Name: ב Vivo פיקציה של מחזור החלבון בהזדקנות C. אלגיה באמצעות Photoconvertible המרה Dendra2 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למד מעקב אחרי פירוק חלבון הנטינגטין ב-C. elegans באמצעות Dendra2. שיטה זו מאפשרת ניטור לא פולשני של דינמיקת חלבונים ומסייעת בחקר רשת הפרוטאוסטזיס והזדקנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים את DFG (KI-1988/5-1 לייק, מלגת נוירוקיור PhD על ידי מקבץ המצוינות של נוירוקיור כדי MLP) למימון. אנו מכירים גם את מתקן ליבת ההדמיה של המכון לחקר לייבניץ לפרמקולוגיה מולקולרית ברלין (FMP) לאספקת ההדמיה להגדיר. בנוסף, אנו רוצים להודות לדיוגו פללאנו שהקים את מערכת Dendra2 במעבדה וסיפק הוראות.

1. דור של C. אלגיה המבטא חלבון היתוך הDendra2
<ol><li>שיבוט הקידוד הגנטי פוי ב ביטוי נמטודות וקטור (כלומר, pPD95_75, addgene #1494), על ידי הגבלה אנזים ההגבלה המסורתית10, גיבסון האסיפה11, או כל שיטה של בחירה. הכנס מקדם לביטוי כונן ברקמה רצויה או בשלב התפתחותי רצוי. הכנס את Dendra2 fluorophore פור או N-או C-סופני במסגרת עם פוי.</li>
	<li>צור מיקרוגניים C. אלגיה המבטא את מבנה ההיתוך (למשל, באמצעות מיקרו הזרקה)12. הערה: הפלסמיד הנושא את המשגר יישאר כמערך מיותר כרומוזום. שילוב המבנה אינו הכרחי, אך ניתן לבצעו במידת הצורך13. בפרוטוקול זה, C. אלגיה היו מיקרווזרק עם פלס1 הנושאת את מבנה ההיתוך הונטיטין אקסון Dendra2 (htt-D2) תחת שליטה של הפאן-עצבי מיזם prgef-1. עמוד השדרה של ביטוי C. אלגיה התקבל מ-קריס ואח '14, הונטינב אקסון 1 עם או Q25 או Q97 התקבל מ juאויבי ואח '15, ו Dendra2 התקבל מ hamer et al.16.</li>
</ol>2. התאמת גיל ואחזקה של הג
<ol><li>גיל להתאים את כל נמטודות על ידי סנכרון או עם הטיפול היפוכלוריט בסיסית הפתרון17 או באמצעות הנחת ביצה עבור 4 h ב 20 ° c. עבור הנחת ביצים, מקום 10 gravid מבוגרים על מדיה צמיחה נמטודות טרי (ngm) צלחת לעזוב עבור 4 h לפני ההסרה. הביצים שהונחו בזמן זה יהיה להצמיח nematodes מסונכרן.</li>
	<li>לשמור על הניסוי C. אלגיה על מדיה צמיחה נמטודות (ngm) צלחות שנזרע עם מקור המזון החיידקי E. coli OP50, בעקבות גידול נמטודות רגיל18.</li>
	<li>לגדול בשעה 20 ° c עד לשלב הרצוי. עבור פרוטוקול זה, הגילאים הנדרשים הם ימים 4 ו-10. הערה: מבוגרים צעירים ביום 4 יכולים להיות מזוהים על ידי נוכחות של ביצים בבלוטת המין שלהם והניידות הגבוהה שלהם. יום מיושן 10 הנמדות הם פוסט פורה, ועוברים הידרדרות רקמות וירידה בקטר19.</li>
	<li>ליום 10 נמטודות, מעבר יומי לאחר השלב L4 ביום 3, לאחר נמטודות הם פוריים, כדי למנוע אוכלוסיה מעורבת.</li>
</ol>3. הכנת שקופיות מיקרוסקופיה להדמיה
<ol><li>הכינו את שקופיות המיקרוסקופיה ביום ההדמיה. במיקרוגל, להמיס כיתה כללית agarose בריכוז של 3% (w/v) ב ddH2O.. השאר להתקרר מעט</li>
	<li>חותכים את הקצה של טיפ 1 מ ל ומותכים בערך 400 μL של הצמח הנמס. הניחו בעדינות מספר טיפות של מעלות על שקופית זכוכית נקייה והציבו מיד שקופית נוספת למעלה, ודאו שנוצרת משטח דק בין השניים. הנח להתייבש לפני הזזה עדינה או הסרת השקופית העליונה.</li>
	<li>הניחו את השקופיות המכולות במיכל לחות כדי למנוע את התייבשות. אלה יכולים לשמש בתוך 2-3 h. הערה: הימנע מהיווצרות בועות קטנות בתוך הצמח, כמו הנמטודות יכול להיות לכוד בפנים.</li>
</ol>4. הגדרת פרמטרים של מיקרוסקופ קונפרטד
הערה: לפני טעינת הנמטודות ורכישת הנתונים, הגדירו את כל ההגדרות בתוכנת הרכישה הקונפוקלית. ניתן להתאים את ההגדרות לחומרת הדימות ולתוכנה של בחירה.
<ol><li>פתח את התוכנה הקונקלית והגדר את הגדרות הדימות לייזר. הגדר את נתיב האור עבור עירור/פליטה עבור ירוק Dendra2 ב 486-553 nm ו Dendra2 אדום ב 580-740 nm. כוונן את העוצמה והרווח של שני הערוצים/לייזרים בהתאם לעוצמת ה-fluorophore. אין לשנות את הרווח או ההסטה הדיגיטליים ולהגדיר את החור הפעור כפתוח לגמרי.</li>
	<li>הגדירו את כיוונון הרכישה: בחרו מצב ערוץ רציף והחליפו מעקב אחר כל מסגרת. הגדר את מצב הסריקה כמסגרת, ואת גודל המסגרת כ-1,024 x 1,024, עם שלב קו של 1. הגדר את הממוצע ל-2, וממוצע לפי שיטה ומצב של קו חד כיווני. הגדר את עומק הסיביות ל-8 סיביות.</li>
	<li>הגדירו את הגדרות הרכישות רב ממדיים עבור ההמרה של Dendra2. עבור המרה הלבנה להשתמש 405 ננומטר לייזר דיודה להגדיר ב 60% כוח אנרגיה. אם זמין, להפעיל את הלבנת בטוח GaAsP כדי להגן על גלאי.</li>
	<li>בחר סידרת זמן של שני מחזורים, עם מרווח של 0.0 אלפיות השנייה באמצע, ולהתחיל ולהפסיק רגיל. הפעל הלבנה לאחר סריקה 1 של 2 וחזור על 30 איטראציות. הפסק הלבנת כאשר העוצמה יורדת ל 50%.</li>
	<li>להגדיר את המהירות של רכישה/פיקסל לשכון מהר (למשל, מקסימום = 12) עבור המרה, מהירות בינונית (למשל, בינונית = 5) ללכידת תמונה הצמדה. הערה: הערכים הלבנת שהוגדרו כאן הם קווים מנחים. עבור אחרים Dendra2 מתויג POIs הגדרות כוח הלייזר הלבנת איטראציות וערכים חייב להיות מבוסס באמפירי.</li>
</ol>5. הרכבה של ג. אלאנים על שקופיות מיקרוסקופית
הערה: במידת האפשר, הציבו stereomicroscope הרכבה קרוב לכיוונון המיקרוסקופ הקונמטאני ומהר את הנמטודות בדיוק לפני ההדמיה.
<ol><li>על שקופית מכסה הזכוכית בצד הנגדי של כרית agarose, לצייר חלון עם ארבעה ריבועים עם סמן קבוע ומספר להם.</li>
	<li>פיפטה 15 μL של לויאמאסב. באמצע משטח הצמח הריכוז של levamisole ישתנה בהתאם לגיל nematode: כאשר הדמיה יום 4 nematode להשתמש 2 מ"מ לויתן; כאשר יום הדמיה 10 נמטודות להשתמש 0.5 mM levamisole.</li>
	<li>העבר ארבע מנודות לתוך הנוזל באמצעות בוחר התיל. בעזרתו של בוחר עפעף, בעדינות להעביר כל נמטודות בודדים למשבצת חלון. סיבוב הריס כך כל סימן של E. coli OP50 הוא מדולל ורקע הפלורסנט שלה לא מפריעה לרכישת אותות.</li>
	<li>לחכות נמטודות כמעט להפסיק לנוע ובעדינות למקם שובר כיסוי על גבי הנוזל כדי לשתק את הנמטודות בשכבה של levamisole בין הלוח הצמח ושובר הכיסוי.</li>
	<li>הניחו את השקופית ההפוכה על הבמה הקונמטאבית כדי לדמות את הנמטודות.</li>
</ol>6. המרה של Dendra2 ירוק: רכישת נתונים בזמן אפס
הערה: הניסויים מרדף הדופק להתחיל על ידי המרה הפיכה חלבון Dendra2 היתוך מ פלואור פולטות ירוק אחד אדום.
<ol><li>באמצעות העין של המיקרוסקופ, לאתר נמטודות הראשון עם מטרה 20x תחת זריחה ירוקה. להתמקד בראש או בזנב ולעבור למצב קונפוקלית.</li>
	<li>להתחיל סריקת לייזר עם 488 ננומטר לייזר כחול לדמיין את Dendra2 ירוק בערוץ EGFP ירוק (לשעבר/em = 486-553 nm). בחר תא עצב בודד והבא אותו לפוקוס. זום ב 3x ולהגדיל את היעד של קרן לייזר4. הערה: בחר תא עצב אחד לכל nematode. כל תא מעצב יהווה דגימה אחת או נקודת נתונים.</li>
	<li>מצא את מישור ההקרנה המקסימלי, בהתאם לבהירות של fluorophore להגדיל או להקטין את הרווח או לייזר כדי לקבל תמונה רוויה אך לא מוגזם לזיהוי על ידי מחוון טווח הצבע. , ברגע שזה מוגדר. הפסיקו את הסריקה הערה: אל תעביר את המדגם במשך זמן רב מדי או עם כוח רב מדי, כמו עירור עם אור כחול 488 ננומטר לעין יכול גם להמיר Dendra2, אם כי לאט וביעילות פחות4.</li>
	<li>בתוכנה, פתח את הכרטיסיה כדי לבחור את אזורי הריבית (ROIs) ולצייר הROI הראשון סביב תא העצב הנבחר. להגדיר אזור שנייה גדולה יותר של עניין המקיף את ראשו של nematode וכולל את ההחזר הראשון.</li>
	<li>בהגדרות הלבנה, בחר עבור ההחזר הראשון שנרכש, הולבן ונותח. בחר עבור ההחזר השני לרכישה וניתוח אך לא לולבן.</li>
	<li>להגדיר את המהירות של סריקה למקסימום (כלומר, פיקסל מהיר לשכון) ולהתחיל את הניסוי כדי להמיר את Dendra2 נוירונים שנבחרו. הערה: לאחר שהניסוי נעשה התמונה הנרכשת תגרום לשתי תמונות: אחת לפני ואחת אחרי ההמרה. עבור הערוץ הירוק, התמונה הראשונה צריכה להיות אות ירוק גבוה יותר הפוחתת בתמונה השנייה בשל ההמרה של Dendra2 ירוק. עבור הערוץ האדום, התמונה הראשונה צריכה להיות שלילית ולא להראות אות, עם אות אדום המופיעים בתמונה לאחר ההמרה. אם האות הירוק אינו מצמצם, ההמרה לא התרחשה, ואת ההגדרות, כגון כוח הלייזר 405 או מספר האיטראציות, יש לשנות. אם יש אות אדום בתמונה הראשונה, אז כוח הלייזר 488 ננומטר בשימוש היה גבוה מדי וחלק של Dendra2 ירוק כבר המרה לאדום. במקרה זה, תא העצב/nematode חדש יש לבחור.</li>
	<li>מיד לאחר ההמרה, התחל לחיות סריקה עם ירוק 561 ננומטר לייזר לדמיין Dendra2 בערוץ אדום (לשעבר/em = 580-740 ננומטר). מצא את הפוקוס ואת ההקרנה המקסימלית המתאימה של תא העצב שהומר באמצעות מחוון צבע הטווח כדי למנוע חשיפה יתר.</li>
	<li>הגדר במהירות את קצב הסריקה למהירות נמוכה יותר לשכון בפיקסלים (לדוגמה, 5x) ורכוש תמונת תמונה של שני הערוצים ברזולוציה גבוהה יותר. תמונה זו מוגדרת כtimepoint 0 (T0) לאחר ההמרה. הערה: מהירות הרכישה עבור התמונה המומרת עשויה להיות מגוונת. עם זאת, לאחר שנבחר, מהירות זו צריכה להישאר קבועה בכל איסוף הנתונים.</li>
	<li>שמור את הסריקה באמצעות שם ו/או מספר הניתנים לזיהוי, ואחריו תווית השעה אפס (T0). הערה: מומלץ גם לשמור את התמונה של ניסוי ההמרה (שלב 6.6) כדי להמחיש את היעדר האות האדום לפני ההמרה והופעתו לאחר מכן.</li>
</ol>7. הדמיה של Dendra2 אדום המרה לרכישת נתונים בנקודת הזמן השנייה שנבחרה
<ol><li>כדי לעקוב אחר השפלה Dendra2 במשך הזמן, הגדר מועד שני ליצור מחדש את אותו מזהה/עצב. בחר את נקודת הזמן השנייה הנסבית לטיפול בכל שאלה ביולוגית רלוונטית. עבור הפרוטוקול המתואר כאן, Dendra2 הוא התמונה הן ב 2 h (T2) ו 24 h (T24) post המרה.<ol>
<li>בנקודת הזמן שנבחרה, למצוא את אותו nematode/תא העצב עם השימוש של עינית ו זריחה אדומה.</li>
		<li>פתח את התמונה T0 של nematode/תא העצב בהתאמה רענן/שימוש חוזר בהגדרות התמונה. ודא שהגדרות הרכישה של התמונה זהות בדיוק בעת הרכישה של תמונות T0, T2 ו-T24 h.</li>
		<li>, סריקה חיה בערוץ האדום. הביאי את העצב האדום המומר לפוקוס בגלל שDendra2 האדום מבזה לאורך הזמן מחוון הטווח יראה הקרנה מקסימלית פחות אינטנסיבי. אין לשנות פרמטרים של רכישה ולקבל תמונה באותה מהירות (לדוגמה, 5x) כתמונה הראשונה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לעקוב אחר ההשפלה של Dendra2 אחרי 4 h או יותר, להציל את נמטודות לאחר ההמרה.<ol>
<li>הסר את השקופית מתוך המיקרוסקופ מיד לאחר המרת והדמיה של ארבע nematodes. להסיר בעדינות את הכיסויים עם השימוש של התיל לאסוף, להרים כל נמטודות מן הלוח agarose.</li>
		<li>מניחים כל נמטודות בנפרד על צלחת מתויג כראוי לזיהוי ngm.</li>
		<li>עבור נקודת הזמן השנייה, הר נמטודות שוב על משטח agarose טריים ולהמשיך עם הדמיה של Dendra2 אדום המרה בעקבות ההוראות בסעיף 6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. ניתוח תמונה של Dendra2 המרה
הערה: ניתוח ההשפלה של Dendra2 מבוצע עם תוכנת פיג'י/ImageJ20.
<ol><li>פתח את פיג'י וגרור ושחרר את קובץ ה-lsm בבר של פיג'י. פתח את התמונה T0 נלקח רק לאחר ההמרה ואת התמונה של נמטודות אותו נלקח בנקודת הזמן שנבחרה לאחר ההמרה (T2 או T24 h). הערה: כדי לעקוב אחר ההתדרדרות של החלבון הקשור לריבית ל Dendra2 רק הערוץ האדום צריך להיות מנותח.</li>
	<li>קביעת פרמטרי המדידה מהתפריט: ניתוח | הגדר מדידות. בחר את האזור ואת פונקציות הדחיסות המשולבות .</li>
	<li>בחר את התמונה שמתקבלת בערוץ האדום. בחרו בכלי בחירת המצולע מהבר של פיג'י.</li>
	<li>זהה את תא העצב המומר בתמונה T0 וצייר ROI סביבו באמצעות כלי הבחירה.<ol>
<li>כדי לזהות כראוי את קווי המתאר של תא העצב, סמן את סף העוצמה על-ידי בחירה מתוך התמונה בסרגל | כוונן | . אנימבין. גררו את סמן הסרגל כדי להתוות את הסף ולעקוב סביב אזור זה בעזרת כלי המצולע. כדי ליצור ROI מדויק, ניתן גם להשתמש במתאר של תא העצב הנבחר מהערוץ הירוק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר שהבחירה נעשתה בחלון הערוץ האדום, לחץ על לנתח | . מידה מדידה חלון מוקפץ בשם תוצאות יופיע ויכלול את ערכי ה-ROI עבור אזור, Intdenו- rawintden.</li>
	<li>בצע את אותו תהליך של בחירה ומדידה עבור התמונה של נקודת הזמן השנייה (T2 או T24 h).</li>
	<li>העתק את הערכים שהושגו לתוך תוכנת גיליון אלקטרוני, ודאג להקליט כראוי את הערכים ב-T0 לאחר ההמרה, וב-T2 או T24 h לאחר ההמרה.</li>
</ol>9. חישוב היחס של השפלה Dendra2
<ol><li>כדי לחשב את היחס בין השפלה, הקצה תחילה ערך של 1 (או 100%) לזמן השפלה מנקודת זמן אפס (כלומר, רק לאחר ההמרה, כאשר כל הDendra2 האדום המרה עדיין נוכח). התוצאה היא חלוקת הערך של החלק הפנימי של T0 בפני עצמו.</li>
	<li>כדי לחשב את הפחתת האות האדום Dendra2 האינטנסיביות לאורך זמן, ואת ההשפלה, לחלק את הערך של Rawintden של נקודת הזמן השנייה (למשל, T2 או T24 h) לפי הערך של Rawintden של T0. על המספר שהתקבל להיות קטן מ-1. ערכים אלה יכולים גם להתבטא כאחוזים, המגדירים T0 כ-100%.</li>
	<li>חזור על סעיף 7 עבור כל נמטודות שהומר. לייצוג גרפי של השפלה של Dendra2, התרשים מתווה פיזור או גרף עמודות עם ערכי האחוזים או היחס של ירידת הזריחה המתקבלת בציר y. החל כל ניתוח סטטיסטי רצוי והמחשה בגרף.</li>
</ol>

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Proteins+for+Photoactivation+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments.</a> Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).</li>
<li>Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).</li>
<li>Bates, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Huntington disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005(2015).</li>
<li>Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+non-cellautonomous+mechanisms+in+protein-misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22DMM+Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).</li>
<li>Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RasGRP%2C+C.+elegans+RGEF-1b%2C+Couples+External+Stimuli+to+Behavior+by+Activating+LET-60+%28Ras%29+in+Sensory+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons.</a> Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).</li>
<li>Addgene. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd Edition, https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition 45-50 (2020).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).</li>
<li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50773(2013).</li>
<li>Kreis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+phosphorylation+of+the+actin-binding+protein+drebrin+controls+oxidation+stress-resistance+in+mammalian+neurons+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ubiquitinated+huntingtin+species+in+intracellular+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).</li>
<li>Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoconvertible+reporter+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo.</a> Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+Synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+online+review+of+C.+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).</li>
<li>Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+and+analysis+of+age-related+changes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+online+review+of+C.+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans.</a> WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Specification of the nervous system.</a> WormBook. , 1-19 (2005).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).</li>
<li>Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+enhanced+photoconversion+yield+in+green+fluorescent+protein-like+protein+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2.</a> Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).</li>
<li>Tsvetkov, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteostasis+of+polyglutamine+varies+among+neurons+and+predicts+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration.</a> Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).</li>
<li>Feleciano, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+Between+Chaperone-Mediated+Protein+Disaggregation+and+Proteolytic+Pathways+in+Aging+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+real-time+monitoring+of+protein+degradation+at+the+single+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level.</a> BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).</li>
<li>Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+measurement+of+membrane+receptor+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">High resolution measurement of membrane receptor endocytosis.</a> Journal of Biological Methods. 5 (4), 105(2018).</li>
<li>Gunewardene, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+imaging+of+multiple+fluorescent+proteins+with+highly+overlapping+emission+spectra+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells.</a> Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כדי להבין את תפקודי החלבון חשוב להבין את הסינתזה, המיקום וההשפלה שלו. עם פיתוח של רומן, יציב, FPs בהיר, המחשה וניטור POIs הפך קל יותר ויעיל יותר. מבחינה גנטית הביע פפס היתוך כגון Dendra2 ממוקמים באופן ייחודי כדי ללמוד את יציבותו של פוי. עם החשיפה לאור סגול-כחול, Dendra2 מתפרק במיקום מדויק בתוך משולש של חומצות אמינו ששומרו. Fluorophore עובר שינוי מבניים קטן, וכתוצאה מכך משמרת מלאה של ספקטרום מירוק לאדום23. משמרת זו מאפשרת איתור וניטור של כל נקודת מקושר ל-Dendra2. אכן, מבנים אלה היתוך השתמשו לראשונה...

הפרוטאום של אורגניזם חי מתחדש באופן תמידי. חלבונים מושפל ברציפות ומסונתז בהתאם לדרישת הפיסיולוגית של תא. חלבונים מסוימים מסולקים במהירות, בעוד אחרים חיים יותר. ניטור הדינמיקה חלבון הוא משימה פשוטה יותר, מדויקת יותר, פחות פולשנית בעת שימוש בחלבונים פלואורסצנטי מקודד גנטית (FPs). FPs טופס אוטוזרז והוא יכול להיות מותך כל חלבון של עניין (פוי), אבל לא דורשים אנזימים לקפל או צריך קופנים לשמור עבור חמצן1. דור חדש של FPs ההונדס לאחרונה כדי לעבור צבע על הקרנה עם דופק קל של אורך גל נקבע. התמונות האלה FPs (פפס) לאפשר תיוג ומעקב של POIs, או ארגונית או התאים שהם מתגוררים, וכיצד לבחון את הפרמטרים כמותיים ו/או איכותניים שלהם2. FPs לאפשר מעקב אחר כל התנועה של פוי, כיוון, שיעור של תנועה, מקדם דיפוזיה, נייד לעומת שברים משותק, הזמן שהוא שוכן בתא הסלולר אחד, כמו גם קצב המחזור שלה. ניתן לקבוע את התנועה לארגון מסוים, לתחבורה, לאירועים ביקוע ולהיתוך. עבור סוג תא מסוים, ניתן ליצור מיקום תא, קצב החילוק, אמצעי האחסון והצורה. באופן מכריע, השימוש ב-פפס מאפשר מעקב ללא הדמיה רציפה וללא הפרעות מכל מכשיר שהוא לאחרונה. מחקרים הן בתאים והן באורגניזמים שלמים המועסקים בהצלחה פפס לטיפול שאלות ביולוגיות בvivo, כגון התפתחות של סרטן גרורות, הרכבה או פירוק של שלד התא, ו-RNA-DNA/חלבון אינטראקציות3. בכתב יד זה, מיקרוסקופ אור ו פפס משמשים כדי לחשוף את שיעורי המחזור של huntingtin חלבון הנוטה לצבור (HTT) בvivo במודל של C. אלגיה של מחלת ניווניות.
הפרוטוקול המתואר כאן ככמת את היציבות וההשפלה של חלבון ההיתוך huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 הוא הדור השני monomeric פמפ4 כי בוררים הפיך הפליטה שלה/עירור ספקטרום מירוק לאדום בתגובה או UV או אור כחול גלוי, עם גידול בעוצמתו של עד 4,000-קיפול5,6. Huntingtin הוא החלבון האחראי לגרימת מחלת הנטינגטון (HD), הפרעת ניווניות תורשתי קטלנית. הhuntingtin exon-1 מכיל קטע של glutamines (הקאג, Q). כאשר החלבון מתבטא עם מעל 39, הוא מתקפל לתוך חלבון מוטציה, רעיל ופתוגניים. מוטציה HTT הוא נוטה לצבור ומוביל מוות עצבי תאים וניוון, או מינים oligomeric קצרים או גדול מאוד בנוי amyloids7.
נמטודות היא מערכת מודל ללמוד הזדקנות ניוון נוירואני בזכות הקלות של מניפולציה, הטבע האיזוגני, תוחלת חיים קצרה, ושקיפות אופטית שלה8. כדי ללמוד את יציבותו של HTT בvivo, מבנה היתוך התבטא במערכת העצבים של הג. העברה של HTT-D2 המכיל מתיחה פיזיולוגית של 25Qs (HTTQ25-D2) או מתיחה פתולוגית של 97Qs (HTTQ97-D2) הוא הביע מוגזם פאן-neuronally בכל תקופת החיים של nematode9. על ידי העברת החיים C. אלגיה לנקודה קצרה וממוקדת של אור, תא העצב בודד הוא מיתוג והמרה htt-D2 מתבצע במשך הזמן. כדי לקבוע את כמות HTT-D2 המושפל, ההפרש בין האות האדום של HTT-D2 הטרי המומר מושווה לאות האדום הנותרים של HTT-D2 לאחר פרק זמן קבוע. לפיכך, ניתן לחקור את האופן שבו הונטינטין מושפל כאשר הוא נמצא בצורתו המורחבת והרעילה בהשוואה לצורתו הפיזיולוגית; כיצד הנוירונים הקדמי או האחורי להגיב באופן שונה לנוכחות של Q97 לעומת Q25, במיוחד על תקופות זמן ממושך; וכיצד התמוטטות הרשת פרוטאוסטזיס (PN) במהלך הזדקנות תורמים להבדלים בשיעורי השפלה. תוצאות אלה מתארות רק קבוצה קטנה של תצפיות על תחלופת HTT-D2. עם זאת, שאלות רבות יותר ביולוגיות הרלוונטיות הן לתחום של צבירת חלבון ו פרוטאוסטזיס יכול להיות ממוען עם זה ביישום vivo.

<table><tbody><tr><td>Agar-Agar Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>5210.2</td><td>NGM component</td></tr><tr><td>Agarose, Bio & Universal Grade</td><td> למכור GmbH</td><td>BS20.46.500</td><td>רכיב שקופיות הרכבה</td></tr><tr><td>BD Bacto Peptone</td><td>BD-Bionsciences</td><td>211677</td><td>רכיב NGM</td></tr><tr><td>Deckgl&auml; ser-18x18mm</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0657.2</td><td>תלושי כיסוי</td></tr><tr><td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Objective</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ 1.52p</td><td>NIH</td><td></td><td>Analysis Software</td></tr><tr><td>Levamisole Hydrochloride</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4341</td><td>חומר הרדמה</td></tr><tr><td>LSM710-ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>סריקת לייזר מיקוסקופ קונפוקלי</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ הרכבה</td><td>Leica Camera AG</td><td></td><td>מיקרוסקופ הרכבה</td></tr><tr><td>נוירונלי-HTTQ25-Dendra2</td><td>מאמר</td><td></td> זה<td>C. elegans זן</td></tr><tr><td>עצבי-HTTQ97-Dendra2</td><td>מאמר</td><td></td> זה<td>C. elegans זן</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)</td><td>OP50</td><td>מקור מזון לנמטודות</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3957.2</td><td>NGM רכיב</td></tr><tr><td>סטנדרטי-Objekttr&auml; ger</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0656.1</td><td>שקופיות זכוכית</td></tr><tr><td>ZEN2010 B SP1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>תוכנת רכישה קונפוקלית</td></tr></tbody></table>

ב vivo פיקציה של מחזור החלבון בהזדקנות c. אלגיה באמצעות photoconvertible המרה dendra2

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

חלבונים מסונתז ומושפל באופן קבוע בתוך התא כדי לשמור על הומאוסטזיס. היכולת לפקח על השפלה של חלבון של עניין היא המפתח להבנת לא רק מחזור החיים שלה, אלא גם לחשוף חוסר איזון ברשת פרוטאוסטזיס. שיטה זו מראה כיצד לעקוב אחר ההשפלה של מחלת החלבון הגורם למחלות. שתי גרסאות של huntingtin התמזגו ל Dendra2 מבוטא במערכת העצבים של C. אלגיה : גרסה פיזיולוגית או אחת עם מתיחה מורחבת ופתוגניים של glutamines. Dendra2 הוא חלבון פלורסנט פוטולהמרה; על פולס אולטרה סגול (UV) הקרנה, Dendra2 מעביר את הריגוש שלה/פליטה ספקטרום מירוק לאדום. בדומה לניסוי מרדף דופק, המחזור של red-Dendra2 המרה יכול להיות מנוטר וכימות, ללא קשר להפרעה מחדש מסונתז ירוק-Dendra2. בעזרת מיקרוסקופ מבוסס-מיקוד ובגלל השקיפות האופטית של ה -"אלאלגיה", ניתן לנטר ולכמת את ההשפלה של הDendra2 באורגניזם חי ומזדקן. הDendra2 הנוירוונאליות מושפלת באופן חלקי מיד לאחר ההמרה ומנוקה לאורך זמן. מערכת השליטה בירידה בנוכחות מוטציות huntingtin והיא לקויה עוד יותר עם הזדקנות. תת העצבי בתוך מערכת העצבים אותה מוצג קיבולות מחזור שונות עבור huntingtin-Dendra2. בסך הכל, ניטור כל חלבון של עניין התמזגו Dendra2 יכול לספק מידע חשוב לא רק על השפלה שלה ואת השחקנים של הרשת פרוטאוסטזיס מעורב, אלא גם על מיקומו, סחר, ותחבורה.

שני זנים נמטודות המבטא huntingtin exon-1 מרסיס חלבון במסגרת עם Dendra2 חלבון ההמרה התקבלו באמצעות מיקרוהזרקות והפלמידים נשמרו כמערך מיותר כרומוזומלית. בניית ההיתוך באה לידי ביטוי במערכת העצבים השלמה מהתפתחות הזדקנות ברחבי העולם. כאן, HTT-D2 הכיל את המתיחה הפיזיולוגית 25 polyglutamine (HTTQ25-D2, איור 1א) או החדירה לחלוטין הפתוגניים חוזר עם 97 Glutamines (HTTQ97-D2, איור 1B). בתחילה חלבון...

מוצג כאן הוא פרוטוקול כדי לפקח על השפלה של החלבון huntingtin התמזגו הפוטוורידים פלואורואופפור Dendra2.

ב Vivo פיקציה של מחזור החלבון בהזדקנות C. אלגיה באמצעות Photoconvertible המרה Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

פרוטוקול זה מאפשר מעקב וכמות של השפלה של חלבון של עניין חי ומזדקן C.elegans. טכניקה זו של vivo ו- noninvasive דורשת רק מיקרוסקופיה קטנה להגדיר כדי להמיר באופן אמין Dendra2 לתוך פלואורופור בהיר ויציב. השיטה מותאמת למערכות יונקים, כמו גם דגי זברה.כדי ללמוד, לשים במחזור בתוך רשת פרוטאוסטטיס, כמו גם תחבורה וסחר. יש לדאוג לא לעורר המרה לא רצויה של Dendra2 בעת סריקה עם לייזר אור כחול, כדי לבדוק ולמטב את הגדרות הרכישה ואת הגדרות ההמרה עבור כל מערכת וחלבון היתוך. התחילו בגידול נמטודות תואמות גיל ב-20 מעלות צלזיוס לגיל הרצוי לניסוי.ביום ניסוי ההדמיה, ההמסה הכללית עלתה בריכוז של 3% במים מזוקקים כפולים. בעוד אגרוז הוא קירור, לחתוך את הקצה של קצה פיפטה מיליליטר אחד כדי להקל על השאיפה של כ 400 microliters של אגרוז נמס. בזהירות להוסיף כמה טיפות של agarose על מגלשת זכוכית נקייה מיד למקם שקופית נוספת על גבי הטיפות כדי ליצור כרית דקה של agarose בין שתי חתיכות זכוכית.כאשר ההתעוררות התייבשה, הסר בזהירות את השקופית העליונה. כאשר הוכנו מספיק שקופיות, פתח את תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקל והגדר את נתיב האור לגירוש ו הפליטה. עבור Dendra2 ירוק להוסיף 486 כדי 553 ננומטר, עבור אדום Dendra2 להוסיף 580 כדי 740 ננומטר.התאימו את העוצמה וההתפתחות של שני הערוצים בהתאם לעוצמת הפלואורופור והגדירו את חור הסיכה לפתיחה מלאה. בחרו מצב ערוץ רציף והגדירו את הרצועה כך שתחליף כל פריים. הגדר את מצב הסריקה כמסגרת ואת גודל המסגרת כ- 1024 על 1024 עם שלב שורה של אחד.הגדר את הממוצע לשניים ולממוצע לפי השיטה והאופן הממוצעים של קו חד-כיווני. הגדר את עומק הסיביות לשמונה סיביות. הגדר את הגדרת הרכישה הרב-מידנית עבור ההמרה של Dendra2.להמרה והלבנה, השתמש בלייזר דיודה 405 ננומטר מוגדר 60% כוח אנרגיה. בחר סדרת זמן של שני מחזורים עם מרווח זמן של 0.0 אלפיות שניה בין המחזורים והתחלה ועיבור רגילים. הגדר את ההלבנה להתחיל לאחר סריקה אחת משתיים, לחזור על 30 איטראציות ולהפסיק כאשר העוצמה יורדת ל 50%לאחר מכן, להגדיר את המהירות של פיקסל הרכישה להתעכב מהר להמרה ובינונית ללכידת תמונת הצמדה.כדי לטעון את nematodes על השקופיות, להשתמש בסמן קבוע לצייר ולמספר חלון עם ארבעה ריבועים על ההפך של כרית agarose על כל שקופית. הוסף 15 microliters של levamisole לאמצע כרית אגרוז ולהשתמש מיקרוסקופ סטריאו בחירה חוטית להעביר עבור nematodes תואם גיל לתוך טיפה. השתמש בפיק ריסים כדי להזיז בעדינות כל נמטודה לחלון אחד של הריבוע.כאשר כל הנמטודות מוצבות מחדש, המתן עד שהתולעים יפסיקו לנוע לפני הנחת החלקת כיסוי על הנוזל כדי לשתק את הנמטודות במהלך ההדמיה. לאחר מכן, מקם את השקופית על שלב המיקרוסקופ הקונפוקל. להמרה ירוקה Dendra2, להשתמש בעין של המטרה 20 X תחת פלואורסצנטיות ירוקה כדי לאתר את nematode הראשון ולהתמקד בראש או בזנב.עבור למצב confocal ולהגדיל או להקטין את הרווח ואת כוח הלייזר כדי להשיג תמונה רוויה, אך לא יתר על המידה. צייר אזור עניין סביב הנוירון שנבחר וצייר אזור עניין גדול יותר סביב הזנב הכולל את האזור הראשון של עניין. הגדר את האזור הראשון שיש לרכוש, להלבין ולנתח.הגדר את האזור השני של עניין להיות נרכש וניתוח, אבל לא מולבן. הגדר את מהירות הסריקה למקסימום והתחל את הסריקה כדי להמיר את תאי העצב הנבחרים של Dendra2. מיד לאחר ההמרה, להתחיל סריקה חיה עם לייזר 561 ננומטר ירוק כדי לדמיין Dendra2 בערוץ האדום ולמצוא את המיקוד ואת ההקרנה המרבית בהתאמה של הנוירון המרה.הגדר במהירות את קצב הסריקה למהירות נמוכה יותר של עכבות פיקסלים ורכוש תמונת מצב של שני הערוצים ברזולוציה גבוהה יותר. תמונה זו נחשבת בזמן אפס לאחר ההמרה. לאחר מכן, שמור את הסריקה בשם או במספר הניתנים לזיהוי, ולאחר מכן את תווית הזמן אפס.כדי לעקוב אחר השפלה Dendra2 לאורך זמן, לפתוח את התמונה אפס פעמים של נוירון nematode בהתאמה. באמצעות אותה הגדרת תמונה, התחילו לסרוק בשידור חי בערוץ האדום והכניסו את הנוירון האדום שהומר לפוקוס. לאחר מכן, מבלי לשנות פרמטרי רכישה כלשהם, השג תמונה באותה מהירות כמו התמונה הראשונה.הקפד להגדיר את הגדרת ההמרה שלך בקפידה כדי להמיר Dendra2 ביעילות ובאופן מספיק כדי לשמור על אותם פרמטרי רכישה לאורך נקודות זמן שונות. כדי לנתח את תמונות Dendra2 שהומרו, פתחו את תמונות נקודת הזמן אפס והזמן השני בפיג'י ופתחו את 'נתח' ו'קבע מידות'. בחרו בפונקציות 'אזור' ו'דחיסות משולבת' ובחרו בתמונה שהושגה בערוץ האדום.בעזרת הכלי בחירת מצולע, צייר אזור מעניין בערך בזמן שבו אפס נוירון שהומר. לזיהוי נכון של קווי המתאר של הנוירון, בחרו 'תמונה', 'התאם' ו'סף' כדי לסמן את ספי העוצמה. לאחר הגדרת הבחירה, לחץ על נתח ולמדוד.יופיע חלון תוצאות מוקפץ, כולל האזור, הצפיפות המשולבת וערכי הצפיפות המשולבת הגולמית עבור אזור העניין שנבחר. בצעו את אותו תהליך בחירה ומדידה לתמונה מנקודת הזמן השנייה. לאחר מכן, העתק את הערכים לגיליון האלקטרוני.בניתוח מייצג זה לפני ההמרה, לא היה אות אדום גלוי כאשר המדגם התרגש בערוץ האדום. עם הקרנה, האות הירוק פחת כמו HTT-D2 הומר אות אדום לאחר מכן הופיע. ביטוי HTT-D2 התדרדר עם הזמן, וכתוצאה מכך ירידה ברמות של אות HTT-D2 אדום עלייה אפשרית של אות HTT-D2 ירוק כמו חלבון היתוך יותר היה מסונתז לאחרונה.יש לציין, הנוירונים של אזור הזנב נקבעו להיות פעילים יותר באופן משמעותי בהשוואה לאלה של הראש. יתר על כן, הייתה השפלה משמעותית יותר של שליטה HTTQ25-D2 24 שעות לאחר ההמרה, ולאחר שעתיים הן נוירונים הראש והזנב. הבדל זה לא נצפתה HTTQ97-D2 פתוגניים, עם זאת, מה שמרמז כי רשת פרוטאוסטאזיס לא היתה מסוגלת להסיר HTT-D2 המכיל מתיחות גלוטמין ארוכות יותר בכל מערכת העצבים.HTTQ97-D2 לא היה מושפל ביעילות כמו HTTQ25-D2 ב nematodes הישן מאוד, הדגשת חוסר היכולת של רשת פרוטאוסטיס להסיר מינים מצטברים ואולי רעילים של הנטינגטון בבעלי חיים מבוגרים. חשוב לציין, נוירונים זנב הצליחו להתמודד עם HTTQ97-D2 רעילים ב nematodes צעירים, מה שמרמז כי מנגנוני רשת פרוטאוסטזיס במקביל שונים עשויים להיות בעבודה כדי להסיר HTT-D2. עבור כל רכישה לדוגמה ותמונה שאינה מוסברת יתר על כן ותמונה לא רוויה מיד לאחר ההמרה ותיוו לעשות שימוש חוזר באותה הגדרה עבור מדגם זה לאורך זמן.עם פרוטוקול זה, ניתן לבדוק שינויים ברשת פרוטאוסטטיס, וגם, בעזרת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, כדי לעקוב אחר התפשטות של חלבונים הקשורים למחלות.

in-vivo-quantification-protein-turnover-aging-c-elegans-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שריר שלד הוא חיוני לתנועה, והוא חנות החלבון העיקרית של הגופים. מדידות בריאות שרירים בתוך סי אלגנס מתוארות. שינויים פוטנציאליים למבנה שרירים ובתפקודם הוערכו באמצעות ה- GFP מקומי וצבעים קטיוני.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב C. elegans

רמות חלבון בתאים וברקמות לעתים קרובות מוסדרות היטב על ידי האיזון של ייצור חלבון ופינוי. שימוש בקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP), קינטיקה האישור של חלבונים ניתן למדוד באופן ניסיוני בvivo.

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

כאן, אנו מציגים מסגרת להתייחס הגבלות תזונתיות מגוון רחב ביטוי גנים ואת תוחלת החיים. אנו מתארים פרוטוקולים עבור הגבלות תזונתיות מגוון רחב, הדמיה כמותית של ביטוי גנים תחת הפרדיגמה הזו. אנחנו עוד חלוקה לרמות ניתוחים חישובית לחשוף שבבסיס תכונות עיבוד המידע של מעגלים גנטי מעורב חישה מזון.

כימות של מידע מקודד על ידי גנים ביטוי רמות במהלך תוחלת החיים אפנון תחת הגבלת תזונה מגוון רחב C . elegans

מטרת השיטה המובאת כאן היא לבחון חלבון צבירת במהלך הזדקנות נורמלית בתוך האורגניזם דגם C. elegans. הפרוטוקול מייצג כלי רב עוצמה כדי ללמוד מצרפי גדול מאוד מסיסים היוצרים עם הגיל וכדי לקבוע כיצד משפיעים השינויים פרוטוסטאזיס חלבון צבירת.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

הדמיה של מסכי החיים של הקרינה הפלואורסצנטית, כימות ומבדיל את נטיות הצבירה של חלבונים בחיים, הזדקנות, והדגיש מודלים של מחלות C.

אפיון מבני עמילואיד בהזדקנות C. אלגיה באמצעות הדמיה של תקופת החיים הפלואורסצנטית

ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

כאן, אנו מציגים ומתארים שיטה לא רדיואקטיבית ולא פולשנית כדי להעריך סינתזת חלבון דה נובו ב vivo, ניצול elegans caenorhabditis נמטודה והתאוששות פלואורסצנציה לאחר photobleaching (FRAP). שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מסכים גנטיים ו/או תרופתיים כדי לזהות אפנונים חדשניים של סינתזת חלבונים.

הערכה של דה נובו חלבון סינתזה שיעורי Caenorhabditis elegans

כאן, שיטה מוצגת לניתוח של קינטיקה הצטברות חלבון נמטודה Caenorhabditis elegans. בעלי חיים מאוכלוסייה מסונכרנת גיל הם בתמונה בנקודות זמן שונות, ואחריו ספירת הכללה חצי אוטומטית CellProfiler והתאמה למודל מתמטי באמילופיט.

ניטור הצטברות חלבונים קינטיקה ב Vivo באמצעות ספירת הכללה אוטומטית ב Elegans Caenorhabditis

הוראת המדעים הביולוגיים יכולה להיות מגרה יותר עבור התלמידים באמצעות שימוש בניסויים. כתב יד זה מציג שני פרוטוקולים שונים אך משלימים שניתן להשתמש בהם בכיתה כדי לעודד תלמידים לנסח ולבדוק השערות הקשורות לתזונה עתירת קלוריות, רעב והזדקנות.

שימוש בצבעים זולים כדי להמחיש הצטברות גליקוגן ושלמות המעי ב - Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מספק גישה סטנדרטית להדמיית מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ברקמות מרובות של C. elegans במהלך ההזדקנות.

הדמיה וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב - C. elegans במהלך ההזדקנות

למד מעקב אחרי פירוק חלבון הנטינגטין ב-C. elegans באמצעות Dendra2. שיטה זו מאפשרת ניטור לא פולשני של דינמיקת חלבונים ומסייעת בחקר רשת הפרוטאוסטזיס והזדקנות.

ב Vivo פיקציה של מחזור החלבון בהזדקנות C. אלגיה באמצעות Photoconvertible המרה Dendra2

גלה סרטונים נוספים