Name: היממה של דרוסופילה מלנוגסטר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: למדו לסנכרן Drosophila melanogaster למחקר קצבים ביולוגיים וכרונוביולוגיה באמצעות שיטות סינכרון ניסיוניות. שיטה זו מאפשרת הערכה אמינה של התנהגויות מחזוריות ומספקת בסיס לחקירת השפעות השעון הביולוגי על תהליכים פיזיולוגיים ומחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

תודה מיוחדת לאוניברסיטת מיזורי-קנזס סיטי ומעבדת ג'פרי ל. פרייס.

1. פליי ייצור מזון
<ol><li>לכל 1 L של מים, להכין מזון זבובים המורכב 4.69 גרם של מולסה מיובשת, 19.70 גרם של שמרים פעילים יבשים, 87.22 גרם של ארוחת תירס ו 7.83 גרם אגר.</li>
	<li>שלבו את התוכן המפורט לעיל ב- crockpot והפכו את החום ל- 250°F. מערבבים היטב את המרכיבים.</li>
	<li>יש לשמור את המכסה על התערה בזמן שהמזון המעופף מתחמם תוך כדי ערבוב התוכן כל 10 דקות עד שהוא מגיע לרתיחה מתגלגלת. מניחים לרתיחה המתגלגלת להימשך 20 דקות לפני כיבוי החום.</li>
	<li>מוסיפים 83.60 מ"ל מים ושמור על מכסה התרגרות כשהמזון מתקרר.</li>
	<li>מערבבים ומתוקלטים את טמפרטורת המזון כל 10 דקות עם מדחום זכוכית. הימנעו מלתת לשכבת פילם להתיישב על גבי האוכל.</li>
	<li>לאחר שהמזון התקרר ל-60°C, הוסף 10.44 מ"ל של Tegosept ו-5.51 מ"ל של חומצה פרופיונית לליטר מים (ראה שלב 1.1).</li>
	<li>מערבבים היטב והופכים את החום ל-60 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהמזון להיות קריר מדי.</li>
	<li>לשאוב את מזון לטוס לפי הצורך באמצעות מילוי Droso.</li>
	<li>עבור בקבוקונים צרים, משאבה 10 מ"ל עבור 6 oz בקבוקים תחתית ריבוע משאבה 60 מ"ל.</li>
</ol>2. איסוף זבובים בגיל מוגדר
<ol><li>צג בקבוקים מסוג בר זבובים מאוחסנים ב 25 ° C במשך 5-7 ימים עד כמויות גדולות של גלם (כ 200 גופה) מחוברים לצד של הבקבוק. הבקבוקים המשמשים הם 6 oz בקבוקי מלאי Drosophila עם תחתית מרובעת.</li>
	<li>נקה מבוגרים קיימים מהבקבוק. או להטות את המבוגרים לבקבוק חדש או למקם אותם ב-70% אתנול. השתמש בקצה המשעמם של #0 צבע כדי לדחוף את כל המבוגרים הנותרים לתוך האוכל לטוס. הקפד לנגב את מברשת הצבע עם 70% אתנול לפני ואחרי שימושים.</li>
	<li>אפשרו לבקבוקים נקיים לשבת במשך 3 ימים באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לדור הבא להתקלקל. זבובים אלה יהיו בני 0 עד 3 ימים.</li>
</ol>3. הפרדת זבובים
<ol><li>לאחר 3 ימים, להפריד זכרים מן הנקבות ולאסוף את המספר הרצוי עבור כל מין עבור כל אחת מארבע נקודות הזמן. זבובים יכולים להיות מבדילים על ידי מין על ידי בדיקת איברי מין; לזכרים יש איברי מין מעוגלים כהים ואילו לנקבות יש איברי מין בהירים ומחודדים יותר. הנקבות גם הרבה יותר גדולות מזבובים זכרים.<ol>
<li>השתמש כרית הרדמה CO2 כדי להפריד ביעילות את הזבובים ולהבדיל בין המינים. להזיז את הזבובים עם מברשות צבע כדי למנוע להרוג אותם.</li>
		<li>לאסוף 100 זכרים ו 100 נקבות עבור כל נקודת זמן, עם 50 זכרים לכל בקבוקון ו 100 נקבות לכל בקבוקון. זכרים נוטים להיות אגרסיביים יותר והאינטראקציות החברתיות שלהם להוביל הרבה מקרי מוות כאשר יש 100 אנשים במבעון. הנקבות, עד 100 אנשים, אינן מושפעות בזמן שהן נמצאות במבעון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בצע את האוספים בנקודות הזמן הבאות: ZT1, ZT7, ZT13 ו- ZT19 (טבלה 1). שים לב כי אוספים המנוונים בחושך (ZT12-ZT24) רגישים לאור ואילו אוספי ZT0-ZT11 נעשים בשעות תאורה ואורות החדר עשויים להיות דולקים. אנא שימו לב כי שתי אינקובטורים נפרדים משמשים עם דפוסי אור הפוכים של 12 שעות כדי לאפשר לכל האוספים להתרחש במהלך היום ולא בלילה.</li>
	<li>השתמשו בזבובים עודפים כדי ליצור בקבוקי זבובים חדשים לאמוניה עתידית. מניחים 25 נקבות עם 5-7 זכרים בכל בקבוק חדש וממקמים באינקובטור ב-25°C.</li>
</ol>4. דגירה זבובים
<ol><li>לאפשר לזבובים להישאר באינקובטורים מוסדרים אור במשך 3-5 ימים כדי לאפשר את ההמולה היממה להתרחש. ודא כי האינקובטורים הם אור הדוק כי אפילו כמויות קטנות של זיהום אור יפריעו לאמוניה.</li>
</ol>5. קיבעון אימונו-השפלה
<ol><li>לאחר אימון, להכין בקבוקונים חדשים של פתרון קיבעון עבור דגימות שישמשו עבור immunofluorescence. לפני הסרת הזבובים מהאינקובטור, להוסיף 4.8 מ"ל של 4% פורמלדהיד מדולל 1x PBS + 0.1% Tween-20 לכל בקבוקון צר חדש עבור כל 100 זבובים כי הם להיות מקובע. כל בקבוקון יכן 100 זבובים זכרים או 100 נקבות היממה. מניחים את הבקבוקונים הצרים בקרח.</li>
</ol>6. אוסף אימונולוסיות
<ol><li>בעת איסוף הזבובים מהאינקובטור לצורך אימונופלואורסצנטי, הסירו את פקק הבקבוק והפכו במהירות את הבקבוק למשפך. תקיש בעדינות את הזבובים לתוך התמיסה דרך המשפך כדי לעזור להנחות את הזבובים לתוך הבקבוקון; לשלב שני צינורות של 50 זכרים עבור סך של 100 זכרים במבחנה אחת ולהשתמש בצינור יחיד של 100 נקבות עבור הבקבוקון השני.</li>
	<li>בצע אוספי ZT13 ו- ZT19 בחושך; השתמשו באור אדום כדי לראות כמו drosophila הם הרבה פחות רגיש לאורכי גל אור אלה ולכן נוטים פחות זיהום אור13. חלבון קריפטוכרום, בפרט, רגיש במיוחד לאור כחול, אשר יש להימנע14.<ol>
<li>כדי להפחית את החשיפה לאור, ודא שחדר האיסוף יהיה בהיר עם מקורות אור חסונים או מכוסים. עטו בקבוקונים אלה בנייר כסף כך שזבובי ZT13 ו-ZT19 לא ייחשפו לאור כאשר הם מונחים על מערבל האגוזים בשלב הבא. זבובי ZT1 ו-ZT7 אינם רגישים לאור ותוכלים למצוא ם על המיקסר ללא כיסוי נייר כסף.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. מערבל ואחסון Nutating
<ol><li>לאחר איסוף הזבובים, הדביקו את החלק העליון של הבקבוקונים המכילים קיבעון כדי למנוע שפיכה והניחו אותם על מערבל האגוזים ב-165 סל"ד ב-4°C למשך 4 שעות. הזבובים כבר אינם רגישים לאור לאחר שלב קיבעון זה, כך שנייר הכסף עשוי להיות מוסר כדי לוודא שהפתרון זז וזבובים שקועים במתקן.</li>
	<li>לאחר הסרת הזבוב המכיל בקבוקונים מערבל אגוז להסיר את הפורמלדהיד ולשטוף שלוש פעמים עם 3,000 μL של 1x PBS, היפוך הבקבוקון עם כל שטיפה.</li>
	<li>אחסן את הבקבוקונים הנושאים דגימות אימונו-לורה ב-4°C כדי להמתיןל-15 מעלות.</li>
</ol>8. איסוף להפקת חלבונים
<ol><li>הכן ארבעה צינורות 50 מ"ל וDewar המכיל חנקן נוזלי לשימור דגימות להפקת חלבון</li>
	<li>לאיסוף זבובים להפקת חלבון או חומצה נוקלית, להעביר זבובים מהבקבוקים לצינור באותו אופן כמו בשלב 6.1 במהירות לכסות את הצינור כדי למנוע את שחרורו של זבובים ולמקם את הצינור לתוך חנקן נוזלי כדי להקפיא הצמד.</li>
</ol>9. אחסון להפקת חלבונים
<ol><li>לאחסן דגימות קפואות להפקת חלבונים ב-80°C. אלה יכולים להיות מעובדים על פי פרוטוקול הפקת חלבון המתאים לניתוח במורד הזרם, כולל immunoblotting16.</li>
</ol>

<ol><li>Halberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+physiological+and+clinical+aspects+of+24-hour+periodicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal-Lancet%22%5BJournal%5D)">Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity.</a> The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).</li>
<li>Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+to+remember%3A+the+role+of+circadian+clocks+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory.</a> Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).</li>
<li>Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+circadian+rhythms+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases.</a> The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).</li>
<li>Hood, S., Amir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+the+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and the Circadian Clock.</a> Frontiers in aging Neuroscience. 9, 170(2017).</li>
<li>Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Circadian+Clock+and+Cancer%3A+New+Frontiers+for+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment.</a> Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).</li>
<li>Zehring, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-element+transformation+with+period+locus+DNA+restores+rhythmicity+to+mutant%2C+arrhythmic+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster.</a> Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).</li>
<li>Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+circadian+behavioural+rhythms+by+gene+transfer+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila.</a> Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).</li>
<li>Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+period+gene+product+of+Drosophila+reveal+diverse+tissue+distribution+and+rhythmic+changes+in+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system.</a> Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).</li>
<li>Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+of+the+Drosophila+period+gene+product+on+circadian+cycling+of+its+messenger+RNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels.</a> Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+period+gene+encodes+a+predominantly+nuclear+protein+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).</li>
<li>Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+in+nuclear+localization+of+period+protein+by+a+second+clock+mutation%2C+timeless%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless.</a> Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).</li>
<li>Price, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((double-time+is+a+novel+Drosophila+clock+gene+that+regulates+period+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation.</a> Cell. 94 (1), 83-95 (1998).</li>
<li>Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+entrainment+to+red+light+in+Drosophila%3A+requirement+of+Rhodopsin+1+and+Rhodopsin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6.</a> Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).</li>
<li>Vinayak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exquisite+light+sensitivity+of+Drosophila+melanogaster+cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome.</a> PLoS Genetics. 9 (7), e1003615(2013).</li>
<li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Immunofluorescent+Staining+of+Mushroom+Body+and+Photoreceptor+Neurons+in+Adult+Drosophila+melanogaster+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56174(2017).</li>
<li>Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+the+Drosophila+circadian+clock%3A+more+heat+than+light%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+signal+Transduction+Knowledge+Environment%22%5BJournal%5D)">Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light.</a> Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65(2007).</li>
<li>Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separate+sets+of+cerebral+clock+neurons+are+responsible+for+light+and+temperature+entrainment+of+Drosophila+circadian+locomotor+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).</li>
<li>Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+phosphorylation+of+the+Drosophila+period+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).</li>
<li>Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroarchitecture+of+the+circadian+clock+in+the+brain+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster.</a> Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).</li>
<li>Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+for+clock+mutants+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genetic screens for clock mutants in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).</li>
</ol>

החוקרים משתמשים בפרוטוקול תדרם זה עם הצלחה ועקביות. הליך זה מאפשר קיבעון של מאגר דגימה גדול שניתן לאחסן לניתוח עתידי. בנוסף, אסטרטגיה זו משמרת את הדפוסים הנוירולוגיים המושרים על ידי תחומים לבדיקה עתידית.
קיבעון לאחסון הוא מרכיב מרכזי של תהליך ההתעקמה כפי שהוא עוזר לייצב את רקמת המוח וזה מאפשר יותר זמן לנתח כל מוח ממאגר הנתונים ובכך למזער פסולת ממוח שמאבדים את הכדאיותבשל גיל 21. המטרה העיקרית היא להסית כמה שיותר זבובים, כך שיש מלאי רציף זמין עבור דיסטוריראש ובסופו של דבר immunofluorescence או חלבון מיצוי כדי לבחון את הממצאים ולקבוע אם התוצאות הן של ביטחון גבוה. כדי להבטיח כי ההמולה היממה נשמרת באמצעות קיבעון, זה חלק בלתי נפרד כי כל מקור של זיהום אור מחוסל. תהליך קיבעון מאפשר Drosophila להיות מאוחסן תוך שמירה על "מכתם הזמן" הנוירולוגי שלה, כך שהם יכולים להיות לנתח מאוחר יותר וניתח ללא הבדלים מורגש זבובים כי הם נותחו ועברו אימון מאולפת מיד לאחר entraination. למטרות קיבעון לפני אימונו-לודרשות, המעבדה קבעה בעקביות כי זבובים הם קיימא לפחות עד חודש אחד. קיבעון עבור הפקת חלבון כתם המערבי להפוך את המוח קיימא ללא הגבלת זמן כאשר מאוחסנים ב -80 ° C.
צעד קריטי נוסף הוא סקסינג של הזבובים. חשוב כי צעד זה נעשה במדויק כמו שיש שני המינים באותו בקבוקון לפני קיבעון יכול להוביל הזדווגות, אשר יניב זבובים חדשים כי הם בגיל צעיר ניתוח חלבון מושחת אם זכרים נבדקים בטעות במקום נקבות או להיפך. בנוסף, כאשר sexing חשוב להסיר דגימות זחלים כי הם לפעמים מחוברים לנקבות. זה מונע את התפתחותו של צוויה חדשה בתוך הבקבוקון הנשי שעלול להשחית תוצאות.
השלב הבא עבור פרוטוקול ההתעוות עשוי להיות עם פריטים הקשורים לניתוח נתונים. המוקד של הפרוטוקול הוא ליקוטליזציה של חלבון, אבל אם יש משתנים אחרים מושפעים על ידי הכשרה היממה, הם חייבים להיחקר דרך שדרות חדשות, לעתים קרובות הדורשים חלבון או שאיבת חומצה גרעין. בנוסף, ישנם חלבונים אחרים של המוח כי עדיין ניתן לנתח באמצעות פרוטוקול זה. הניסויים הקשורים בפרוטוקול ניתחו חלבונים מסוימים, אך רשימת הגנים והחלבונים המותחים תפקיד בביולוגיה היממה לא מיצתה את מצבם. הפרוטוקול יעיל בהשגת המטרה של הקמת שעון ביולוגי, עם זאת, היישומים הם רחבים.

כמעט לכל האורגניזמים על פני כדור הארץ, מהגדול ביותר ועד לתא יחיד, יש שעון ביולוגי פנימי עם מחזור של יום אחד. זה ידוע בשם השעון הביולוגי (טבע בשנת 1953 על ידי פרנץ Halberg מן המונחים הלטיניים circa = על / בערך ו "מת" = יום)1. למרות שמרכיבים של שעון הליבה ידועים ומנגנוני התפקוד הבסיסיים שלהם מושגים, עדיין יש הרבה מה להבין על איך מקצבים ביולוגיים נשמרים בכל הגוף. חשוב לציין, רגולציה שגויה של מקצבים ביולוגיים קשורה לתוצאות בריאותיות גרועות כולל היווצרות זיכרון לקוי, הפרעות שינה, הפרעה השפעה עונתית, דיכאון, הפרעה דו קוטבית, סוכרת, השמנת יתר, ניוון עצבי,וסרטן 2,,3,,4,5.
Drosophila הוא מודל מבוסס היטב לחקירה של הביולוגיה היממה. ניתן להסבת גנטית וביוכימית, מספרים גדולים מאומנים בקלות (כפי שיהיה מוצג). למעשה, כל שבעת הפרסומים שצוטטו כפרסומים מרכזיים של תמיכה בהענקת פרס נובל לגילוי מקצבים ביולוגיים מינפו את החוזקות הללו שלדרוסופילה מודל 6,,7,,8,,9,,10,,11,,12.
בנוסף, אנו מציגים אסטרטגיות יעילות לאיסוף זבובים מאולפים למטרות של אימון מלוד, חומצה גרעין, או ניתוח מבוסס מיצוי חלבונים. באמצעות אסטרטגיות אלה, ניתן לעבד ולאחסן כמויות גדולות יותר של דגימות לניתוח בעתיד. שיטות אלה הן יתרון מאוד בכך שהם לשחזור יכול להניב מאות זבובים מיומנים שיכולים להיות חלק מ מאגר נתונים גדול.

<table><tbody><tr><td>100-1000uL פיפטה</td><td>Eppendorf</td><td>ES-1000</td><td></td></tr><tr><td>10-100uL פיפטה</td><td>Eppendorf</td><td>ES-100</td><td></td></tr><tr><td>16% תמיסת פרפורמלדהיד</td><td>15710</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL01-6X100ML</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1423500</td><td></td></tr><tr><td>ערכת חיבור מסנן הרדמה</td><td>בעולם Precision Instruments</td><td>EZ-251A</td><td></td></tr><tr><td>קמח תירס</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-100</td><td></td></tr><tr><td>מולסה מיובשת</td><td>שירות מזון ישיר</td><td>OT280504</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזון מילוי דרוסו-geneseesci.com</td><td></td><td>59-169</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי מלאי דרוזופילה, 6 אונקיות תחתית מרובעת עם זיזים</td><td>geneseesci.com</td> בקבוקוני דרוזופילה <td>32-130BF</td><td></td></tr><tr><td>, שרף K צר סופר בתפזורת</td><td></td><td>geneseesci.com 32-118SB</td><td></td></tr><tr><td>שמרים פעילים יבשים</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15720</td><td></td></tr><tr><td>EZ מערכת הרדמה בסיסית</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>EZ-175</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה פלקון</td><td>קורנינג</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>פלקון צינורות תחתונים עגולים</td><td>קורנינג</td><td></td><td></td>352057</tr><tr><td>סמן שארפי נקודה עדינה Sharpie</td><td></td><td>30001</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Nutating Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני פלסטיק צרים</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>מדחום זכוכית</td><td>קול-פאלמר</td><td>EW-08008-12</td><td></td></tr><tr><td>צינור חנקן נוזלי</td><td>Thermo Scientific</td><td>398202</td><td></td></tr><tr><td>מיכל חנקן נוזלי-Dewar</td><td>Cooper Surgical Inc</td><td>900109-1</td><td></td></tr><tr><td>כלי העברת חנקן נוזלי</td><td>Electron Mircoscopy Sciences</td><td>61891-02</td><td></td></tr><tr><td>מברשות צבע (סייבל אדום) גודל #0</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרו</td><td>66100-00</td><td>זה משמש להפרדת הזבובים באמצעות יחסי מין מבלי לגרום לפציעה.</td></tr><tr><td>משפך פלסטיק</td><td>Plews ואדלמן</td><td>570-75-062</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור מקטב</td><td>מיקרוסקופ מרכזי</td><td>1100100402241</td><td>משמש לצפייה ברורה יותר בדרוזופילה במהלך יחסי מין</td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה ProPette MTC</td><td>Bio Incorporated</td><td>P5200-100U</td><td></td></tr><tr><td>ProPette טיפים לפיפטה</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-1M</td><td></td></tr><tr><td>ProPette טיפים לפיפטה</td><td>MTC Bio Incorporated</td><td>P5200-5M</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פרופיונית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P1386-1L</td><td></td></tr><tr><td>כדורי זהורית</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-100</td><td></td></tr><tr><td>ריינולדס לעטוף רדיד אלומיניום סטנדרטי</td><td>סיכות</td><td>1381273</td><td></td></tr><tr><td>תנור צלייה (Crockpot)</td> <td>המילטון ביץ'</td><td>32950</td><td></td></tr><tr><td>סקוטש 810 קלטת קסם</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>77300</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק ריסוס עם הדק</td><td>פלסטיק ארה"ב</td><td>66446</td><td>משמש לריסוס אתנול לניקוי אזורי כיפוף עבודה</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Drosophila Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3990FL</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Revco מקרר מעבדה 4 מעלות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>REL7504D</td><td></td></tr><tr><td>מקפיא מעבדה Thermo Scientific Revco</td><td>REL7504A</td><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Anatrace</td><td>T1003-1-GA</td><td></td></tr></tbody></table>

היממה של דרוסופילה מלנוגסטר

Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

כמעט אוניברסלי בין אורגניזמים, מקצבים ביולוגיים לתאם פעילות ביולוגית למסלול של כדור הארץ סביב השמש. כדי לזהות גורמים היוצרים קצב זה ולהבין את הפלטים המתווצרים, נדרשת צורך בהתענות של אורגניזמים מודלים לנקודות זמן ביולוגיות מוגדרות. כאן אנו מפרטים הליך להדרך Drosophila רבים לקצב היממה מוגדר. יתר על כן, אנו מפרטים שלבים לאחר ההתעמלות כדי להכין דגימות עבור immunofluorescence, חומצה גרעין, או ניתוח מבוסס מיצוי חלבון.

אימונים ביולוגיים מבוקרים מאפשרים לחוקרים לבחון ביולוגיה בנקודות זמן ספציפיות במהלך היום הביולוגי באמצעות לוחות הזמנים של התזמון ZT1-ZT19 או להוסיף נקודות זמן במידת הצורך. כאן אנו משתמשים באור וחושך כדי להעיר זבובים למחזורים היממה ולאמת את ההתעוות על ידי ניתוח אימונופולוטס וחיסונים של החלבון התקופתי, סמן להמולה ביולוגית(איור 1). עם ההתגייסות הנכונה, חלבונים תקופתיים צריכים להיות בעלי עוצמהוניידות אופייניים (איור 1א')ויש לראותם במקומות ספציפיים במוח ZT1(איור 1ב'). למרות משתנים אחרים, כולל מזון וטמפרטורה, יכולים להשפיע על ההמולה היממה, האור הוא הפשוט ביותר ואמין לשלוט17. לצורך שיטות אלה, טמפרטורות האינקובטור נשמרות קבועות, תוך הסתמכות על תאי עצב של שעון מוחי המושפעים על ידי אור לארופה18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61176/61176fig1.jpg"> איור 1: אימות של תמלילת. (א)Immunoblotting של תמציות תאים שלמים שהוכנו מראשי זבובים מיומנים מראה דפוסים כנוניים של ניידות חלבון תקופתית ועוצמה19. 1.4 ראשים נשיים מכל אחד מהזמני Zeitgeber המצוינים (ZT) נותחו באמצעות נוגדן נגד פר. (ב)אימונופלואורסצנציה של מוחות מיומנים שנאספו ב ZT, שם חלבון תקופתי נמצא בתבנית אופיינית (לוחות תחתונים, מחדש מן הלפריץ'-פורסטר20). מוצגות תמונות שצולמו מחלקים שונים של המוח, לכידת כל הנוירונים צפוי להכיל חלבון תקופה ב ZT1. סרגל קנה מידה הוא 40 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61176/61176fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ZT1 (1)</td>
			<td>ZT7 (119)</td>
			<td>ZT13 (13)</td>
			<td>ZT19 (19)</td>
		</tr>
<tr>
<td>אור בין השעות 10:00-22:00</td>
			<td>אור בין השעות 10:00-22:00</td>
			<td>חושך בין השעות 09:00-21:00</td>
			<td>חושך בין השעות 09:00-21:00</td>
		</tr>
<tr>
<td>נאסף בשעה 11:00 לאחר שעה אחת באור</td>
			<td>נאסף בשעה 17:00 לאחר 7 שעות באור</td>
			<td>נאסף בשעה 10:00 לאחר שעה בחושך</td>
			<td>נאסף בשעה 16:00 לאחר 7 שעות בחושך</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: ZT1-ZT19 לוחות זמנים לתזמון שעון ביולוגי.

כאן, אנו מפרטים כיצד לסנכרן את דרוסופילה ליום ביולוגי. זהו הצעד הראשון והחשוב ביותר הנחוץ ללימוד מקצבים ביולוגיים ותרונוביולוגיה.

Nearly universal among organisms, circadian rhythms coordinate biological activity to earth&#39;s orbit around the sun. To identify factors creating this ...

סנכרון דרוסופילה כדי להגדיר את הזמנים הביולוגיים הוא הצעד הראשון בחקר אירועים ששולטים או מגיבים לשעון הביולוגי. סנכרון של כל הדגמים יעקוב אחר אותה גישה בסיסית. ישנם צעדים רבים לעשות את זה מעשי וזה אולי נראה מכריע לשים את כולם יחד.צפו לנסות כמה פעמים לפני שזה מרגיש טבעי. שמור על טמפרטורות יציבות ואני רוצה את האור החוצה במהלך שלושת הצעדים שלוש דקות. מכינים את מזון הזבובים בסיר קרוק ב 121 מעלות צלזיוס, ערבוב כמו החומרים מתווספים.מכסים את קרוק-פוט ומביאים את התוכן לרתיחה מתגלגלת, מערבבים את התוכן כל 10 דקות. לאחר 20 דקות ברתיחה מתגלגלת, לכבות את החום, ולהוסיף 83.6 מיליליטר של מים כדי Crock-Pot. השאירו את המכסה כבוי כשהאוכל מתקרר.בזמן שהאוכל מתקרר, מערבבים אותו כל 10 דקות כדי להימנע מלאפשר לסרט להיווצר בחלק העליון. כמו כן למדוד את הטמפרטורה כל 10 דקות עם מדחום זכוכית. לאחר שהאוכל התקרר אל מתחת ל-60 מעלות צלזיוס, הוסיפו טגוספט וחומצה פרופיונית, כמתואר בכתב היד.מערבבים היטב ומתאימים את קרוק-פוט כדי לשמור על טמפרטורה, רק כמה מעלות פחות מ 60 מעלות צלזיוס. השתמש במשאבה פריסטואלית כדי להפיץ את מזון הזבובים. עבור בקבוקונים צרים, לשאוב 10 מיליליטר, ועל שישה בקבוקים תחתונים מרובעים גרם, משאבה 60 מיליליטר.לאחסן זבובים מסוג בר ב 25 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 12 ימים, עד כ 200 גלמים מחוברים החלק הפנימי של הבקבוק. כדי להסיר את המבוגרים מהבקבוק, להטות אותם לתוך בקבוק חדש, ולהשתמש בקצה המשעמם של מספר אפס מכחול כדי לדחוף את כל המבוגרים הנותרים פנימה מנגבים את מברשת הצבע עם 70% אתנול לפני ואחרי השימוש.דגירה הגלמים ב 25 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לדור הבא לצאת. לאחר שלושה ימים, הזבובים יהיו בני אפס עד שלושה ימים. זכור כי טמפרטורה, אור, ואפילו הבחירה שלך של מזון ישפיע על entrainment.הקפד לשמור אותם, כל שליטה במהלך הניסוי שלך. בנקודות הזמן המיועדות לאיסוף, השתמש כרית הרדמה פחמן דו חמצני כדי לשתק את הזבובים, ולאסוף 100 זכרים ו -100 נקבות. זבובים נקביים הרבה יותר גדולים מהזכרים.הזבובים יכולים להיות מובחנים גם על ידי בחינת איברי המין. לזכרים יש איברי מין מעוגלים כהים, בעוד שלנקבות יש איברי מין בהירים ומחודדים יותר. מניחים זכרים ונקבות בבקבוקונים נפרדים עם 100 נקבות לבקבוקון ו-50 זכרים לבקבוקון.אינטראקציות חברתיות גבריות מובילות למקרי מוות רבים כאשר ישנם 100 אנשים בבקבוקון. כדי לאפשר את התרחשות המנה הביולוגית, מניחים את הבקבוקונים באינקובטורים מוסדרים לאור למשך שלושה עד חמישה ימים. כדי לייצר זבובים לכניסה עתידית, מקום 25 של הנקבות הנותרות, וחמישה עד שבעה מהזכרים הנותרים בבקבוק חדש.דגירה הבקבוק ב 25 מעלות צלזיוס. על כל 100 זבובים שייאספו. הכן בקבוקון צר על-ידי הוספת 4.8 מיליליטר של תיקון.מניחים את הבקבוקונים הצרים בדלי קרח, ולקחת את הדלי, מגבות נייר, נייר כסף, וקלטת לאנקובטור. כדי לאסוף את הזבובים, מניחים משפך בבקבוקון הצר, ולאחר מכן להסיר את הכובע מן הבקבוקון של זבובים במהירות להפוך אותו לתוך המשפך. הקישו בעדינות כדי להנחות את הזבובים לתוך בקבוקון התיקון.בעת איסוף זכרים, לשלב שני בקבוקונים של 50 זבובים לתוך בקבוקון צר אחד. עוטפים את הבקבוקונים עבור ZT13 ו- ZT19 בנייר כסף. לאחר העברת הזבובים, מדביקים את הכובעים במקום כדי למנוע שפיכה.מניחים את הבקבוקונים על מערבל אגוזים ב 165 סל"ד, וארבע מעלות צלזיוס, במשך ארבע שעות. הזבובים כבר אינם רגישים לאור, ולכן, ניתן להסיר את רדיד הכסף כדי לוודא שהזבובים שקועים בתיקון. לאחר הסרת הבקבוקונים מן מערבל Nutating, להסיר את פורמלדהיד, ולאחר מכן לשטוף את הזבובים שלוש פעמים עם 3000 microliters של 1X PBS, היפוך הבקבוקון במהלך כל לשטוף.אחסן את הבקבוקונים בארבע מעלות צלזיוס, כדי לחכות לשפעת חיסונית עתידית. אור וחושך שימשו להלכדת זבובים למחזורים הביולוגיים. המנה אומתה על ידי immunoblotting, וניתוח immunofluorescence של חלבון התקופה, סמן עבור מנה ביולוגית.Immunoblotting של תמציות תאים שלמים, מוכן מראשים של זבובים entrained מראה דפוס קנוני של ניידות חלבון תקופתי ועוצמה. שפעת חיסונית של מוחות מואצים, שנאספו ב- ZT1, מראה חלבונים תקופתיים בתבנית אופיינית. שיטה זו היא נקודת זינוק עבור immunofluorescent, immunoplotting, immunoprecipitation, ניתוח התנהגותי, וכל טכניקה אחרת ייתכן שתרצה להשתמש כדי להשוות כיצד המסלול משתנה כמו השעון הביולוגי מתקתק.עם היכולת ללכוד את האורגניזם מודל שלך, אתה יכול לשאול אם המסלול האהוב עליך משתנה לאורך זמן, והאם ההשפעות במסלול האהוב עליך יכול להוביל לשיבוש של הביולוגי. מספר מחלות מחמירות כאשר השעון הביולוגי משובש. זיהוי המנגנונים הבסיסיים יעזור לנו ליצור תרופות יעילות יותר עבור אנשים הסובלים ממחלות, כגון אלצהיימר ומחלת פרקינסון.

circadian-entrainment-of-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים נוהלי רישום פעילות של תנועה יומי של...

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית</em

סרטון וידאו זה מתאר את מערכת ניטור פעילות דרוזופילה (DAM) המשמשת למעקב אחר פעילות לוקומוטורית. חוקרים משתמשים בנתוני פעילות שנאספו מה-DAM כדי לחקור את השעון הביולוגי בזבובי פירות. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לטעון זבובים במכשיר ולתעד נתוני פעילות עבור ניסויים צירקדיים.

דרוזופילה מוניטור פעילות (DAM): שיטה למדידת פעילות מוטורית בזבובים

כאן אנו מתארים מבחן העדפת אור בחושך לזחל דרוזופילה. assay זה מספק מידע על רגולציה מולדת ויממה של photobehavior חישה ועיבוד אור.

Assay העדפות אור לחקר Photobehavior מוסדר מולדת ויממה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

דרוזופילה התפתחה כמערכת מודל משמעותית עבור לנתח את הבסיס התאי ומולקולרית של תגובות התנהגותיות לאלכוהול. כאן אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף נתונים רגישות אלכוהול בהקשר היממה שיכולה להיות מיושם בקלות לניסויים אחרים, והוא מתאים היטב למחקר לתואר ראשון.

FlyBar: מתן אלכוהול לזבובים

לאחרונה זיהינו תפוקה צירקדית Drosophila הרומן, קצב העדפת טמפרטורה (TPR), שבו הטמפרטורה המועדפת זבובים עולה במהלך היום ויורד במהלך הלילה. TPR מוסדר באופן עצמאי מתפוקה צירקדית אחרת, פעילות לוקומוטורית. כאן אנו מתארים את העיצוב והניתוח של TPR בדרוסופילה.

עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה בדרוסופילה

דוח זה מתאר שיטה למדידת פעילות הזחלים של דרוזופילה באמצעות מוניטור פעילות הדרוזופילה TriKinetics. המכשיר משתמש בקרני אינפרא אדום כדי לזהות תנועות של עד 16 בעלי חיים בודדים. ניתן לנתח נתונים כדי לייצג פרמטרי תנועה כולל קצבים ומיקומי בעלי החיים בתוך תאי הבדיקה.

מדידה של הזחל פעילות ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; צג פעילות

ניתן לכמת את השפעת הגנים והסביבה על המרחב החברתי של Drosophila melanogaster באמצעות פרדיגמה אנליטית רבת עוצמה אך ישירה. אנו מראים כאן גורמים שונים שיכולים להשפיע על המרחב החברתי הזה, ולכן יש לקחת אותם בחשבון בעת תכנון ניסויים בפרדיגמה זו.

תנאים המשפיעים על המרחב חברתי ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

שיטה לכמת את התכונות העיקריות טמפורלית ראיתי במקצבים גינקולוגיות היממה לטוס מוצג. כימות מושגת על ידי התאמת הפעילות לטוס עם צורת גל מודל רב פרמטרית. הפרמטרים דגם מתארים את הצורה ואת הגודל של הבוקר ושל פסגות ערב של פעילות יומית.

שיטה חישובית לכמת פעילות היממה לעוף

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

במאמר זה אנו מדגימים כיצד לנתח את מערכת העצבים המרכזית של הזחלים third תסיסנית instar.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

למדו לסנכרן Drosophila melanogaster למחקר קצבים ביולוגיים וכרונוביולוגיה באמצעות שיטות סינכרון ניסיוניות. שיטה זו מאפשרת הערכה אמינה של התנהגויות מחזוריות ומספקת בסיס לחקירת השפעות השעון הביולוגי על תהליכים פיזיולוגיים ומחלות.

היממה של דרוסופילה מלנוגסטר

גלה סרטונים נוספים