תפוקה גבוהה של מגבלות תרמיות קריטיות בחרקים

מגבלות תרמיות יכולות לחזות את סביבות אורגניזמים לסבול, שהוא מידע בעל ערך לנוכח שינוי האקלים המהיר. מתואר כאן פרוטוקולים בתפוקה גבוהה כדי להעריך מינימה תרמית קריטית וזמן נוקאאוט חום בחרקים. שני הפרוטוקולים ממקסמים את התפוקה וממזערים את עלות ההתייענות.

סובלנות תרמית היא מרכיב קריטי בהפצות מינים ותגובות לשינויי האקלים. כאן אנו מספקים שיטות להערכת חום וסובלנות קרה במהירות בחרקים קטנים. שיטות אלה למדידת עמידות לקור, באמצעות המינימום התרמי הקריטי וסובלנות לחום, באמצעות חום המופל זמן הם תפוקה גבוהה, חצי אוטומטיים ודורשים ציוד מינימלי.

הדגמת ההליך יהיה דוד Awde, פוסטדוק מהמעבדה שלי. כדי להקים תצהירה מינימלית תרמית קריטית, כוח על אמבטיית נוזלים מבוקרת טמפרטורה ולחץ על כפתור ההפעלה כדי להפעיל תוכנית, העלאת ושמירה על הטמפרטורה של האמבטיה ל 25 מעלות צלזיוס. המתן חמש עד עשר דקות כדי לאפשר לעמוד האמבטיה הנוזלי להגיע ל-25 מעלות צלזיוס, לפני החלפת התקע בחלק העליון של העמוד במסנן בקוטר 5.08 ס"מ.

הקש על כ 40 זבובים מבקבוקון המזון שלהם לתוך העמוד דרך המשפך במהירות להחליף את המשפך עם התקע, דואג לא לתת לכל זבובים לברוח. אז תן לזבובים להתיישב. מדי פעם הקשה על התקע התחתון כדי לעודד את הזבובים לטפס.

לאחר חמש דקות, לחץ על כפתור ההתחלה על הרווח אמבטיה נוזל, כדי להתחיל את תוכנית הרמפה מיני תרמית קריטית. לחץ כדי לפתוח את תוכנת ההקלטה הזוגית התרמית במחשב ולחץ על הקלט כדי להתחיל להקליט את הטמפרטורה בתוך העמודה, כל שנייה למשך ההתלהמה. ודא שכל הקלטת טמפרטורה כוללת את חותמת הזמן הספציפית לשניה, כך שניתן יהיה למזג נתוני טמפרטורה מאוחר יותר עם נתונים מהצג משפך דרוסופילה.

הוסיפו חמישה מיליליטר של 90% אתנול לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר והניחו את הצינור במתלה מתחת לעמוד. מדי פעם הקש על התקע התחתון של העמוד כדי לפתות את כל הזבובים בתחתית לטפס. רוב הזבובים יהיו על עמוד או ליד החלק העליון של הטור על ידי 15 מעלות צלזיוס.

ב 15 מעלות צלזיוס, מניחים משפך זכוכית בקוטר חיצוני 75 מילימטר לתוך צג משפך Drosophila. הסר את התקע התחתון ולאסוף את כל הזבובים עדיין על התקע באתנול. כוונן את טבעת ההתרעה, צג המשפך והמשפך, כך שהם יהיה מתחת לעמודה.

ודא כי השפה של המשפך לאטום לחלוטין את החלק התחתון של העמודה ולהכניס את החלק התחתון של המשפך לתוך צינור אוסף 15 מיליליטר. פתח את תוכנת צג משפך דרוסופילה. התוכנה תתחיל מיד להקליט את השעה והתאריך שבהם הזבובים מגיעים למינימה התרמית הקריטית שלהם.

זבובים מגיעים למינימה התרמית הקריטית שלהם, יאבדו את התפקוד הנוירומוסקולרי שלהם ויפלו מהמושכים שלהם, דרך צג משפך דרוסופילה. כדי לעקוב אם כל הזבובים הגיעו למינימה התרמית הקריטית שלהם, ככל שהטמפרטורה יורדת, בדוק את התקע העליון ואת התקע כדי לראות אם זבובים כלשהם עדיין יושבים. כאשר כל הזבובים, הגיעו למינימה התרמית הקריטית שלהם, הזז את צג משפך דרוסופילה והתרחק מפתיחת העמוד.

במקרים נדירים, זבובים עשויים להגיע למינימה התרמית הקריטית שלהם, אך נשארים תקועים בעמודה. פתח את התקע העליון כדי להסיר זבובים אלה. כדי להקים חום תפוקה גבוהה הפיל את ההקפאה, להשתמש שאפתן ומכסה מחיצה, כדי לטעון זבובים בודדים פחמן דו חמצני הרגעה, לתוך כל באר שונה 96 אין צלחת תחתונה ולאטום את הצלחת עם מכסה ברור הדוק הולם.

לאחר מכן מניחים את הצלחת על אספקת מזון ולאפשר את הזבובים להתאקלם 96 צלחת גם לפחות 48 שעות. ביום ההקפאה, להגדיר את החממה ל 37.5 מעלות צלזיוס, לאחר 30 דקות מניחים את צלחת תרבות זבוב לתוך החממה עם החלק התחתון של הצלחת על הנייר הלבן על החלק התחתון של המגש. שים לב לכיוון של שמות הטורים וה השורות היטב על המגש ובמסגרת מצלמת האינטרנט והצב סרט צבעוני לאורך הצדדים והקצוות של הלוח כדי לסייע באימות הכיוון.

כאשר הצלחת נמצאת בעמדה, סגור את דלת החממה ולחץ על הקלט בתוכנת הקלטת הווידאו. לאחר שעתיים, בדוק את ההקלטה כדי לראות אם כל הזבובים, הגיעו למקום מנוחתם האחרון והפסיקו לזוז. כאשר כל הזבובים הפסיקו לזוז, לחץ על עצור והשליך את הזבובים.

פתח את קובץ הווידאו והקלטת את זמן ההפלה של כל טיסה בכל באר. המדד העקבי ביותר של החום שהפיל את זמן ההשבתה בין הניסויים לתצפיות הוא הזמן שבו זבוב מגיע למקום מנוחתו הסופי. לאחר מכן לעקוב אחר הווידאו במהופך, התמקדות באר אחת ונוהגים את הזמן שבו לטוס הראשון נע את נקודת המנוחה הסופית שלה.

קביעת זמן המנוחה הסופי של כל זבוב יכולה להיות קשה. כדי להבטיח ניתוח מדויק, חשוב לקחת את הזמן שלך ולהתבונן כל טוב בנפרד. בניתוח מייצג זה, נקבות מ קו פאנל התייחסות גנטי Drosophila, היה נמוך באופן משמעותי ממוצע טמפרטורות מינימה תרמית מאשר נקבות מ קו DGRP 714.

בנוסף, החום הפיל את הזמן ב 37.5 מעלות צלזיוס, שונה באופן משמעותי בין הנקבות מ 73 ו 461 קווי DGRP. עם שינויים קלים, שיטה זו למדידת החום הפיל את הזמן, יכול לשמש כדי למדוד תכונות אחרות סובלנות תרמית, כגון זמן התאוששות תרדמת צונן או מקסימום תרמי קריטי. על ידי צמצום משמעותי של זמן הידיים לחוקרים, שיטות אלה אפשרו חקר של וריאציה גנטית תכונות סובלנות תרמית בקנה מידה שלא היה אפשרי בעבר.