+and+mouse+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).</li>
<li>Behnsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+dimensionality+controls+the+interaction+of+phagocytes+with+the+pathogenic+fungi+Aspergillus+fumigatus+and+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), 13(2007).</li>
<li>Torraca, V., Mostowy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Infection%3A+From+Pathogenesis+to+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology.</a> Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).</li>
<li>Rosowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Host+for+Invasive+Fungal+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections.</a> Journal of Fungi. 4 (4), (2018).</li>
<li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).</li>
<li>Knox, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+phagocyte+responses+to+Aspergillus+fumigatus+conidia+and+hyphae+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae.</a> Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).</li>
<li>Rosowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+inhibit+Aspergillus+fumigatus+germination+and+neutrophil-mediated+fungal+killing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing.</a> PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229(2018).</li>
<li>Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus+establishes+infection+in+zebrafish+by+germination+of+phagocytized+conidia%2C+while+Aspergillus+niger+relies+on+extracellular+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12791(2019).</li>
<li>Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-glucan-dependent+shuttling+of+conidia+from+neutrophils+to+macrophages+occurs+during+fungal+infection+establishment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000113(2019).</li>
<li>Herbst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis-dependent+activation+of+a+TLR9-BTK-calcineurin-NFAT+pathway+co-ordinates+innate+immunity+to+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).</li>
<li>Shah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+Orchestrates+Lateral+Transfer+of+Aspergillus+fumigatus+during+Macrophage+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenate+sensitivity+of+a+laeA+mutant+is+restored+by+overexpression+of+the+bZIP+protein+MetR+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus.</a> Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifunctional+Small+Molecules+Enhance+Neutrophil+Activities+Against+Aspergillus+fumigatus+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro.</a> Frontiers in Immunology. 10, 644(2019).</li>
<li>Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+voriconazole+against+A.+fumigatus+infection+depends+on+host+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).</li>
<li>Herbst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+clinically+relevant+murine+model+of+solid-organ+transplant+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis.</a> Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).</li>
<li>Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+immune+cell+clearance+of+Aspergillus+fumigatus+spores+and+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae.</a> Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).</li>
<li>Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+Imaging+of+the+Innate+Immune+Response+in+a+Zebrafish+Larval+Model+of+Streptococcus+iniae+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52788(2015).</li>
<li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+transparent+zebrafish%3A+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).</li>
<li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zWEDGI%3A+Wounding+and+Entrapment+Device+for+Imaging+Live+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).</li>
<li>Huemer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Live+Imaging+Device+for+Improved+Experimental+Manipulation+of+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56340(2017).</li>
<li>Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+Antifungal+Drug+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Clinical+Microbiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Update on Antifungal Drug Resistance.</a> Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).</li>
</ol>

אין קונפליקטים או אינטרסים פיננסיים לחשוף.

מודל הזיהום המתואר כאן מועיל לניתוח התגובות החיסוניות המארחות, אינטראקציות מארח-פתוגן ופתוגנזהפטרייתית 12,13,14,15. מידע זה יכול להיגזר מהדמיה ברזולוציה גבוהה של פתוגנים בעלי תווית פלואורסצנטית ותאים מארחים13, הישרדות זחל והתמדה של CFU לאורך זמן.
טכניקת microinjection היא קריטית להצלחת פרוטוקול זה, ייתכן שיהיה צורך להתאים בעת שימוש בציוד microinjection שונים והגדרות. בפרט, הלחץ וזמן ההזרקה הם שני משתנים עיקריים וניתן להתאים אותם כדי להבטיח כי נפח נפלט על ידי המחט הוא ~ 3 nL. גודל המחט כפי שנקבע על ידי גזירתו עם מלקחיים גם מסדיר את מספר הנבגים מוזרקים; אמנם, פתח גדול יותר יכול לגרום נזק לרקמות הזחל. מצד שני, קטן מדי של פתח לא יאפשר את הנבגים גדולים יחסית (>2 מיקרומטר) החוצה יכול להוביל סתימת מחט. אם זה קורה, המחט ניתן reclipped יש פתח קצת יותר גדול.
פרוטוקולים אחרים עבור microinjection של חיידקים לנצל PVP-40 כדי לסייע בשמירה על תערובת הזרקה הומוגנית, אבל לא מצאנו שום יתרון בשימוש במנשא זה עם נבגי אספרגילוס. סתימת המחט יכולה להיות מופחתת על ידי מערבולת ההכנה הפטרייתית ביסודיות כדי לשבור את כל גושים לפני טעינת המחט. לפעמים, סתימת המחט יכול גם להיות נעקר על ידי הגדלה זמנית של זמן הלחץ או ההזרקה והפעלת microinjector בעוד המחט היא בנוזל המקיף את הזחלים. הלחץ וזמן ההזרקה לאחר מכן צריך להיות ירד שוב לרמות קודמות. במקרים אחרים, לא ניתן להסיר סתימה, ומחט חדשה צריכה להיות טעונה וכיול מחדש.
פרוטוקול זה נועד להזריק ~ 30-70 נבגים לכל זחל. זה ידוע כי בהתבסס על הריכוז של הכנת הנבג ואת נפח מוזרק, מספר זה הוא נמוך למדי. עם זאת, נמצא באופן אמפירי כי זהו מספר הנבגים מוזרקים בתנאים אלה. מדוע הבדל זה מתרחש אינו ידוע, אבל זה יכול להיות בגלל נבג גושים במחט. הניסיונות שלנו להזריק מספר גדול יותר של נבגים לא צלחו ברובם.
כדי להבטיח כ 30-70 נבגים מוזרקים ולשמור על עקביות של זריקות בכל הזחלים, לבדוק את מספר הנבגים על ידי הזרקת על E3 המקיף את הזחלים. חזור על זה כל חמישה עד שישה זחלים לאורך כל הזריקות. אם ספירת הנבגים משתנה, ניתן להתאים את הלחץ ו/או זמן ההזרקה כדי להזריק מספר עקבי של נבגים על פני זחלים מרובים. עם זאת, יש להקפיד כי מינון ההזרקה נשאר בעיקר ב hindbrain ואינו ממלא את midbrain ו forebrain.
כדי להבטיח זיהום מקומי, ההשעיה נבג צריך להיות כלול בתוך החדר hindbrain. זה יכול להיות דמיינו על ידי כתמים אדומים פנול רק לאחר ההזרקה, אם כי הצבע האדום מתפזר עם הזמן. עבור זריקות, האזור סביב vesicle אוטי משמש לנקב דרך ולהגיע לחדר בזווית של 45°-65°. באזור זה אין כלי דם עיקריים, גורם פחות נזק לרקמות, ומרפא באופן מיידי. אם העור מעל החדר הוא פירסינג, ההשעיה נבג ניתן לדלוף החוצה, כי המחט שיש להשתמש בהם עבור זריקות נבג אספרגילוס הוא גדול יותר מזה משמש השעיות חיידקים. זחלים מוזרקים או פגומים בטעות יכולים להיות מסומנים על ידי הזרקת חלמון כמה פעמים כדי ליצור סימן אדום או על ידי גרירת הזחל מחוץ לשורה עם המחט. לאחר קבוצה של זריקות הושלמה, זחלים אלה יש להסיר ולהיפטר לפני השאר נשטפים מהצלחת. E3 ללא כחול מתילן משמש כדי להרדים זחלים לפני ההזרקה וגם לשמור זחלים לאחר הזריקות, כי כחול מתילן הוא אנטי פטרייתי.
בזמן ההזרקה, ספירות CFU מייצגות את מספר הנבגים הקיימים בתוך המארח הנגוע. עם זאת, אם הנבגים לנבוט לתוך hyphae, אלה יכולים להיות מחולקים נפרד קיימא "יחידות פטרייתיות" במהלך הומוגניזציה יכול להוליד מושבות מרובות. לחלופין, היפה רב-תאית רצופה יכולה להוליד מושבה אחת, וכתוצאה מכך ייצוג ממוצע, אך לא סביר, של הנטל הפטריוני. זה יכול להיות מקל על ידי שילוב ספירת CFU עם מיקרוסקופיה אורך של זחלים בודדים, אשר מספק נתונים חזותיים של גורלם של נבגים מוזרקים.
בהשוואה למערכת היונקים, מודל זיהום זחל הזברה משמעותי במיוחד בשל הנגישות האופטית שלו. הגיוס והתגובה של תאי חיסון מולדים ניתן לדמיין בתוך מארח שלם חי. זה יכול להיות משולב עם עיכוב גנטי או כימי של מטרות מולקולריות כדי לנתח כיצד כל מטרה משפיעה על תגובת מקרופאג ' או נויטרופילים נגד נבגי אספרגילוס בבעל חיים.
בעוד זחל זברה אספרגילוס מודל ההדבקה ממשיך להיות אינסטרומנטלי בתיאור היבטים שונים של IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, ישנם תחומים אחרים של התרחבות. מהצד המארח, הוא משמש לתיאור תגובות חיסוניות ברמה התאית, אך ניתן להרחיב זאת כדי לנתח מנגנונים חיסוניים ברמה המולקולרית על ידי שילובו עם מורפולינו ממוקד, CRISPR, קווי מוטנטים יציבים או חשיפה כימית. אזהרה אחת היא כי homologues עבור כל רכיבי מסלול חיסוני מולד יונקים ידועים לא זוהו זברה.
מצד הפתוגן תוארה ארסיות של מינים וזנים שונים. שדרה מבטיחה של מחקר עתידי היא השימוש בזני אספרגילוס מוטנטים כדי לבדוק כיצד גנים או חלבונים ספציפיים תורמים כגורמי ארסיות. ובכך, תרופות אנטי פטרייתיות חדשניות ניתן לפתח כדי למקד חלבונים אלה. תרופות אנטי פטרייתיות הנוכחי יש יעילות נמוכה בחולים אנושיים ויש עמידות גוברת לתרופות אלה פטריות28. מודל זה vivo יכול לשמש כדי לחקור מדוע תרופות אלה להיכשל כמודל ביניים כדי לבדוק את היעילות של תרופות אנטי פטרייתיות הרומן. בסך הכל, הממצאים שהתגלו באמצעות מודל זה יכולים להקל על פיתוח עתידי של טיפולים יעילים לחולים נגועים באספרגילוס.

Aspergillus fumigatus היא פטרייה סאפרופיטית בכל מקום, ואת הנבגים המוטסים שלה ניתן למצוא הן בפנים והן בחוץ1. נבגים אלה הם בשאיפה על ידי כולם אבל להיות פינה ביעילות מן הריאות של אנשים immunocompetent1,2. עם זאת, אנשים עם תנאי ריאות השתנו כגון סיסטיק פיברוזיס יכול לפתח אספרגילוזיס bronchopulmonary עקב נביטה פטרייתית בריאות3. הצורה החמורה ביותר של זיהום זה, אספרגילוזיס פולשני (IA), משפיע על אנשים immunocompromised וכרוך בצמיחה של הפטרייה לאיברים אחרים2,3. IA מוביל >50% מוות של חולים נגועים למרות הזמינות של טיפולים אנטי פטרייתיים4. אצל אנשים immunocompetent, תגובות חיסוניות מולדות לשחק תפקיד מרכזי בפינוי נבגים בשאיפה1. עם זאת, המנגנונים הספציפיים התורמים לסיווג חיסוני מולד זה אינם מובנים היטב. חשוב להבין את המנגנונים התאיים והמולקולריים של תאי חיסון מולדים מרכזיים (כלומר, מקרופאגים ונויטרופילים) באישור אספרגילוס על מנת למצוא אסטרטגיות טיפוליות חדשניות עבור IA.
בעוד מודלים יונקים סייעו בזיהוי גורמי ארסיות פטרייתיים ומארחים תגובותחיסוניות 5,6, נגישות חזותית מוגבלת לאינטראקציות מארח-פתוגן ברמה התאית. ניסויים בתרבית רקמות אינם יכולים לשחזר באופן מלא את הסביבה הרב-תאית המורכבת ואת האינטראקציות הקיימות בבעלי חיים שלמים7. לכן, זברהפיש צברה פופולריות כאורגניזם מודל חלופי כדי למלא את הפער הזה ולאפשר את המחקר של אינטראקציות מארח-פתוגן במארח חי, שלם על פני זיהום רב-יומי8,9. מערכת החיסון המולדת זברה מתפתחת כבר 24 שעות לאחר ההפריה (hpf)10, ואת המערכת האדפטיבית לוקח 4-6 שבועות לפתח11, מתן חלון זמן שבו תגובות חיסוניות מולדות ניתן להעריך בבידוד. תגובות חיסוניות מולדות שמורות היטב בין בני אדם לבין זברה דג11. זברהפיש יש תכונות רבות המאפשרות את החקירה של תגובות אלה, כולל בהירות אופטית (המאפשר הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה של מארחים שלמים) ואת המתיחה הגנטית (אשר מקל על מחקרים מכניים מולקולריים).
מודל זיהום אספרגילוס זחל זברה המתואר כאן פותח במקור על ידי נוקס ואח'12. זה הורחב לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו ואחרים לחקור מנגנונים חיסוניים מארחים12,13, המארח-פתוגן אינטראקציות13,14,15, מנגנונים של דיכוי המערכת החיסונית13,16,17, ארסיות פטרייתית18, ויעילות תרופה אנטי פטרייתית19,20. מודל זה מסכם היבטים מרובים של אספרגילוזיס אנושי. בעוד זחלים immunocompetent עמידים, זחלים immunocompromised יכול להיכנע לזיהום12,13,16,17.
במודל זה, זיהום מקומי נקבע על ידי הזרקת נבגים לתוך החדר hindbrain של זחל, אזור מאוכלס פחות עם phagocytes, גיוס phagocyte והתנהגות ניתן להעריך12,13. הוא האמין כי מקרופאגים לשמש קו ההגנה הראשון נגד נבגי אספרגילוס בבני אדם1 ומודלים יונקים6,21. באופן דומה, במודל הזברה, מקרופאגים מגויסים לנבגי אספרגילוס מוזרקים, בעוד נויטרופילים מגויסים באופן שני בתגובה לצמיחה מהפכלית12,13,22. ממודל זה, נודע גם כי אספרגילוס יכול להתמיד זחלים immunocompetent wildtype לאחר יותר מ 7 ימים של זיהום. יתר על כן, את כל מהלך הזיהום ניתן לעקוב באותם בעלי חיים חיים על ידי הדמיה קונפוקלית יומית.
פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של microinjection להזריק נבגים לתוך החדר hindbrain של 2 ימים לאחר ההפריה (2 dpf) זחלים. הזיהום מנוטר לאחר מכן עד 7 ימים, כמו זחלים זברה יכול לחיות עד 10 dpf ללא האכלה. דיכוי המערכת החיסונית יכול להיגרם על ידי טיפול תרופתי, ואת היישום של תרופות לזחלים מתואר גם. לבסוף, מתוארות שתי שיטות למעקב אחר התקדמות הזיהום, כולל כימות של CFUs מזחלים בודדים והתקנת הדמיה חיה יומית.

<table><tbody><tr><td>מלקחיים של דומונט #5</td><td>רובוז מכשירים כירורגיים ושות'</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>עינית רשת</td><td>מיקרוסקופ עולם</td><td>RETR10</td><td>לכיול מחטים, בשימוש בהגדרת מיקרו-מזרק סטריאומיקרוסקופ</td></tr><tr><td>: יחידת לחץ אחורית</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>מתג רגליים</td><td>מכשור מדעי יישומי FTSW</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת מחזיק מיקרו פיפט</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>M-Pip</td><td></td></tr><tr><td>מזרק לחץ</td><td>מכשור מדעי יישומי</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>הגדרת מיקרומניפולטור: מיקרומניפולטור</td><td>Narashige (Tritech)</td> <td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>מעמד וצלחת מגנטיים</td><td>Tritech</td><td>MINJ-HBMB</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מחט</td><td>מכשיר סאטר</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ-745</td><td></td></tr><tr><td>Tissuelyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>להומוגניזציה של זחלים</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומר</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות/תיאור</חזק></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>פישר</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>מלח</td> <td>נתרן אמפיציליןפישר</td><td>AAJ6380706</td><td></td></tr><tr><td>BSA, שבר V</td><td>VWR</td><td>AAJ65855-22</td><td></td></tr><tr><td>קנאמיצין סולפט</td><td>פישר</td><td>AAJ1792406</td><td></td></tr><tr><td>מפזרי L</td><td>פישר</td><td>14 665 230</td><td></td></tr><tr><td>מחטים מיקרו-נימיות (ללא נימה)</td><td>מכשירי דיוק עולמיים (WPI)</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפט מיקרו-מעמיס</td><td>VWR</td><td>89009-310</td><td>כדי לטעון את המחט בתרחיף אספרגילוס</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>VWR</td><td>EM475855-1R</td><td>לסינון תרחיף אספרגילוס</td></tr><tr><td>N-phenylthiourea</td><td>Fisher</td><td>AAL0669009</td><td>למניעת פיגמנטציה</td></tr><tr><td>פנול אדום, תמיסה 1%</td><td>פישר</td><td>57254</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין (אתיל 3-אמינובנזואט, מלח חומצה מתאנסולפונית)</td> <td>פישר</td><td>AC118000500</td><td>להרדמת זחלים</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>מדיה ופתרונות</חזק></td><td><חזק>רכיבים/מתכון</חזק></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3 מדיה: 60x E3</td><td>17.2 גרם NaCl, 0.76 גרם KCl, 2.9 גרם CaCl2, 4.9 גרם MgSO4 &middot; 7H2O, עד 1 ליטר עם H2O</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x E3</td><td>16.7 מ"ל 60x מלאי, 430 ul 0.05 M NaOH, עד 1 ליטר עם H2O (אופציונלי: + 3 מ"ל 0.01% מתילן כחול)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלאי טריקאין</td><td>2 גרם טריקאין, 5 גרם Na2HPO4 &middot; 7H2</ תת>O, 4.2 מ"ל 60X E3, עד 500 מ"ל עם H2O, pH עד 7.0-7.5 עם חומר NaOH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose מינימלי (GMM) אגר: אגר GMM</td><td>10 גרם גלוקוז (דקסטרוז), 50 מ"ל 20x מלחי חנקה, 1 מ"ל TE, עד 1 ליטר עם H2O, pH עד 6.5 עם NaOH, + 16 גרם אגר, אוטוקלאב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x מלחי חנקות</td><td>120 גרם NaNO3, 10.4 גרם KCl, 10.4 גרם, MgSO4 &middot; 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, עד 1 ליטר עם H2O, חיטוי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>יסודות קורט (TE)</td><td>2.20 גרם ZnSO4 &middot; 7H2O, 1.10 גרם H3BO3, 0.50 גרם MnCl2 &middot; 4H2O, 0.16 גרם FeSO4 &middot; 7H2O, 0.16 גרם CoCl2 &middot; 6H2O, 0.16 גרם CuSO4 &middot; 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 &middot; 4H2O, 5.00 גרם Na2EDTA, ל-100 מ"ל עם H2O, להמיס תוך ערבוב למשך הלילה, חיטוי</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

זיהום זחלי זברה עם נבגי אספרגילוס לניתוח אינטראקציות מארח-פתוגן

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

אספרגילוזיס פולשני (IA) הוא אחד הזיהומים הפטרייתיים הנפוצים ביותר בקרב אנשים immunocompromised. למרות הזמינות של תרופות נגד פטריות, IA יכול לגרום >50% תמותה בחולים immunocompromised נגועים. זה חיוני כדי לקבוע הן גורמים מארחים ופתוגן התורמים רגישות לזיהום ושיעורי הישרדות נמוכים בחולים נגועים על מנת לפתח טיפולים חדשניים. תגובות חיסוניות מולדות ממלאות תפקיד מרכזי בהכרה וסיווג של נבגי אספרגילוס, אם כי מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים והמולקולריים המדויקים. מודלים אמינים נדרשים כדי לחקור אינטראקציות מכניות מפורטות בין המארח לפתוגן. הבהירות האופטית והמתיחה הגנטית של זחלי הזברה הופכים אותם למודל מסקרן לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן של זיהומים חיידקיים ופטריות אנושיים מרובים במארח חי ושלם. פרוטוקול זה מתאר מודל זיהום אספרגילוס זחל זברה. ראשית, נבגי אספרגילוס מבודדים ומוזרקים לתוך החדר האחורי של דג הזברה דרך מיקרו-אינג'ינג. לאחר מכן, מעכבים כימיים כגון תרופות לדיכוי המערכת החיסונית מתווספים ישירות למים הזחל. שתי שיטות כדי לפקח על הזיהום בזחלים מוזרקים מתוארים, כולל 1) הומוגניזציה של זחלים עבור המושבה להרכיב יחידה (CFU) ספירה ו 2) חוזר ונשנה, מערך הדמיה חיה יומית. בסך הכל, טכניקות אלה ניתן להשתמש כדי לנתח באופן מכני את ההתקדמות של זיהום אספרגילוס vivo והוא יכול להיות מיושם על רקע מארח שונים זנים אספרגילוס לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן.

לאחר microinjection של נבגי אספרגילוס לתוך hindbrain של זחלים זברה, תוצאת זיהום יכול להיות ואחריו מבחנים מרובים, כולל הישרדות, CFUs, הדמיה חיה. במהלך מבחני ההישרדות, היה מעקב אחר מספר הזחלים הנגועים ששרדו 1-7 dpi. כאשר זחלים פראיים נותרו ללא טיפול, נצפה מעט מאוד מוות, כאשר כ-80%–100% מהזחלים שרדו את מות הניסוי כולו (איור 1). אם הזחלים היו מדוכאי חיסון, למשל על ידי חשיפה לתרופה קורטיקוסטרואידים dexamethasone (10 מיקרומטר), נצפתה ירידה משמעותית בהישרדות (איור 1).
כאשר יחידות CFUs כמתו לאורך כל הניסוי בן 7 הימים מזחלים מסוג בר נגועים בנבגי A. fumigatus, נצפתה התמדה של נבגים, עם סיווג איטי לאורך זמן (איור 2A). מספר הנבגים ששרדו ב- 1, 2, 3, 5 ו- 7 dpi מנורמל למספר הנבגים שהוזרקו ב- 0 dpi כדי להשוות התמדה וסיווג בין משכפלים (איור 2B).
קווי דגים מהונדסים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בלוקוציטים יחד עם נבגי אספרגילוס מבטאי חלבונים פלואורסצנטיים יכולים לשמש כדי לדמיין הן גיוס והתנהגות לויקוציטים והן נביטה פטרייתית וצמיחה13. כאשר מקרופאגים סומנו (למשל,Tg(mpeg1:H2B-GFP),,קיבוץ מאקרו ב- ~ 50% מהזחלים נצפה בדרך כלל, החל מ- 2-3 dpi (איור 3A). גיוס נויטרופילים(lyz:BFP)התעכב בדרך כלל, והתרחש בעיקר לאחר שנביטה פטרייתית התרחשה (איור 3A). בעוד נטל הפטריות נמשך במשך כל הניסוי ברוב הזחלים (איור 3A), נצפתה סיווג (איור 3B). בזחלים מסוימים, נטל פטרייתי מחוץ hindbrain נצפתה גם מאוחר יותר בזיהום, עקב הפצה פטרייתית, ככל הנראה מקרופאגים.
האזור סביב שקע האוטי הוא מקום אפשרי אחד שבו ניתן למצוא הפצה זו (איור 3C). תצפיות אלה כומתו במספר זחלים בודדים במהלך הניסוי כולו (איור 4). בדרך כלל, נביטה נראתה בכ-60% מהזחלים ב-5 dpi(איור 4A). אזור אשכול Phagocyte, גיוס מקרופאג', וגיוס נויטרופילים משתנים הן לאורך זמן והן על פני זחלים, עם כמה מגמות לאורך כל הניסוי וכמה פתרון לאורך זמן(איור 4B, C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig01.jpg"> איור 1: ניתוח הישרדות מייצג של זחלים נגועים. זחלים נגועים באספרגילוסנחשפו לבקרת רכב (DMSO) או דקסמתזון (דקס), וההישרדות הייתה במעקב. הנתונים מייצגים שלושה עותקים משוכפלים במאגר. CFUs הזרקה ממוצעת: DMSO = 30, Dex = 29 (ערך p ויחס סיכון חושבו על ידי ניתוח רגרסיה סיכון פרופורציונלי קוקס, ****p &lt; 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2.jpg"> איור 2: ספירת CFU מייצג מזחלים נגועים בודדים מיד לאחר ההזרקה (0 dpi) ובמהלך קורס ההדבקה (2, 3, 5 ו- 7 dpi). שמונה זחלים נגועים היו הומוגניים מצופים לספור CFU עבור כל נקודת זמן ולשכפל. (A) נתונים לדוגמה משכפל אחד. כל נקודה מייצגת זחל אחד, מייצגי פעילויות מייצגים אמצעים עבור כל נקודת זמן. (B) ספירות CFU נורמלו לספירת ה- CFU ב- 0 dpi עבור כל שכפול, ושלושה שכפולים אוגדו. הנתונים הושוו בין תנאים ניסיוניים באמצעות ניתוח שונות וסיכום במונחים של אמצעים שוליים משוערים ושגיאות סטנדרטיות. אסטריקס מייצגים מובהקות סטטיסטית בהשוואה ל- CFU ב- 0 dpi (*p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ****p &lt; 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2.jpg"> איור 3: תמונות מייצגות מניסויי זיהום. זחלים שטופלו ב- PTU עם מקרופאגים פלואורסצנטיים (mpeg1:H2B-GFP) ונויטרופילים (lyz:BFP) הוזרקו עם RFP-מבטא A. fumigatus. זחלים חיים ונגועים צולמו שוב ושוב במיקרוסקופ קונפוקאלי 2, 3 ו-5 dpi. תמונות הקרנה בעוצמה מרבית Z מוצגות. שרטוטים של זחלים מציינים את מיקום ההדמיה עבור כל פאנל. כל סרגלי קנה המידה מייצגים 100 מיקרומטר, למעט סרגלי קנה המידה של הכניסה, שהם 25 מיקרומטר. (A) תמונות המוצגות הן מזחל יחיד שנלקח ב- 2, 3 ו- 5 dpi, המייצג התקדמות זיהום טיפוסית. Insets להראות נביטה פטרייתית בימים 3 ו 5. (B) תמונה מייצגת של תת קבוצה של זחלים שיכולים לנקות את הזיהום, עם נטל פטרייתי נמוך ולא הרבה דלקת ב 5 dpi. (C) תמונה מייצגת של קבוצת משנה של זחלים שבה הזיהום מתפשט מתוך hindbrain בנקודות זמן מאוחרות יותר. בתמונה זו, פטרייה, מקרופאגים ונויטרופילים ניתן למצוא סביב ומתחת לווציקל אוטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2.jpg"> איור 4: כימות מייצג של ניסויי הדמיה. תמונות ממערך ניסיוני באיור 3 נותחו לצורך נביטה פטרייתית וגיוס לויקוציטים. זחליםהובקעו על נוכחותם של נבגים מונבטים בכל יום, ואחוז הזחלים עם הנביטה חושב. (B, C,D) כל זחל בודד מיוצג כקו צבע שונה. המראה והגודל של אשכול Phagocyte (B), גיוס מקרופגים (C) וגיוס נויטרופילים (D) לוו במהלך הניסוי בן 5 הימים עבור כל זחל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר מודל זיהום אספרגילוס בזחלים זברה. נבגי אספרגילוס הם microinjected לתוך hindbrain של זחלים, טיפול כימי משמש כדי לגרום לדיכוי המערכת החיסונית. התקדמות הזיהום מנוטרת באמצעות מערך הדמיה יומי כדי לפקח על צמיחה פטרייתית ותגובות חיסוניות, כמו גם ספירה של נבגים חיים על ידי ציפוי יחידה יוצר מושבה.

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

פרוטוקול זה מדגים מודל זיהום אספרגילוס של דג זברה זחל, שבו אנו יכולים להשתמש כדי לחקור תגובות חיסוניות מולדות לפטרייה זו. היתרון העיקרי של מודל דג הזברה הוא שאנו יכולים לדמיין אינטראקציות של פתוגנים של תאי חיסון והתקדמות זיהום בתוך בעל חיים מארח חי לאורך זיהום רב-יומי. ממצאים ממודל זה עשויים להיות ישימים לגילוי מטרות טיפוליות חדשות לטיפול באספרגילוזיס פולשני בחולים עם מערכת חיסונית חלשה.הזרקת מיקרו של נבגים לזחל דג זברה היא טכניקה קשה הדורשת תרגול ניכר לפני שניתן להשיג תוצאות עקביות וניתנות לשחזור. כדי לבצע מיקרו-הזרקות, השתמש בסט המסופק עם מזרק לחץ, יחידת לחץ ואקום, מתג רגל, מחזיק מיקרופיפטה, מיקרו מניפולטור ומעמד וצלחת מגנטיים. כולם מחוברים למקור אוויר דחוס.פתח את שסתום האוויר הדחוס. והפעל את המיקרו-מזרק. הגדר את הלחץ לכ-25 psi, חיזוק ל-60 אלפיות השנייה ויחידת לחץ הוואק ל-1 psi.השתמש בקצה פיפטה של מיקרו מעמיס כדי להעמיס את מחט המיקרו-הזרקה עם שלושה עד חמישה ליטר מיקרו PBS או תרחיף נבגים עם פנול אדום. לאחר מכן הרכיב את המחט על המיקרומניפולטור. Aspergillus fumigatus הוא פתוגן אופורטוניסטי של בני אדם.קיים סיכון לניקוב העור עם המחט הטעונה. המחט צריכה להיות מחוברת היטב למיקרו-מזרק, והחוקרים צריכים תמיד ללבוש כפפות ולשים לב היטב לתנועות הידיים שלהם סביב המחט כדי למנוע ניקוב. מקם את המיקרומניפולטור כך שקצה המחט ייראה מתחת למיקרוסקופ הסטריאו בהגדלה הנמוכה ביותר.זום להגדלה פי 4, תוך שמירה על המחט בתצוגה. לאחר מכן השתמש במלקחיים חדים כדי לחתוך את קצה המחט. לחץ על דוושת ההזרקה כדי לדמיין את גודל הטיפה.והמשיכו לחתוך את המחט עד שיוצאים כשלושה ננוליטרים של תרחיף נבגים. כשהוא מוכן, הזז את המיקרומניפולטור והמחט מהדרך כדי למנוע פגיעה בטעות במחט תוך כדי סידור הזחלים על צלחת ההזרקה. יוצקים E3 טריקאין מצלחת ההזרקה.והעבירו לצלחת כ-24 זחלים מורדמים בני יומיים עם כמה שפחות E3. לאחר מכן, סדרו את הזחלים לפי הכיוון אליו הם פונים, הניחו את כל הזחלים הפונים ימינה בשורה אחת, וכולם פונים שמאלה בשורה למטה. כאשר המיקרוסקופ מכוון להגדלה הנמוכה ביותר, החזר את המיקרומניפולטור לאחור, כך שהמחט תהיה קרובה לזחלים בזווית של 30-60 מעלות.התקרב להגדלה הגבוהה ביותר. והשתמש בכפתורי כוונון עדינים כדי להתאים עוד יותר את מיקום המחט. הזרקו את תרחיף הנבגים לנוזל שליד הזחלים כדי לוודא ש-30-70 נבגים יוצאים מהמחט.לאחר מכן הזיזו את הצלחת כך שהמחט תהיה ישירות מעל ותמוקם ליד הזחלים הראשונים. החל מהזחלים הפונים לכיוון המחט. הכנס את המחט דרך הרקמה סביב השלפוחית האוטית, ונקב אותה לתוך חדר המוח האחורי, הזז את הצלחת לפי הצורך כדי לקבל את הכיוון הנכון של הזחל.ודא חזותית שקצה המחט נמצא במרכז החדר האחורי. לאחר מכן לחץ על דוושת כף הרגל כדי להזריק נבגים ולמשוך בעדינות את המחט. לאחר הזרקת כל הזחלים בשתי השורות, הזיזו את המחט שוב מהדרך.והגדל להגדלה נמוכה יותר. הצבע האדום של הפנול עדיין אמור להיות גלוי במוח האחורי של כל זחל. השליכו את כל הזחלים בהזרקות לא מוצלחות, והעבירו את הזחלים הנותרים לצלחת פטרי על ידי שטיפתם מהצלחת עם E3 טרי. שטפו את הזחל פעמיים עם E3, וודאו שהוא מתאושש מההרדמה.מיד לאחר ההזרקה, העבירו שמונה מהזחלים לצינורות בודדים של 1.7 מיליליטר והמתת חסד. הכן 1 מ"ל PBS עם אמפיצילין וקנאמיצין. הסר כמה שיותר נוזלים מהצינורות עם הזחלים.לאחר מכן הוסף 90 מיקרוליטר של PBS עם אנטיביוטיקה. הומוגניזציה של הזחלים ב-TissueLyser ב-1800 תנודות לדקה, למשך שש דקות. לאחר מכן, סובב אותם ב-17,000 פעמים G למשך 30 שניות.פיפט את התרחיף ההומוגני מכל צינור לאמצע צלחת GMM מסומנת, ופזר אותו באמצעות מפזר חד פעמי בצורת L. הקפד להימנע מהתפשטות על השפה. דגרו את הצלחות הפוכות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים-שלושה.לאחר מכן, ספרו את מספר המושבות שנוצרו. מחלקים את הזחלים המוזרקים הנותרים לשתי מנות בגודל 3.5 מילימטר. אחד לטיפול תרופתי, ואחד לבקרה.הסר כמה שיותר נוזלים, והוסף E3 עם בקרת הרכב לכלי אחד. ו-ה3 עם הטיפול המעניין את האחר. השתמש בפיפטה כדי להעביר כל זחל לבאר בצלחת של 96 בארות.ולפקח על הישרדותם במשך שבעה ימים. ביום ההדמיה הכינו צלחת פטרי אחת בגודל 3.5 מילימטר עם 100 PTU מיקרומולרית, ואחת עם טריקאין E3. הוסף טריקאין E3 לתאים של מכשיר Z-wedge E והשתמש במיקרופיפטה P100 כדי להסיר בועות אוויר מהתאים ומתעלת הריסון.לאחר מכן הסר את כל עודפי הטריקאין E3 מחוץ לתאים. פיפטה למעלה זחל אחד והעבירו אותו לכלי עם ה- E3 PTU. לאחר מכן העבירו אותו לטריקאין E3, עם כמה שפחות נוזלים.לאחר 30 שניות, העבירו את הזחלים המורדמים לתא הטעינה של מכשיר הפציעה והלכידה. הסר את E3 טריקאין מתא הפציעה, ושחרר אותו לתא הטעינה על מנת להעביר את זנב הזחלים לתעלת ההגבלה. ודא שהזחל ממוקם בצד הרוחבי, הגבי או הגבי שלו כך שניתן יהיה לצלם את המוח האחורי עם עדשה אובייקטיבית הפוכה.לאחר הדמיית הזחל במיקרוסקופ קונפוקלי, שחררו E3 טריקאין לתוך תא הפציעה כדי לדחוף את הזחל מתעלת הריסון לתוך תא ההעמסה. מרימים את הזחל ומעבירים אותו בחזרה לכלי עם טריקאין E3. לאחר מכן העבירו אותו לכלי עם E3 PTU עם כמה שפחות נוזלים.שוטפים אותו ב-PTU ומעבירים אותו בחזרה לצלחת 48 בארות. נבגי אספרגילוס הוזרקו למוח האחורי של זחלי דג הזברה, תוצאת זיהום נוטרה. מעט מאוד מוות נצפה בזחלים מסוג בר, כאשר 80 עד 100% מהזחלים שרדו את כל הניסוי.ירידה משמעותית בהישרדות נצפתה בזחלים מדוכאי חיסון. כאשר כומתו יחידות יוצרות מושבה מזחלי בר נגועים, נצפתה התמדה של נבגים ופינוי איטי לאורך זמן. מספר הנבגים ששרדו יום אחד, יומיים, שלושה, חמישה ושבעה ימים לאחר ההדבקה נורמל למספר הנבגים שהוזרקו, על מנת להשוות התמדה ופינוי בין העתקים.כאשר מקרופאגים סומנו, התקבצות מיקרופאגים בכ-50% מהזחלים נצפתה בדרך כלל החל מיומיים עד שלושה לאחר ההדבקה. גיוס הנויטרופילים התעכב, והתרחש בעיקר לאחר נביטה פטרייתית. בעוד שהעומס הפטרייתי נמשך לאורך כל הניסוי ברוב הזחלים.פינוי נצפה בחלקם חמישה ימים לאחר ההדבקה. בתת-קבוצה אחרת של זחלים, נצפתה התפשטות פטרייתית לאזורים מחוץ למוח האחורי. האזור סביב השלפוחית האוטית הוא אחד המקומות שבהם נמצאה התפשטות זו.נביטה פטרייתית נצפתה בדרך כלל בחמישה ימים ב-60% מהזחלים. אזור אשכול פגוציטים, גיוס מקרופאגים וגיוס נויטרופילים השתנו לאורך זמן בכל הזחלים. כאשר חלקם עולים במהלך הניסוי, ואחרים נפתרים עם הזמן.ניתן לשלב הליך זה עם מניפולציה גנטית של דג הזברה, כגון עם CRISPR, כדי לקבוע את הדרישה למסלולי מארח ספציפיים בתגובה חיסונית מולדת מוצלחת לאספרגילוס. פרוטוקול זה איפשר הדמיה של אינטראקציות מולדות של תאי חיסון אספרגילוס בזמן אמת, במארחים חיים ושלמים.

infection-zebrafish-larvae-with-aspergillus-spores-for-analysis-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

עוברי דג הזברה שקוף הוכיחו המארחים מודל שימושי כדי לחזות אינטראקציות למידה תפקודית בין תאים חיסוניים מולדים פתוגנים חיידקיים תאיים,...

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

ההתפתחות המהירה, גודל קטן השקיפות של דג הזברה הם יתרונות עצומים למחקר שליטה החיסון המולדת של...

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

מקור: Zhang, X. et al., מודל עובר של דג זברה להדמיה In Vivo וניתוח תוך-חיוני של זיהום סטפילוקוקוס זהוב הקשור לביו-חומר. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים מודל עוברי של דג זברה לחקר זיהומים הקשורים לביו-חומרים מושתלים. הזרקת סטפילוקוקוס זהוב עם מיקרוספירות פוליסטירן משפרת את הישרדות החיידקים, ומאשרת את תפקידם של חומרים מושתלים בקידום זיהום.

ניתוח in vivo של זיהומים חיידקיים הקשורים להשתלה באמצעות עוברי דג זברה

מקור: ברנוט, א., ואח', פענוח והדמיה של פתוגנזה ודימות של מיקובקטריום אבססיסוס בעוברי דגי זברה. J. Vis. Exp. (2015).הסרטון הזה מדגים פרוטוקול לבידוד וכימות של Mycobacterium abscessus מעובר דג זברה נגוע. ההליך כולל המתת חסד של עוברים, ניתוק רקמות והומוגניזציה לשחרור החיידקים, ולאחר מכן צנטריפוגה והשעיה מחדש בבופר סורפקטנטים. לבסוף, ההשעיה החיידקית מדוללת באופן סדרתי, מצופה על אגר עם תוספת אנטיביוטיקה, ומודגרת כדי לאפשר יצירת מושבות וכמות.

בידוד וגידול חיידקים מעוברי דגי זברה להערכת עומס זיהום

מקור: ברנוט, א. ואחרים. פענוח והדמיה של פתוגנזה והקורדינג של Mycobacterium abscessus בעוברי דגי זברה. J. Vis. Exp. (2015)הסרטון הזה מדגים פרוטוקול המשתמש בעוברים טרנסגניים של דגי זברה המבטאים מקרופאגים פלואורסצנטיים ונדבקים בזן מחוספס של Mycobacterium abscessus כדי להמחיש אינטראקציות בין מארח לפתוגן. הוא חושף כיצד חבל חוץ-תאי מאפשר התחמקות חיסונית, ומקדם הישרדות חיידקים ונזק לתאי המארח.

הדמיה חיה של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן בעוברי דגי זברה שנדבקו ב-Mycobacterium abscessus

מקור: פלורס, א. ואחרים. שימוש בפרוטוזואן Paramecium caudatum ככלי לזיהומים המועברים במזון בזחלי דגי זברה. J. Vis. Exp. (2019).הסרטון הזה מדגים את השיטה לקביעת מודל זיהום חיידקי במעי המועבר במזון לזחלי דגי זברה על ידי האכלה בפרמסיה הנגועה ב-E. coli פלואורסצנטי.

מידול זיהום במעי בזחלי דגי זברה באמצעות חיידקים המועברים במזון

סרטון זה מדגים שיטה לכימות זיהום פטרייתי בזחלי דגי זברה. נבגי פטריות מוזרקים במיקרו לחדר המוח האחורי של הזחל, והזחלים מודגרים כדי לאפשר התפתחות זיהום. הזחלים הנגועים נקצרים בפרקי זמן מוגדרים, והתקדמות ההדבקה מוערכת על ידי ספירת יחידות יוצרות מושבות.

טכניקה לכימות זיהום פטרייתי בזחלי דגי זברה

הסרטון מדגים טכניקת פציעה ולכידה של דגי זברה לצפייה בזיהום פתוגן פטרייתי המסומן באופן פלואורסצנטי בזחלי דגי זברה. זיהום ראשוני מושך מקרופאגים, וככל שהזיהום נמשך, גיוס נויטרופילים מתקדם באתר ההזרקה.

טכניקת zWEDGI להמחשת זחלי זברה נגועים בפתוגן פטרייתי

עוברי דג זברה שקופים אופטית נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור ולדמיין בזמן אמת את האינטראקציות בין מיקרואורגניזמים פתוגניים לתאי החיסון המולדים. מיקרו-הזרקה של Mycobacterium abscessus, בשילוב עם הדמיה פלואורסצנטית, משמשת לבחינת מאפיינים פתוגניים חיוניים כגון היווצרות חבל בעוברי דג זברה.

פענוח ופתוגנזה הדמיה והשתרגות<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; בעוברי דג הזברה

ב פרוטוקול זה, שכותרתו fluorescently ט cruzi הוזרקו לזחלים דג זברה שקוף, טפיל תנועתיות נצפתה ויוו באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון זריחה.

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

המחקר הנוכחי מתאר מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital לזיהום הקשורים biomaterial לאורך זמן מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. מודל זה היא מערכת מבטיח משלימים מודלים בעלי חיים יונקים כגון עכבר מודלים לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.

מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים Staphylococcus aureus זיהום

למדו מודל זיהום Aspergillus בזחלי דגי זברה לחקירת תגובות חיסון מולדות. שיטת מיקרו-הזרקה לאזור המוח האחורי מאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות תאי חיסון-פתוגן ומסייעת בזיהוי מטרות טיפוליות לדלקת ריאות פולשנית.

זיהום זחלי זברה עם נבגי אספרגילוס לניתוח אינטראקציות מארח-פתוגן

גלה סרטונים נוספים