דוגמנות גיל הקשורים מחלות ניווניות בתוך האלאים
15 באוגוסט 2020
כאן, אנו מציגים ומתארים נרחב נגיש מתודולוגיות ניצול כמה דגמים נמטודות צדדי, כולל היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק וחלבון הנגרמת המושרה נוירורעילות, כדי לפקח ולנתח את בסיס הסלולר והמולקולריים של מחלות ניווניות הקשורים גיל.
בעשורים האחרונים הוארך תוחלת החיים האנושית, בשל שיפור ברמת החיים והתקדמות במדעי הרפואה. גיל הוא גורם הסיכון הגדול ביותר למחלות מסכנות חיים רבות, כולל הפרעות ניווניות, כגון אלצהיימר, פרקינסון ומחלת הנטינגטון. כאן, אנו מדגימים מתודולוגיות המנצלות כמה מודלים של שיטות חדשות ורב-תכליתיות, כולל נמק המושרה על ידי ערוץ יונים היפר-אקטיבי וצבירות חלבונים גורמות לנוירוטוקסיות, לנטר ול לנתח את המנגנון המולקולרי התאי של ניוון עצבי.
שיא זחלים בריאים של לעשות ארבעה ולעשות שלושה nematodes ניוטון על צלחת מדיה צמיחה nematode, חיטוי עם E.Coli באמצעות ניתוח מיקרוסקופ סטריאו. מניחים עשרה וארבעה נמטודות, צלחת אנזימים תפילית ומגדלים אותם בטמפרטורה הסטנדרטית, של 20 מעלות צלזיוס. חמישה ימים לאחר מכן, לשטוף את הצלחת עם 1 מ"ל ו 9 חיץ ולאסוף את בעלי החיים בצינור 1.5mL.
צנטריפוגה ב 30, 000 גרם במשך 30 שניות ולהסיר את העל טבעי. הוסף 0.5 מ"ל של פתרון ציפוי. פתרון ציפוי מאוחסן בטמפרטורת החדר.
מערבולת וניטור מעת לעת עד שכולם יתמוססו. הימנע ציפוי לתקופות יותר מחמש דקות. צנטריפוגה ב 10, 000 גרם במשך 30 שניות ולהסיר את העל טבעי.
לשטוף פעמיים את הצבעים עם 1 מ"ל ותשעה מאגרים. צנטריפוגה ב 10000 גרם במשך 30 שניות ולהסיר את supernatant. לאחר הכביסה, יש להשתמש שוב בביצים ב-200 מיקרוליטרים M9 buffer ולהדיר אותן במשך 25 דקות, ב-34 מעלות צלזיוס באמבט מים.
לשמור על קבוצה נפרדת של ביצים ב 20 מעלות צלזיוס. פיפטה 100 microliters המכיל שליטה או הלם חום ביצים מטופלות ומ מניחים אותם על צלחת GN 10 unseeded. כל צלחת מכילה לפחות 100 עד 200 ביצים.
הדגירה את הביצים ב 20 מעלות צלזיוס עד הבקיעה. השתמש חוצץ M9 לשטוף צלחות ולאסוף L1 חיים nematodes בצינור 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 10, 000 גרם במשך 30 שניות.
הסר את העל-טבעי ושמור על לוח הצבעים. הוסף 100 microliters של 20 מילימולר M9 חיץ levangial כדי להרדום את nematodes. Pipette 10 מיקרוליטרים של חיץ לבנגיאל M9, המכיל שעון L1 ולהרים אותם ב 2%agar-ls מקום בעדינות כיסוי על החלק העליון של המדגם.
שימו לב לשעון באמצעות מיקרוסקופיה DIC. סריקת ניוון של 630 נוירונים קולטן על ידי ספירת תאים עם מראה וירטואלי אופייני בסיוע של nematode זה. לסנכרן nematodes על ידי בחירה והעברת 15 עד 20 זחלים L4 של כל אחד בזן על חיידקים הראשונים C ולאחר מכן צלחות GM.
דגירה ולתת nematodes לגדול בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 מעלות צלזיוס. בצע תנאים מוקדמים יומיים במשך 30 דקות על ידי העברת הצלחות באינקובטור שנקבע על 34 מעלות צלזיוס. ואז להחזיר את nematodes תנאי מוקדם בחזרה בטמפרטורה הסטנדרטית של 20 מעלות צלזיוס.
הוסף 10 microliters של 20 מילימולר M9 חיץ levangial טיפה במרכז הנקודה אגר-ls. בחר את nematodes מהועבר בהתאמה ולהעביר אותם טיפת לבנגיאל M9. מניחים 20 עד 30 נמטודות לכל טיפה.
מניחים בעדינות לכסות להחליק על החלק העליון של המדגם. לאטום את המכסה להחליק עם לק כדי לשמור על לחות לאורך כל תהליך ההדמיה. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשילוב עם מצלמה, לזהות וללכוד את תמונות המחקר שלך של אזור הראש ב 20 x הגדלה.
לפקח על שבעה ימים של נמטודות מהופנטות למוות תאי עצב דופאמין. למדוד את אגרגטים policul עצבי באזור הראש של בעלי חיים מהונעים בני ארבעה ימים המבטאת 240 היתוך עם אנשים חיים. מוות תאי נמק המושרה תעלות יון היפראקטיבי הוא העיקרי nematodes כי יש ביצי תנאי מוקדם הלם חום לשעבר.
הלם חום תנאי מוקדם, קידום תחזית נגד אלפא-synuclein המושרה מוות תאי הרמפרודיט מבוגר בן שבעה ימים ומפחית Q40 אגרגטים חלבון באזור הראש של מבוגרים ארבעה ימים. הזדקנות היא תוצאה של נזק שנגרם על ידי ניוון הדרגתי של הונוסטזיס הסלולר והרקמות. לכן ההבנה של מניפולציה הקשורות לגיל עצבי לשבור הם בראש סדר העדיפויות של המקומות.
הטכניקות שהוצגו בשילוב עם גנטיקה ומסכים תרופתיים יכול להוביל להודעה של אפנונים מוות תאי נורמלי עם עניין טיפולי פוטנציאלי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מתודולוגיות המשתמשות במודלים ורסטיליים של נמטודות לחקירת מחלות נוירודגנרטיביות הקשורות לגיל. הדגש הוא על נמק המושרה על ידי תעלות יונים בהפעלה יתרה ועל נוירוטוקסיות המושרית על ידי אגרגטים של חלבונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- מחלות נוירודגנרטיביות
- ביולוגיה תאית ומולקולרית
רקע
- תוחלת החיים של בני האדם עלתה הודות להתקדמות רפואית.
- גיל הוא גורם סיכון משמעותי להפרעות נוירודגנרטיביות.
- מחלות נוירודגנרטיביות נפוצות כוללות את מחלת אלצהיימר, פרקינסון ומחלת هنتינגטון.
- הבנת המנגנונים התאיים היא קריטית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
מטרת המחקר
- לניטור וניתוח של המנגנונים התאיים של דגנרציה עצבית.
- לשימוש במודלים של נמטודות לחקר נוירו-טוקסיות.
- לבחינת מתודולוגיות שיהיו נגישות באופן רחב לחוקרים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ניצול נמק המושרה על ידי תעלות יונים בהפעלה יתר.
- הערכה של נוירוטוקסיות המושרית על ידי צברי חלבונים.
- שימוש בנמטודות על פלטות מצע גידול.
- איסוף וניתוח של נמטודות לאחר אינקובציה.
תוצאות עיקריות
- המתודולוגיות שהודגמו יעילות לחקר ניוון עצבי.
- סופקו תובנות לגבי הבסיס התאי והמולקולרי של מחלות הקשורות לגיל.
- הודגשה התועלת של מודלים של נמטודות במחקר במדעי העצבים.
- סייע בהבנת מנגנונים נוירוטוקסיים.
מסקנות
- המתודולוגיות המוצגות הן נגישות ורב-גוניות.
- הן יכולות לסייע בחקירת מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על ממצאים אלו כדי לפתח גישות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מידול של מנגנונים ניורודגנרטיביים הקשורים לגיל ב-C. elegans מספק מערכת ניתנת להרחבה וניתנת לטיפול גנטי לצורך תיקוף מוקדם של מטרות והפחתת סיכונים מנגנוניים. גישה זו מאפשרת הערכה כמותית של השלמות העצבית ושל אגרגציה של חלבונים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בזיהוי מולקולות מובילות. פלטפורמה זו, המבוססת על תולעים, מגשרת בין ביולוגיה של גילוי לבין רלוונטיות טרנסלציונלית עבור פרוטינופתיות הקשורות לגיל.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות מידול של מסלולי ניוון עצבי שמורים דרך היפראקטיביות של תעלות יונים ונוירוטוקסיות המושרית על ידי אגרגטים של חלבונים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות סריקות גנטיות ופרמקולוגיות למודולטורים של מוות תאי בהקשר של אורגניזם שלם.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו על ידי קישור הפרעות גנטיות לתוצאות מדידות של הישרדות נוירונלית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מודלים מתוקפים של נמטודות לסריקת תרכובות בהמשך, באמצעות סטנדרטיזציה של אוכלוסיות זחלים בשלב L4 מסונכרנות גיל.
- ערך תפעולי: אספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, כגון ספירה של נוירונים דופמינרגיים ומדידת אגרגטים של פוליגלוטמט באזור הראש.
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה באמצעות משטרי התניה מקדימה מסונכרנים (למשל, הלם חום ב-34°C) ופרוטוקולי דימות סטנדרטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: ממדל התפרקות נוירונלית תלוית גיל שנשמרה מבחינה אבולוציונית, מה שמאפשר אקסטרפולציה למנגנונים של ניוון עצבי בבני אדם.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהירה קשרי סיבתיות בין אגרגציה של חלבונים (למשל, α-synuclein, poly-glutamate) לבין תפקוד נוירונלי לקוי.
- קידום מותאם סיכון: מספק מידע לקבלת החלטות של go/no-go על ידי מדידת הדיכוי של מוות תאי נמקרוטי ושל נטל האגרגטים בחרקים הרמאפרודיטיים בוגרים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה לבדיקת היפותזות ולהערכת תרכובות מובילות לפני תיקוף ביונקים.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בחקירה מכניסטית של ניוון עצבי באמצעות השראה מבוקרת של פנוטיפים נמקרוטיים ורעילים.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקה באמצעות טיפול סטנדרטי בנמטודות, הרדמה בעזרת levamisole, ודימוי DIC/פלואורסצנציה בהגדלה של 20x.
- אנליטיקה: מייצר משתנים תלויים כמותיים, כולל ספירת תאי עצב ועוצמת הצטברות (aggregate intensity), החיוניים למחקרי תגובה למסמנת ואינטראקציות גנטיות.
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול התקדמות של פרוטאונופיה תלוית-גיל על רקע גנטי מוגדר.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת לשימוש חוזר במחקרי ניוון עצבי לאורך זמן (longitudinal) באמצעות זנים קריו-משומרים ופרוטוקולי הזדקנות מסונכרנים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי הפחתת סיכונים הנובעים מעמימות מכניסטית במסלולי דעיכה נוירונלית הקשורה לגיל.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה באמצעות שינויי טמפרטורה מוגדרים, משטרי הזנה חיידקיים וחשיפה מתוזמנת לחומרי הרדמה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור סריקות גנטיות ופרמקולוגיות בתפוקה גבוהה במודל חסרי חולבקרים בעלות נמוכה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי כימות יעילותם של מודולטורים על פנוטיפים של ניוון עצבי לפני השקעה במודלים של יונקים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגידול נמטודות, טיפול בזני גנטיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי באינקובטורים בעלי בקרת טמפרטורה, מיקרוסקופי דיסקציה ומערכות דימוי המסוגלות לבצע DIC ופלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של סנכרון גיל, לוחות זמנים של התניה מוקדמת (preconditioning) ודירוג עיוור של שלמות נוירונלית.
- שיקולי התאמה כוללים את רמת הביטוי הספציפית לזן של מודלים של דגנרציה (למשל, deg-3(d), mec-4(d)) ואת חדירות הטרנסגן.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בתגובה להלם תרמי והצורך להימנע בקפידה מחשיפה ממושכת ללוומיזול (levamisole) (מעל 5 min) כדי למנוע ארטיפקטים של הרדמה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:39
Necrotic Cell Death-induced by Hyperactive Ion Channels
4:06
Protein Aggregate-induced Neurodegeneration
5:58
Representative Results: Monitor Necrotic Cell Death-Induced by Hyperactive Ion Channels and Protein Aggregate-induced Neurodegeneration
6:30
Conclusion
