Name: מדידת המפגש של iPSCs באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית. (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: למדו הערכת צפיפות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר של צמיחת iPSCs על מצעי ECM שונים מבלי לפגוע בתהליך הגדילה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי מענקים ממשרד הבריאות האיטלקי פונדציונה במבינו גסו (Fondazione Bambino Gesù) ורייסרקה קורנטה (Ricerca Corrente) ל-C.C.  ברצוננו להודות לד"ר אנריקו ברתיני (המחלקה למדעי המוח, היחידה למחלות נוירומוסקולריות ונוירודגנרטיביות, המעבדה לרפואה מולקולרית, בית החולים למחקר לילדים במבינו גסו), ד"ר סטפניה פטריני (מתקן ליבה למיקרוסקופיה קונפוקלית, מעבדות מחקר, בית החולים למחקר לילדים במבינו גסו), ג'וליה פריקולי (המחלקה לאונקו-המטולוגיה, גנים ותרפיה תאית, בית החולים למחקר לילדים במבינו גסו) ורוברטה פרטי (המחלקה לאונקו-המטולוגיה, טיפול גנטי ותאי, בית החולים למחקר לילדים במבינו גסו) לדיונים מדעיים ועזרה טכנית. מריה וינצ'י זכתה ב"מלגת ילדים חולי סרטן בבריטניה".

1. ציפוי 96 לוחות באר
הערה: ציפויים שונים נבדקו באותה צלחת אך בארות נפרדות (ראה קובץ משלים).
<ol><li>לדלל את המטריגל 1:100 ב-DMEM. הוסיפו 100 מיקרון לבאר ל-96 לוחות הקידוח ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את התמיסה ושטוף את הבארות עם 100 μL של DMEM פעמיים.</li>
	<li>לדלל למינין (20 מיקרוגרם/מ"ל, LN-521) ב-PBS (עם סידן ומגנזיום). יש להוסיף 100 μL לבאר ולדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת לבצע שתי שטיפות עם DMEM לפני זריעת התאים.</li>
	<li>דילול ויטרונקטין (10 מיקרוגרם/מ"ל) במאגר דילול. יש להוסיף 100 μL לכל באר לצלחת 96 הבאר ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לשטוף את הבארות עם PBS (ללא סידן ומגנזיום) לפני ציפוי התאים.</li>
	<li>יש לדלל HU-פיברונקטין (30 מיקרוגרם/מ"ל) ב-ddH2O. יש להוסיף 100 מיקרוגרם לבארות ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. לאחר מכן, לשטוף את הבארות עם המדיום לפני זריעת התאים.</li>
</ol>2. תחזוקה של iPSCs בתרבות
הערה: iPSCs נרכשו באופן מסחרי. ה-iPSCs הופקו מפיברובלסטים אנושיים בריאים ותוכנתו מחדש באמצעות טכנולוגיה אפיזומלית.
<ol><li>מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי, הפשירו את ה- iPSCs בהקפאה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. נקו את הבקבוקון המכיל את התאים עם 70% אתנול לפני העברתו לארון הבטיחות הביולוגי.</li>
	<li>הוסף את תרחיף התא ל-5 מ"ל של מדיית תרבית תאים שחוממה מראש (לדוגמה, mTeSR1) טיפה אחר טיפה עם פיפטה של 1000 μL בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה של התאים ב 304 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>הסר את המדיה והשהה את כדור התא ב -4 מ"ל של מדיום תרבית תאים.</li>
	<li>צלחת את תרחיף התא לתוך שתי בארות של 6 לוחות באר (105 iPSCs לכל צלחת תרבית תאים 6 באר), שבו פיברובלסטים עובריים העכבר (MEFs) כבר מצופה בעבר. זרעי MEFs יומיים לפני ציפוי iPSCs בצפיפות של 2.4 x 104/cm2 ב- DMEM (המכיל 10% סרום בקר עוברי, 1% L-גלוטמין ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין).</li>
	<li>לאחר הזריעה, השלימו את מדיית התא עם 10 מיקרומטר של מעכב ROCK Y-27632.</li>
	<li>הגדל את ה- iPSCs על MEFs במשך 4-5 השבועות הראשונים ולאחר מכן במצב ללא מזין (מצב ללא MEF), באמצעות אחד הציפויים המעניינים (ראה שלב 1 וטבלה 1) ב- mTeSR1.</li>
	<li>כאשר ה- iPSCs הם 70-80% נפגשים, מעבר 1:4 באמצעות 0.5 mM EDTA טיפול במשך 3-5 דקות ב RT. הוסף 1 מ"ל של 0.5 mM EDTA עבור צלחת 6 באר (או כמויות פרופורציונליות עבור סוגים אחרים של צלחות). מעבירים לבארות חדשות בתנאים נטולי הזנה ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 20% O2.</li>
	<li>שנה את המדיה עם mTeSR1 טרי מדי יום ופצל את התאים כל יומיים.</li>
</ol>3. אפיון מפגש תאים
<ol><li>השתמש ב-96 לוחות באר לניסויים.</li>
	<li>זרעו 10,000 תאים בכל באר לאחר לפחות חודש אחד של גידול במצב ללא הזנה כדי להיות בטוחים שה-MEFs לא הועברו. השתמש בשקופיות ספירה חד פעמיות כדי לספור את התאים באמצעות המיקרוסקופ האופטי.</li>
	<li>בצע את הניסויים במשולש. לכן, בדקו כל מצב זריעה בשלוש בארות.</li>
	<li>בצע רכישת תמונה אוטומטית מהיום הראשון שלאחר הזריעה באמצעות ציטומטר במצב שדה בהיר. בצע רכישת תמונות אוטומטית כל 24 שעות למשך 5 ימים. למידע מפורט על הפרמטרים הניסיוניים, עיין בקובץ המשלים.</li>
	<li>השתמש בניגודיות אוטומטית ובחשיפה אוטומטית כדי להציג תאים באופן חזותי טוב יותר.</li>
	<li>הגדר את הגדרת הניתוח (ראה קובץ משלים) לניתוח מפגש כדי להחיל מסכה של 60%, 80% ו-100% לכל באר, על מנת להעריך את השינויים במיקוד עקב שבירת האור בגבול הבארות. השתמש בהגדרת ניתוח המסיכות השונה שהוזכרה לעיל כדי לנתח את מפגש התאים בכל נקודת זמן.</li>
</ol>4. ניתוחים סטטיסטיים
<ol><li>דווח על תוצאות כמותיות כאמצעי ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM).</li>
	<li>כדי להשוות את ההבדלים הכוללים בין תנאי הציפוי השונים, קבל נתונים באמצעות אותן דגימות ובצע את מבחן ה- t של הסטודנט עם דגימה זוגית. ערכי P הנמוכים מ- 0.05 נחשבים למובהקים סטטיסטית, וכל ערכי ה- p המדווחים הם דו-צדדיים.</li>
</ol>5. אפיון המיקרופילמנטים הציטוסקטליים
<ol><li>תקן תאים עם 4% פרפורמלדהיד (4% PFA) ב-PBS למשך 10 דקות ב-RT, ולאחר מכן שתי שטיפות ב-PBS (10 דקות בסך הכל).</li>
	<li>הוסף 100 μL של תמיסת חסימה (המורכבת מ-5% BSA, 0.1% טריטון ב-PBS) לכל באר למשך שעה אחת ב-RT.</li>
	<li>הסר את תמיסת החסימה ושטוף את הדגימות פעמיים עם PBS למשך 10 דקות.</li>
	<li>הוסיפו 100 μL של תמיסת העבודה המצומדת phalloidin לכל דגימה ודגרו במשך שעה אחת ב-RT.</li>
	<li>שטפו תאים פעמיים עם PBS (10 דקות ב-RT).</li>
	<li>גרעיני כתם עם Hoechst 33342 מדולל 1:10000 ב- PBS במשך 10 דקות ב- RT.</li>
	<li>הסר את תמיסת Hoechst ושטוף את התאים פעמיים עם PBS במשך 10 דקות בכל פעם.</li>
	<li>שטפו את הדגימה עם H2O והניחו לה להתייבש מתחת למכסה המנוע הכימי.</li>
	<li>הוסף 100 μL של מדיה הרכבה (כלומר PBS:גליצרול, 1:1) כדי לכסות את התאים ולשמר פלואורסצנטיות של דגימות.</li>
	<li>התבונן בתא ב- Ex/Em 493/517 ננומטר במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר המצויד במקור לייזר אור לבן (WLL) ולייזר דיודה של 405 ננומטר. רכשו תמונות קונפוקליות עוקבות באמצעות מטרת טבילת שמן HC PLAPO 40x. השתמש באותו כוח לייזר, מפצלי קרן, הגדרות מסנן, קוטרי חור סיכה ומצב סריקה עבור כל הדגימות שנבדקו.</li>
</ol>

<ol><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+iPSCs+display+an+uncommon+mitochondrial+appearance+and+fail+to+undergo+in+vitro+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Aged iPSCs display an uncommon mitochondrial appearance and fail to undergo in vitro neurogenesis.</a> Aging (Albany NY). 6 (12), 1094-1108 (2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21 (24), 6188-6193 (1982).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nature Communications. 5, 3195(2014).</li>
<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521+based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521 based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
<li>Laperle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-5+Laminin+Synthesized+by+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Promotes+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">α-5 Laminin Synthesized by Human Pluripotent Stem Cells Promotes Self-Renewal.</a> Stem Cell Reports. 5 (2), 195-206 (2015).</li>
<li>Albalushi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+521+stabilizes+the+pluripotency+expression+pattern+of+human+embryonic+stem+cells+initially+derived+on+feeder+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Laminin 521 stabilizes the pluripotency expression pattern of human embryonic stem cells initially derived on feeder cells.</a> Stem Cell International. 2018, 7127042(2018).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-derived+laminin-511+promotes+midbrain+dopaminergic+neuron+survival+and+differentiation+through+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Niche-derived laminin-511 promotes midbrain dopaminergic neuron survival and differentiation through YAP.</a> Science Signaling. 10 (493), (2017).</li>
<li>Lu, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+xeno-free+and+feeder-free+culture+system+for+the+derivation%2C+expansion+and+direct+differentiation+of+transgene-free+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (9), 2816-2826 (2015).</li>
<li>Miyazaki, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+slow+cooling+cryopreservation+for+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Optimization of slow cooling cryopreservation for human pluripotent stem cells.</a> Genesis. 52 (1), 49-55 (2014).</li>
<li>Bergström, R., Ström, S., Holm, F., Feki, A., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Xeno-free culture of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 767, 125-136 (2011).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vitronectin+is+a+functionally+defined+substrate+that+supports+human+embryonic+stem+cell+self-renewal+via+alphavbeta5+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem cell self-renewal via alphavbeta5 integrin.</a> Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2008).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+vitronectin+concentration+and+surface+properties+on+the+stable+propagation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Impact of vitronectin concentration and surface properties on the stable propagation of human embryonic stem cells.</a> Biointerphases. 5 (3), 132-142 (2010).</li>
<li>Prowse, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+embryonic+stem+cells+on+recombinant+vitronectin+in+ascorbate+free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human embryonic stem cells on recombinant vitronectin in ascorbate free media.</a> Biomaterials. 31 (32), 8281-8288 (2010).</li>
<li>Rowland, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+integrins+in+human+induced+pluripotent+stem+cell+growth+on+Matrigel+and+vitronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin.</a> Stem Cells and Development. 19 (8), 1231-1240 (2010).</li>
<li>Ruoslahti, E., Engvall, E., Hayman, E. G., Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+on+amniotic+fluid+and+plasma+fibronectins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative studies on amniotic fluid and plasma fibronectins.</a> Biochemistry. 193 (1), 295-299 (1981).</li>
<li>Ni, H., Li, A., Simonsen, N., Wilkins, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+activation+by+dithiothreitol+or+Mn2%2B+induces+a+ligand-occupied+conformation+and+exposure+of+a+novel+NH2-terminal+regulatory+site+on+the+beta1+integrin+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrin activation by dithiothreitol or Mn2+ induces a ligand-occupied conformation and exposure of a novel NH2-terminal regulatory site on the beta1 integrin chain.</a> Biological Chemistry. 273 (14), 7981-7987 (1998).</li>
<li>Seltana, A., Basora, N., Beaulieu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+wound+healing+assay+in+an+epithelial-mesenchymal+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+%26+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial wound healing assay in an epithelial-mesenchymal co-culture system.</a> Wound Repair & Regeneration. 18 (1), 114-122 (2010).</li>
<li>Amit, M., Shariki, C., Margulets, V., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder+layer-and+serum-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells.</a> Biology of Reproduction. 70 (3), 837-845 (2004).</li>
<li>Vaheri, A., Mosher, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+molecular+weight%2C+cell+surface-associated+glyco-protein+%28fibronectin%29+lost+in+malignant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">High molecular weight, cell surface-associated glyco-protein (fibronectin) lost in malignant transformation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 516 (1), 1-25 (1978).</li>
<li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+fibrillogenesis%2C+a+cell-mediated+matrix+assembly+process%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin fibrillogenesis, a cell-mediated matrix assembly process.</a> Matrix Biology. 24 (6), 389-399 (2005).</li>
<li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states%3A+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 265-273 (2009).</li>
<li>Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibrillogenesis%3A+fibronectin%2C+integrins%2C+and+minor+collagens+as+organizers+and+nucleators%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).</li>
<li>Hunt, G. C., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tightening+the+connections+between+cadherins+and+fibronectin+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tightening the connections between cadherins and fibronectin matrix.</a> Developmental Cell. 16 (3), 327-328 (2009).</li>
<li>Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+The+evolution+of+human+pluripotent+stem+cell+culture%3A+from+feeder+cells+to+synthetic+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings.</a> Stem Cells. 31 (1), 1-7 (2013).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Vigilante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Extrinsic+versus+Intrinsic+Drivers+of+Variation+in+Cell+Behavior+in+Human+iPSC+Lines+from+Healthy+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identifying Extrinsic versus Intrinsic Drivers of Variation in Cell Behavior in Human iPSC Lines from Healthy Donors.</a> Cell Reports. 26 (8), 2078-2087 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השימוש ב- iPSCs למידול מחלות ובדיקת תרופות עתידיות יחד עם היישום האפשרי שלהם ברפואה מדויקת הופכים אותה לטכנולוגיה בעלת רלוונטיות רבה ומסיבה זו אנו מאמינים כי יש צורך להבין בבירור את מצב התרבות במבחנה הדומה יותר למצב הפיזיולוגי של תאי גזע עובריים. בהקשר זה, בדקנו ציפויי ECM שונים באמצעות iPSCs מסוג פראי כדי להבין את התנאים המאפשרים לתאים להישאר במצב בריא ולא מובחן. בנוסף לכך, נקודה קריטית היא התרבות של iPSCs ברכיבים קסנוגניים של MEFs ו- Matrigel שעשויים להסביר את השונות הניסויית בין משולשים וזה מעכב את היכולת לבצע מחקרים ...

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) מתקבלים מתאים סומטיים וניתן למיין אותם לסוגי תאים שונים. הם משמשים לעתים קרובות כמערכת למודל פתוגנזה של מחלות או לביצוע בדיקת תרופות, וגם מציעים את הפוטנציאל לשמש בהקשר של רפואה מותאמת אישית. מאז iPSCs יש פוטנציאל גדול, חשוב לאפיין אותם באופן מלא לשימוש כמערכת מודל אמין. בעבר הראינו את החשיבות של גידול תאי גזע פלוריפוסיים בסביבה היפוקסית, שכן תאים אלה מסתמכים על גליקוליזה וסביבה אירובית עלולה לגרום לחוסר איזון חמצון-חיזור1. תאי גזע פלוריפוטנטיים עצביים פגיעים גם לתנאי תרבית אחרים, במיוחד לסביבה החוץ-תאית. אופטימיזציה של תנאי התרבות היא נושא מרכזי כדי לשמור עליהם בריאים ומתרבים. תרבית iPSC בריאה תוביל לתאים ממוינים בריאים שהם בדרך כלל נקודת הקצה של המודל המשמש להבנת תכונות מולקולריות, תאיות ותפקודיות של הפרעות אנושיות ספציפיות או תהליכים תאיים.
במחקר זה, נעשה שימוש בפרוטוקול פשוט כדי לבדוק את המפגש של iPSCs באמצעות תנאי ציפוי שונים בבארות נפרדות. תאי גזע פלוריפוטנטיים דורשים שכבה מזינה של פיברובלסטים עובריים (MEF) כדי להתחבר כראוי, אך הדו-קיום של תאי גזע פלוריפוטנטיים ו-MEF מקשה על ביצוע אנליזה כמו RNA או מיצוי חלבונים מכיוון שקיימות שתי אוכלוסיות של תאים. על מנת להימנע משכבת ההזנה, חלבונים שונים השייכים למטריצה החוץ-תאית (ECM) שימשו כדי ליצור מחדש את נישת התאים הטבעית וכדי לקבל תרבית iPSC ללא הזנה. בפרט, Matrigel הוא תכשיר ממברנת מרתף מסולפת המופק מסרקומה של עכבר אנגלברט-הולם-נחיל (EHS), המועשרת בחלבוני מטריצה חוץ-תאית (כלומר, למינין, קולגן IV, פרוטאוגליקנים של הפראן סולפט, אנטקטין/נידוג'ן וגורמי גדילה)2,3. תנאי הציפוי האחרים המשמשים הם במקום זאת חלבונים מטוהרים עם רלוונטיות ידועה בבניית ה- ECMs: laminin-521 ידוע כמופרש על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) במסת התא הפנימית של העובר והוא אחד הלמינינים הנפוצים ביותר בגוף לאחר הלידה 4,5,6,7,8,9, 10,11; ויטרונקטין הוא מטריצת תרבית תאים נטולת קסנו-קסנו, הידועה כתומכת בצמיחה ובהתמיינות של hPSC 12,13,14,15,16; פיברונקטין הוא חלבון ECM החשוב להתפתחות בעלי חוליות ולחיבור ותחזוקה של תאי גזע עובריים במצב פלוריפוטנטי 17,18,19,20,21,22,23,24,25. מכיוון שתנאי ציפוי שונים זמינים, אנו משווים אותם מבחינת השפעתם על מפגש ה-iPSCs.

<table><tbody><tr><td>10 מ"ל צנרת סרולוגית רצועה, פוליסטירן, נייר/פלסטיק עטוף בנפרד,</td><td>קורנינג</td><td>סטרילי 4488</td><td>כלי</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילן (PP) בהירות גבוהה</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Tool</td></tr><tr><td>1x PBS (עם Ca2+; Mg2+)</td><td>Thermofisher</td><td>14040133</td><td>בינוני</td></tr><tr><td>1x PBS (ללא Ca2+; Mg2+)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>צנרת סרולוגית בינונית 5 מ"ל פסים, פוליסטירן, עטוף נייר/פלסטיק בנפרד,</td><td>קורנינג</td><td>סטרילי 4487</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-צלחת תרבית תאים, 96 WELL, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>תמיכה</td></tr><tr><td>בצלחת תרבית תאים, 6 באר</td><td>תמיכה ב-Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (גלוקוז בינוני - גבוה של עיט משונה של Dulbecco)</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr> בינוני <tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED4SS-500g</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>Epi אפיזומלי iPSC ערכת תכנות מחדש</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>מהיר - קרא 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td></td></tr><tr><td>Tool סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>בינוני</td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>Merck</td><td>FC010</td><td>ציפוי</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>G5516</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>H2O</td><td></td><td>MILLIQ</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermofisher</td><td>33342</td><td>ריאגנט</td></tr><tr><td>למינין 521</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>77003</td><td>ציפוי</td></tr><tr><td>L-גלוטמין (200 מ"מ)</td><td>מגיב LS25030081 Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning Matrigel hESC-Certified</td><td></td><td>Matrix 354277 ציפוי</td></tr><tr><td>עכבר פיברובלסטים עובריים (MEF)</td> <td>Life Technologies</td><td>A24903</td><td>ציפוי</td></tr><tr><td>MTESR1</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td> בינוניים <td>85851</td><td></td></tr><tr><td>תוסף MTESR1</td> בינוני <td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>85852</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין בינוני (10,000 U/mL)</td><td>מגיב Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>מגיב</td></tr><tr><td>ויטרונקטין</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>7180</td><td>ציפוי</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>סיגמא</td><td>Y0503</td><td>מגיב</td></tr></tbody></table>

מדידת המפגש של ipscs באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית.

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

מחקר זה מתמקד בהבנת האופן שבו גידול תאי גזע פלוריפוטנטיים על מצעי ציפוי ECM שונים יכול להשפיע על מפגש התאים. פרוטוקול להערכת מפגש iPSC בזמן אמת נקבע ללא צורך לספור תאים בתרחיף של תא בודד כדי למנוע כל הפרעה בגדילה. מערכת ניתוח תמונות בעלת תוכן גבוה שימשה להערכת מפגש iPCS על 4 ECMs שונים לאורך זמן באופן אוטומטי. הגדרות ניתוח שונות שימשו להערכת מפגש תאים של iPSCs דבקים ורק הבדל קל (ב 24 ו 48 שעות עם laminin) נצפתה אם מסכה 60, 80 או 100% הוחל. אנו גם מראים כי laminin להוביל את המפגש הטוב ביותר לעומת Matrigel, vitronectin ו fibronectin.

במחקר זה חקרנו את המפגש של תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) כאשר הם גדלים בתנאי ציפוי שונים. באמצעות ציטומטר, הצלחנו להשיג תוצאות אינפורמטיביות בקלות במשולשים תוך 5 ימים. מאחר שתאי גזע פלוריפוטנטיים כמעט ואינם נצמדים לכלי פלסטיק ויש צורך בציפוי כדי לתמוך בהתפשטותם, החלטנו לעקוב אחר המפגש של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, שכן הוא מעיד על בריאות תרבית התאים ועשוי לשקף את פוטנציאל ההתמיינות שלהם. לאחר התרחבות במבחנה, זרענו את ה-iPSCs על מצעי ECM שונים וניתחנו תאים על-ידי תצפית על תמונות הדגימה שנרכשו בשדה בהיר ושימוש בכתמי פאל...

מטרת הפרוטוקול היא להשוות בין תנאי ציפוי שונים של מטריצה חוץ-תאית (ECM) כדי להעריך כיצד ציפוי דיפרנציאלי משפיע על קצב הצמיחה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). בפרט, אנו שואפים ליצור תנאים להשגת צמיחה אופטימלית של תרביות iPSC.

מדידת המפגש של iPSCs באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר הערכה מהירה של מפגש תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרה על מצעי ציפוי מטריצה חוץ-תאיים שונים בזמן אמת. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא אינו דורש ספירת תרחיף של תא בודד, ובכך מונע הפרעה בגדילה ל-iPSCs, הרגישים למעבר. מי שתדגים את ההליך תהיה ולנטינה מגליוקה, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי.כדי להקים צלחות מצופות מטריצת קרום מרתף, יש לדלל את מטריצת קרום המרתף, להגדיר יחס של 1 עד 100 ב-DMEM, ולהוסיף 100 מיקרוליטר מהתמיסה המתקבלת לכל באר של צלחת של 96 בארות. לאחר שכל הבארות קודדו, הכניסו את הצלחת לאינקובטור תרבית התאים למשך שעה. בתום הדגירה יש להשליך את תמיסת מטריצת קרום המרתף, ולשטוף כל באר פעמיים עם 100 מיקרוליטר DMEM טרי לבאר.כדי להקים צלחות מצופות למינין, יש לדלל 20 מיקרוגרם למיליליטר למינין ב- PBS עם סידן ומגנזיום, ולהוסיף 100 מיקרוליטר מתמיסת הלמינין לכל באר של צלחת חדשה של 96 בארות. לאחר מכן דגרו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני שטיפת הבארות פעמיים עם DMEM טרי כפי שהודגם. כדי להגדיר צלחות מצופות ויטרונקטין יש לדלל 10 מיקרוגרם למיליליטר של ויטרונקטין במאגר דילול, ולהוסיף 100 מיקרוליטר של מאגר לכל באר של צלחת חדשה של 96 בארות.לאחר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר, יש לשטוף את הבארות עם 100 מיקרוליטר PBS ללא סידן ומגנזיום לבאר. להכנת צלחות מצופות פיברונקטין אנושיות, יש לדלל 30 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין במים מזוקקים כפולים, ולהוסיף 100 מיקרוליטר מתמיסת הפיברונקטין לכל באר של צלחת חדשה של 96 בארות. לאחר דגירה של 45 דקות בטמפרטורת החדר, שטפו את הבארות עם DMEM טרי כפי שהודגם.יומיים לפני הקמת תרבית iPSC, פיברובלסטים עובריים של עכברי זרעים בצפיפות של 2.4 על 10 עד 4 לסנטימטר רבוע במדיום תרבית תאים שלם לתוך כל אחת משתי בארות של צלחות תרבית תאים של שש בארות, ומניחים את הצלחות באינקובטור תרבית התאים. כדי להקים תרבית iPSC, יש לחמם תמיסת מלאי של iPSCs שמורים בהקפאה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים רק הופשרו, נקו את הבקבוקון עם 70% אתנול, והניחו את התאים בארון בטיחות ביולוגי.בעזרת פיפטה של 1000 מיקרוליטר, העבירו את התאים טיפה אחר טיפה לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מדיום תרבית תאים שחומם מראש. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה בארבעה מיליליטר של מדיום תרבית תאים טרי. לאחר מכן צלחת 1 על 10 עד התאים החמישיים לכל אחת משתי בארות של צלחות שש בארות זרעי פיברובלסטים עובריים של העכבר.לאחר הזריעה, יש להשלים את תרביות התאים ב-10 מיקרו-מולרים של מעכב ROCK Y-27632, ולהניח את הצלחות בחממת תרבית התאים למשך ארבעה עד חמישה שבועות. כאשר התאים מגיעים למפגש של 70 עד 80%, יש לטפל בכל תרבית במיליליטר אחד של 0.5 מילי-מולרי EDTA למשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. כאשר התאים התנתקו, פצלו את התאים ביחס של אחד לארבעה במדיום תרבית תאים טרי, וצלחו את התאים בכל אחת מארבע הבארות הנותרות של צלחת שש הבארות בתנאים ללא מזין.לאחר מכן החזירו את הצלחות לחממת תרבית התאים. כדי להעריך את ההשפעות של הציפויים השונים על מפגש התאים לאחר חודש לפחות של תרבית בתנאים ללא מזין, השתמש בשקופיות ספירה חד פעמיות כדי לספור את התאים מכל תרבית באמצעות תא ספירה. לדלל את התאים לאחד על 10 עד תא רביעי לכל 200 מיקרוליטר בריכוז בינוני, ולזרוע את התאים בשלוש פעמים לכל אחת משלוש הבארות של צלחת אחת מצופה כיסוי של 96 בארות לכל מצב.כאשר כל התאים מצופים, הניחו את הצלחות בחממת תרבית התאים למשך 24 שעות. למחרת ובכל יום במשך חמשת הימים הבאים, בצע הדמיה אוטומטית של התאים באמצעות הגדרות הניגודיות האוטומטית והחשיפה האוטומטית להדמיה אופטימלית. כדי להעריך את השינויים במיקוד עקב שבירת האור בגבול הבארות, הגדר את הגדרות הניתוח לניתוח מפגש כדי להחיל מסכה של 60, 80 או 100% לבאר, והשתמש בהגדרות ניתוח המסכות השונות כדי לנתח את מפגש התאים בכל נקודת זמן.כדי להשוות את ההבדלים הכוללים של תנאי הקידוד השונים, השתמש בנתוני המדגם כדי לבצע את מבחן ה-T של התלמיד, תוך דיווח על התוצאות הכמותיות כשינויים הממוצעים במפגש, פלוס או מינוס שגיאת התקן של הממוצע. לאפיון המיקרו-פילמנטים הציטו-שלדיים, ראשית, יש לתקן את התאים עם 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS לבאר למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שתי שטיפות של 10 דקות ב-200 מיקרוליטר PBS לכל כביסה. העבר את פתק הכיסוי שהוצב בעבר מהצלחת לשקופית המיקרוסקופ.הוסף 100 מיקרוליטר של סרום בקר 5% ו-0.1% טריטון ב-PBS לכל באר למשך שעה בטמפרטורת החדר כדי לחסום כל קשירה לא ספציפית, ושטוף את הדגימות בשתי שטיפות PBS של 10 דקות כפי שהודגם. לאחר הכביסה השנייה, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה מצומדת פלואידין לדגימה לדגירה של שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שתי שטיפות של 10 דקות ב-PBS. לאחר מכן, צבעו את הגרעינים עם Hoechst 33342 מדולל לריכוז של 1 עד 10,000 ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן שתי שטיפות PBS.לאחר הכביסה השנייה יש לשטוף את התאים במים ולתת לצלחות להתייבש מתחת למכסה המנוע הכימי. כאשר כיסוי הזכוכית התייבש, כסו את התאים ב-100 מיקרוליטר של מדיום הרכבה מתאים לכל באר, ואתרו את התאים במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר המצויד במקור לייזר אור לבן ולייזר דיודה של 405 ננומטר באורכי גל עירור ופליטה מתאימים. לאחר מכן בחר את מטרת טבילת השמן פי 63, ורכוש תמונות קונפוקליות עוקבות של התאים.צביעת פלואידין מאפשרת הדמיה של מידת הידבקות התאים לפני השטח של כלי ובאופן ספציפי, הציפוי המשמש לכלי. תאים הנצמדים לציפוי מדגימים מיקרופילמנטים ציטו-שלד הנראים בבירור במקום מיקרופילמנטים שקרסו. הדמיית Brightfield מאפשרת גם הדמיה של רמת ההידבקות של iPSCs למשטחים המצופים.iPSCs שנזרעו על למינין מדגימים קצב גבוה של התפשטות תאים בצורה ליניארית לאורך זמן בהשוואה לציפויים אחרים. לעומת זאת, תאים שנזרעו על מטריצת קרום המרתף, ויטרונקטין ופיברונקטין אנושי, מציגים קצב התפשטות ליניארי ב-96 השעות הראשונות עם שיפוע מוגבר בעקומת המפגש במהלך 24 השעות האחרונות ללא תלות במסכה בה נעשה שימוש. מכיוון שההבדל הראשוני ב-24 שעות עבור הציפויים השונים יכול לנבוע מהבדלים בחיבור התאים, ניתן לנרמל את צמיחת התאים לנתוני 24 שעות עבור נקודות הזמן המאוחרות יותר.כפי שנצפה, לא קיימים הבדלים מבחינת מפגש בין הציפויים השונים, מה שמרמז על כך שההבדלים שנצפו בתרביות מצופות למינין נובעים ככל הנראה מיכולת מוגברת של iPSCs להיצמד לציפוי זה בעת מעבר. מחקר זה עשוי לתרום לפיתוח מתודולוגיות סטנדרטיות לתרבית iPSCs, ועשוי לסייע בשימוש עתידי אפשרי בהם במרפאות. כיום אנו חוקרים את הביולוגיה של הקולטנים העיקריים על פני התא המתווכים מגעים בין תא ל-ECM ואשר עשויים להיות אחראים לשמירה על יכולת ההתחדשות העצמית שלהם.

measuring-the-confluence-of-ipscs-using-an-automated-imaging-system

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מפרט כיצד לכמת את מספר הסינפסות הן בתרבות העצבית הפרידו בסעיפים המוח באמצעות immunocytochemistry. שימוש ספציפי תא נוגדנים, אנו תווית מסופי presynaptic כמו גם באתרים של התמחות postsynaptic. אנו מגדירים סינפסות כנקודות של colocalization בין האותות שנוצר על ידי סמנים אלה.

סינפסות כימות: Assay Immunocytochemistry מבוססי לכמת מספר סינפסה

אנו מציגים מערכת מבוא מדגם אגל דיסקרטית לספקטרומטריית מצמידים אינדוקטיבי פלזמה המונית (ICPMS). הוא מבוסס על שבב microfluidic זול וחד פעמי שיוצר טיפות monodisperse ביותר בטווח גודל של 40-60 מיקרומטר בתדרים בין 90 ל -7,000 הרץ.

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

אנו מציגים פרוטוקול עבור היישום של interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופי (iPALM), שיטה מיקרוסקופית 3 ממדי מולקולה בודדת לוקליזציה סופר רזולוציה, אל ההדמיה של שלד התא יקטין בתאי יונקים חסידים. גישה זו מאפשרת הדמיה מבוססת אור של תכונות מבניות ננו שאחרת נותרו לא פתורים על ידי מיקרוסקופיה אופטית-מוגבל עקיפה קונבנציונלית.

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

בעבודה זו מדריך מעשי מסופק, המתאר את הצעדים השונים כדי להקים צימוד של מערכות SMPS ו- ICPMS, וכיצד להשתמש בהם. מוצגות שלוש דוגמאות תיאוריות.

מדריך מעשי על צימוד סריקה ניידות סורק ו מצמידים אינדוקטיבית פלזמה מסה ספקטרומטר (SMPS-ICPMS)

נוגדנים לאגד היעד הקולטנים על פני השטח של התא יכול להתייעץ קונפורמציה והשינויים קיבוץ באשכולות. שינויים דינמיים אלה יש השלכות על אפיון פיתוח תרופות בתאי המטרה. פרוטוקול זה מנצל מיקרוסקופיה קונפוקלית וספקטרוסקופיה של המתאם תמונה דרך ImageJ/פיג'י לכמת את מידת קולטן קיבוץ באשכולות על פני התא.

מיקרוסקופיה קונפוקלית מגלה התא קולטן משטח צבירת דרך התמונה המתאם ספקטרוסקופיה

כאן אנו מציגים מדריך מעשי של בניית מערכת משולבת מיקרוסקופ, אשר ממזג הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי הדמיה המבוססת על זיהוי סופר-ברזולוציה מולקולה בודדת, גילוי מולקולה בודדת צבע רב, כולל מולקולה בודדת פלורסצנטיות תהודה העברת האנרגיה הדמיה, לתוך הגדרת אחד באופן יעיל.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

אנו מציגים עבור זיהוי אופטי בזמן אמת של חלבונים יחיד ללא תווית פרוטוקול כפי שהם המופרשים מתאי חי. זה מבוסס על מיקרוסקופ interferometric פיזור (iSCAT), אשר יכול להיות מיושם למגוון רחב של מערכות ביולוגיות שונות ותצורות.

ללא תווית הדמיה של יחיד חלבונים מופרש מתאי חי דרך iSCAT מיקרוסקופ

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

היווצרות של רשת sarcomere נכונה חשובה להתבגרות של cardiomyocytes נגזר iPSC. אנו מציגים גישה מבוססת רזולוציה סופר המאפשרת הערכה כמותית של התבגרות מבנית של תאי גזע נגזר cardiomyocytes, כדי לשפר את תנאי התרבות קידום התפתחות הלב.

ניתוח רשת α-Actinin בקרדיומיוציטים אנושיים הנגזרים מ-iPSC באמצעות מיקרוסקופיה לתיאום מולקולה אחת

אנו מציגים שיטה לרכישת קורסי זמן לכתב פלואורסצנטי מתאים בודדים באמצעות מערכים micropatterned. הפרוטוקול מתאר הכנת מערכים חד-תאיים, התקנה ותפעול של מיקרוסקופיית זמן-לשגות של סריקת תאים חיים וכלי לניתוח תמונות בקוד פתוח לצורך בחירה מראש אוטומטית, בקרה חזותית ומעקב אחר קורסי זמן פלואורסצנטיים משולבים בתאים לכל אתר הידבקות.

הדמיית תא חי של מערכים חד-תאיים (LISCA) - טכניקה רב-תכליתית לכימות קינטיקה תאית

למדו הערכת צפיפות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר של צמיחת iPSCs על מצעי ECM שונים מבלי לפגוע בתהליך הגדילה.

מדידת המפגש של iPSCs באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית.

גלה סרטונים נוספים