Name: תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: למד שיטה מקבילה בניתוח DNA ברמת מולקולה בודדת לחקר קינטיקת חיתוך ספציפי לאתר. הפרוטוקול מודד עד 1000 מולקולות DNA בניסוי אחד ומספק נתונים סטטיסטיים מדויקים על פעילות אנזימטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן הלאומית למדע MCB-1715317.

1. הפיכת תא הזרימה
<ol><li>שטיפת כיסויים<ol>
<li>מקום מכסה צנצנות כתמים sonicate עם אתנול (EtOH), אז עם 1 M KOH (עבור 30 דקות כל אחד). כדי למנוע KOH משקעים ETOH, לשטוף ביסודיות עם ddH2O בין שטיפה.</li>
		<li>חזור על EtOH ועל שלבי השטיפה KOH 1x עבור מספר כולל של ארבע שטיפה (שני EtOH ושני KOH). לאחסן כיסויים נקיים בdH2O בצנצנות כתמים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חותכים את צינורות הטעינה והיציאה (באורך 8 ס"מ) באמצעות סכין גילוח נקי והכנסו לחורים בשקופית זכוכית נקייה. השתמש PE-20 עבור פנימה ו PE-60 לשקע. אפוקסי למשך 5 דקות כדי לאבטח את הצינורות ולקצץ את כל הצינורות העודפים. הערה: שקופיות זכוכית מודדות 2'' x 3'' x 1 מ"מ. חורים נקדחו בזוגות 15 מ"מ זה מזה. כל זוג יוצר כל קצה של ערוץ יחיד. הצינורות עם המזהה הקטן יותר משמשים להיכנס, כמו זה מפחית את נפח מת במעלה הזרם ולכן את זמן ערבוב הנדרש(איור 1).</li>
	<li>מסדרים בשורה ומחילים סרט דבק דו-צדדי חתוכים מראש עם תבנית ערוץ לגזור מעל חורים על מגלשת הזכוכית. החלק עם מלקות פלסטיק כדי להשיג חותם טוב. הערה: הקלטת הדו-צדדית המשמשת בניסוי זה היא בעובי של 120 μm, והערוצים ברוחב של 2 מ"מ ובאורך 15 מ"מ. ערוצים נחתכים באמצעות מדפסת סכין(טבלת חומרים). ניתן להתאים עד ארבעה ערוצים על כיסוי אחד. ראה איור 1 לקבלת תמונה של תא הזרימה.</li>
	<li>לאחר קילוף הגיבוי, למרוח כיסוי נקי (מיובש באוויר דחוס) על הסרט ולהחליק שוב עם מלקות פלסטיק עבור חותם טוב.</li>
	<li>כדי לאטום את תא הזרימה .ולתת לו לרפא</li>
</ol>2. הכנת דנ"א מסומן לרצועה
<ol><li>בצינור PCR, להכין 50 μL של תמהיל תגובת PCR המכיל 0.02 U /μL פולימראז DNA נאמנות גבוהה, 200 μM dNTPs, 0.5 μM פריימר קדימה, 0.5 μM פריימר הפוך, ו 250 ng של M13mp18 וקטור DNA. הערה: כאן, פריימר קדימה (ביוטין-CCAACTTATACGCGCCTTGC) פריימר הפוך (digoxigenin-TGACCATTAGATACATTTCGC) נבחרו להגביר אזור כ 1,000 bp ארוך, המשתרע מעמדות 6338 כדי 107 בגנום המעגלי של ה-DNA M13mp18. יש אתר אחד באמצע האזור ההתרופס. פריימר קדמי הוא 5ʹ עם digoxigenin, אשר קושר את אנטי-digoxigenin על כיסוי. פריימר הפוך הוא 5ʹ מתויג עם ביוטין, אשר קושר את החרוזים מצופה סטרפטוודין.</li>
	<li>הכנס את צינור ה- PCR לתרמוצ'יקלר ובצע את המחזור כפי שהוצג בטבלה 1.</li>
	<li>נקה את מוצר ה- PCR באמצעות ערכת ניקוי PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן. הערה: באמצעות הערכה שצוינה בטבלת החומרים , תפוקתה-DNA האופיינית היא ~ 2 μg.</li>
</ol>3. תחרש דנ"א וחרוזים
<ol><li>להכין 10 מ"ל של מאגר A (1 M Tris-HCl [pH = 7.5], 50 מ"מ NaCl, 2 מ"מ MgCl2, 1 מ"ג / מ"ל β-Casein, 1 מ"ג / מ"ל F-127 פלורוני). דגה בשואב אבק לפחות שעה אחת.</li>
	<li>כדי לתפקד תא זרימה, להזריק 25 μL של שברי FAB אנטי-digoxigenin (20 μg / מ"ל) ב PBS לתוך ערוץ הזרימה. השתמש בטיפים לטעינת ג'ל כדי להתאים לצינורות PE-60. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות.</li>
	<li>לאחר הדגירה, לשטוף את הערוץ על ידי משיכת 0.5 מ"ל של מאגר A דרך הערוץ באמצעות מזרק. תקחותי לא להכניס אוויר לערוץ.</li>
	<li>לאחר פונקציונליזציה, הר את תא הזרימה על מיקרוסקופ הפוך. לחבר את צינור שקע למשאבת מזרק ולשים את צינור מפרצון לתוך צינור microcentrifuge המכיל חוצץ A.</li>
	<li>משוך באופן ידני לפחות 0.5 מ"ל של מאגר A כדי לשטוף את המערכת ולהרים את המשאבה. תנו למשאבה לפעול ב-10 μL/min למשך 5 דקות לפחות כדי לצייד את המערכת.</li>
	<li>כדי להכין את החרוזים(טבלת חומרים),מערבולת בקבוק המניות של חרוזים ופיפטה 1.6 μL של 10 מ"ג / מ"ל חרוזי מניות לתוך 50 μL של מאגר A, אז מערבולת.</li>
	<li>באמצעות מפריד מגנטי, פיפטה החוצה המאגר וssspend ב 50 μL של מאגר A, ולאחר מכן מערבולת.</li>
	<li>חזור על שלב 3.7 2x עבור סך של שלוש שטיפה. לשטיפה האחרונה, resuspend ב 100 μL של מאגר A ומערבולת כדי להשיג ריכוז סופי של 160 μg / מ"ל.</li>
	<li>כדי לתמצת את ה-DNA והחרוזים, תחילה להכין 480 μL של 0.5 pM מסומן כמצע DNA במאגר A. לאחר מכן, פיפטה ב 20 μL של 160 μg / מ"ל השעיית חרוז, הקפד למערבולת החרוזים לפני pipetting. מניחים על מסובב למשך 3 דקות.</li>
	<li>לאחר 3 דקות, מיד לטעון לתוך ערוץ בקצב זרימה של 10 μL / דקה עבור ~ 15 דקות או עד מספיק חרוז קשור נצפתה. הערה: חרוזים לא צריך להיות כל כך צפוף ארוז שהם אינטראקציה אחד עם השני על פני השטח (ראה סעיף דיון).</li>
	<li>כדי לשטוף את הערוץ של כל החרוזים חינם, לעבור את צינור החירום לצינור טרי של חוצץ A ולזרום ב 50 μL / דקה לפחות 10 דקות או עד אין חרוזים רופפים נצפו.</li>
</ol>4. איסוף וניתוח נתונים
<ol><li>כדי להתכונן לאיסוף נתונים, הכן צינור הכנסה לתוך צינור microcentrifuge המכיל לפחות 100 μL של NdeI (0.25-4.00 U/mL) במאגר א' הנמך את המגנט הקבוע מעל ערוץ הזרימה, ומקם את מקור האור מחוץ לציר עבור הדמיה darkfield. הערה: שני מגנטים נדירים טבעתי כדור הארץ, אפוקסיחד, מוחזקים 8 מ"מ מעל פני השטח הפעיל של ערוץ הזרימה באמצעות הודעה אופטית cantilevered במהלך איסוף נתונים. מנורת צוואר אווז משמשת לקורס האור מחוץ לציר.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ מסחרי, מצלמת וידאו ותוכונת איסוף נתונים(טבלת חומרים). בתוכנה, לחץ על הכרטיסיה "חשיפה" והגדר "זמן חשיפה" ל- 10 ms. לחץ על "Timelapse" tab והגדר "ספירתתמונות " ל- 600, "משך" עד 20 דקות ו "מרווחזמן " ל- 2 שניות. לחץ על "הפעל" כדי להתחיל באיסוף נתונים.</li>
	<li>על משאבת מזרק, להגדיר את קצב הזרימה ל 150 μL / דקה ונפח הזרקה 80 μL. לחץ"לרוץ " ב 1 דקות לתוך איסוף נתונים. לאחר ההזרקה, כבה את המשאבה וסגור את השסתום כדי למנוע זרימה במהלך איסוף הנתונים.</li>
	<li>לאחר איסוף הנתונים, פתח את תוכנת ניתוח התמונה (Table of Materials). תחת הכרטיסיה "קובץ", בחר "ייבוא" | "רצף תמונה". אתר את קבצי התמונה בתפריט המוקפץ ולחץ על "פתח".</li>
	<li>הגדר את הסף על-ידי בחירה באפשרות "התאם את האחיזה"תחת התפריט הנפתח " תמונה ". השתמש בשורת המחוון כדי להגדיר את ערך הסף כדי לזהות נקודות בהירות המתאימות לחרוזים בתמונה.</li>
	<li>ספור את הנקודות הבהירות בכל מסגרת על-ידילחיצה על" נתח חלקיקים"בתפריט הנפתח " נתח". לחץOKעל " אישור ", ולאחר מכןבחר" כן " כדי לעבד את כל התמונות. שמור את קובץ התוצאות. הערה: אפשרות זו תשמור קובץ נתונים המכיל את מספר החרוזים בכל מסגרת וידאו מוקלטת.</li>
	<li>פתח את תוכנת ניתוח נתונים (טבלת חומרים) וייבוא קובץ התוצאות על-ידי לחיצה על "ייבואמקובץטקסט " בתפריט הנפתח " קובץ ". התווה את נתוני ספירת החרוזים לעומת הזמן.</li>
	<li>התאם את מספר החרוזים לעומת הזמן על-ידי לחיצה על "התאמהעקומה"בתפריט הנפתח " נתח ". בחר את המשוואה "מעריך טבעי" ולחץ על "נסה להתאים" | "בסדר" .כן,בסדר. הערה: יש לכלול רק את הנתונים שנרשמו לאחר הזרקת הדגימה באזור ההתאמה. פרמטר ההתאמה במעריך של פונקציית ההתאמה יהיה קצב המחשוף.</li>
</ol>

<ol><li>Tock, M. R., Dryden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+restriction+and+anti-restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biology of restriction and anti-restriction.</a> Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).</li>
<li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR%2FCas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li>
<li>Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+II+restriction+endonucleases%3A+structure+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li>
<li>Sadowski, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+genetic+recombination%3A+hops%2C+flips%2C+and+flops%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops.</a> The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).</li>
<li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+receptor+genes+and+the+evolution+of+a+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase.</a> Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).</li>
<li>Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn7%3A+a+target+site-specific+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tn7: a target site-specific transposon.</a> Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).</li>
<li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+and+Specificity+of+CRISPR%2FCas9+Genome+Editing+Technologies+for+Human+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy.</a> Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).</li>
<li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).</li>
<li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALENs%3A+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li>
<li>Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+stopped-flow+kinetics+of+the+cleavage+of+synthetic+oligodeoxynucleotides+by+the+EcoRI+restriction+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease.</a> Biochemistry. 28 (19), 7879-7888 (1989).</li>
<li>Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+fluorescent+assay+for+real-time+monitoring+site-specific+DNA+cleavage+by+EcoRI+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease.</a> Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).</li>
<li>Becker, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+reveals+rules+for+target+RNA+binding+and+cleavage+by+AGO2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2.</a> Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).</li>
<li>vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+DNA+coiling+enhances+target+localization+by+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">How DNA coiling enhances target localization by proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).</li>
<li>Gambino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+assay+for+measuring+site-specific+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage.</a> Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409(2016).</li>
<li>van Aelst, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+III+restriction+enzymes+cleave+DNA+by+long-range+interaction+between+sites+in+both+head-to-head+and+tail-to-tail+inverted+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).</li>
<li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li>
<li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li>
<li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Journal%22%5BJournal%5D)">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22(2014).</li>
<li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726(2019).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

הפרוטוקול יכול לשמש כדי למדוד את הקינטיים של כל מערכת SSDC, בתנאי שהפרדת הגדיל נצפתה במהלך הניסוי. זיהוי המחשוף מושפע מהתבוננות בניתוק החרוז הרצועה ולכן מסמן את מידת הפרדת הגדילים. כל השלבים הקודמים מתרחשים לפני זיהוי המחשוף; לכן, רק זמן המעבר הכולל נרשם.
כיסוי תא הזרימה הוא פונקציונלי באמצעות ספיגה לא ספציפית של חלבון נוגדן לזכוכית נקייה. זכוכית לא מנוקה מספיק עלולה להשפיע על כריכת הנוגדן. ברצועה, צפיפות חרוזים צריכה להיות נמוכה מספיק, כך חרוזים לא אינטראקציה. צפיפות פני השטח של נקודות מצורף ...

מחשוף DNA ספציפי לאתר (SSDC) הוא צעד מפתח בעסקאות גנומיות רבות. לדוגמה, שינוי הגבלה חיידקית (RM)1 ומערכות CRISPR2 להגן על תאים מפני התקפה על ידי phages ופלסמידים על ידי זיהוי ומחשוף של DNA זר ברפים ספציפיים. בסוג II RM, אנדונוקלאס הגבלת (REs) לזהות רצפים קצרים 4-8 בסיס זוג בסיס (bp) באמצעות אינטראקציות חומצה גרעיןחלבון 3. אנדונוקלאסים המשויכים CRISPR, כגון Cas9, לאגד לאתרים באמצעות הכלאה של אתר היעד עם crRNAs מאוגדים endonucleases4. יצירת הפסקות תקועות כפולות ספציפיות לאתר (DSBs) הן גם הצעד הראשון באירועי שילוב DNA רבים5. לדוגמה, המגוון של אזורי איגוד אנטיגן שנוצרו על-ידי V(D)J שילוב דורש זיהוי ומחשוף של אתרי יעד ספציפיים6. כמה transposons ידועים למקד רצפי DNA ספציפיים, כמוגם 7. באופן לא מפתיע, גרעין ספציפי לאתר רבים המעורבים בתהליכים אלה, כגון Cas9, הם מרכיב מרכזי בטכנולוגיות עריכתגנים 8. בנוסף, אנדונוקליאות חדשניות ספציפיות לאתר (כלומר, גרעין אצבעאבץ 9 ו-TALENS10)הונדסו גם הן לעריכת גנומים.
שיטות רבות נוהל כדי למדוד את הקינטיים של מחשוף ספציפי לאתר של חומצות גרעין. אלה כוללים ניתוח ג'ל,פלואורסצנס 11,12, ושיטות מבוססות רצף13. התקדמות משמעותית הושגה עם רצועה של microbeads, המאפשר DSBs במולקולות יחיד של ה-DNA להתגלות על ידי התנועה של חרוז לאחר הפרדת גדיל. בשיטות אלה, סוגים שונים של כוחות מועסקים כדי להבטיח את הפרדת הגדיל ואת התנועה של החרוז לאחר המחשוף. במקרה אחד, מלכודות אופטיות שימשו כדי למדוד מחשוף של ה-DNA על ידי EcoRV14. בניסויים אלה, חיפוש היעד הוא מטרת החקירה, עם תנאים ממוטבים כך שאיגוד ספציפי לאתר הוא השלב המגביל את הקצב. חסרון אחד של מלכודות אופטיות הוא שרק DNA אחד ניתן לצפות בכל פעם. בנוסף, יש להחיל כוח משיכה גדול תקופתי כדי לבדוק את הפרדת הגדיל.
טכניקה נוספת משתמשת בשילוב של זרימה וכוחות מגנטיים חלשים כדי למשוך את החרוז באופן רציף15. בדרך זו, מחשוף מוגבל דיפוזיה על ידי NdeI נמדד. השיטה המועסקת מאפשרת מדידה בו זמנית של כמה מאות DNAs בבת אחת, המאפשר משמעות סטטיסטית להיות מושגת בניסוי אחד. ניסויים המבוססים על פינצטה מגנטית שימשו גם כן. במחקר אחד כזה, integrase רטרוויראלי נחקר על ידי הכללת DSB בהחדרת אוליגונוקלאוטיד16. שילוב מוצלח הביא להתאגדות של DSB ב-DNA קשור ואובדן של החרוז המצורף. במחקר דומה של EcoPI הגבלת אנדונוקליאז סוג III תלוי ATP, עשרות DNAs נצפו בניסוי יחיד17. פינצטה מגנטית להחזיק את היתרון כי מתח, כמו גם לולאות DNA, ניתן לשלוט ולפקח במהלך התגובה.
מוצג כאן היא שיטת מולקולה אחת מקבילה מאוד למדידת קינטיקה SSDC, אשר מנצל את השיפורים האחרונים ברצועה בקנה מידה גדול של DNAs. שיטה זו היא שיפור והרחבה של שיטות קודמות המשמשות למדד שכפול DNA18, אורך קווי מתאר של DNA19, ומחשוף על ידי REs15. בטכניקה זו, DNAs ליניארי המכיל עותק יחיד של רצף הזיהוי מוכנים עם ביוטין בקצה אחד digoxigenin בצד השני. הביוטין קושר סטרפטאבידין, המחובר באופן קוולנטי למיקרו-חרוז פארמגנטי. תסביכות חרוזי ה-DNA מוזרקים לערוץ מיקרו-נוזלים שתפקד עם שברי FAB אנטי-דיגוקסיג'ין. ה-DNA לאחר מכן קשור אל פני השטח נקודות מצורף באמצעות איגוד של digoxigenin לשבבי FAB adsorbed. כוחות מגנטיים חלשים המיושם עם מגנט קבוע לשמור על החרוז מדבק באופן לא ספציפי על פני השטח. ניתן להזריק דגימות במהירות (<30 s) לתוך ערוץ הזרימה כדי להפעיל את תגובת המחשוף. הזרימה מבוטלת במהלך איסוף נתונים. כאשר כל דנ"א מחשוף, ניתן לקבוע את זמן המחשוף המדויק על ידי הקלטת המסגרת שבה החרוז נע למעלה והחוצה מהתוכנית המוקדית של המטרה, ובכך להיעלם מרמת הקלטה. ניתן להשתמש בספירה של מסגרת אחר מסגרת של חרוזים שנותרו כדי לכמת את התקדמות התגובה.
מוצג להלן הפרוטוקול המלא, כמו גם נתונים לדוגמה שנאספו באמצעות NdeI. כדוגמה לאופן שבו ניתן ליישם את הטכניקה, שיעורי מחשוף עבור מגוון ריכוזי חלבון נמדדים בשני ריכוזים שונים של מגנזיום, cofactor מתכת חיוני. למרות יישום זה של הפרוטוקול משתמש NdeI, השיטה יכולה להיות מותאמת לשימוש עם כל גרעין ספציפי לאתר על ידי שינוי עיצוב ה-DNA של הצוללת.

<table><tbody><tr><td>5 דקות אפוקסי</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-דיגוקסיגנין FAB שברי Roche</td><td>Diagnostics</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה ותוכנה</td><td>Jenoptik</td><td>GRYPHAX SUBRA</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח נתונים</td><td>Vernier Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרט דו צדדי</td> LP <td>Grace Biolabs</td><td>SA-S-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos פוספט חוצץ</td><td>מי מלח קורנינג</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 95%</td> <td>VWR</td><td>89370-082</td><td></td></tr><tr><td>פריימר קדימה: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לניתוח תמונה</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>מדפסת סכין Nikon</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>צללית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13mp18 DNA</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>MyOne חרוזי סטרפטווידין</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>NdeI אנזים</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>ערכת</td> <td>ניקוי PCRQiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>פלורוני F-127</td><td>Anatrace</td><td>P305</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליאתילן PE-20</td> BD <td></td> צינורות פוליאתילן 427406 <td></td><td>אינטרמדיק</td></tr><tr><td>PE-60</td><td>BD Intramedic</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Mastermix</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>מגנט אדמה נדירה 0.5 אינץ' OD 0.25 אינץ' מזהה</td><td>יבוא לאומי</td><td>NSN0814</td><td></td></tr><tr><td>מגנט אדמה נדיר 0.75 אינץ' OD 0.5 אינץ' ID</td><td>יבוא לאומי</td><td>NSN0615</td><td></td></tr><tr><td>פריימר הפוך: ביוטין-TGACCATTAGATACATTTCGC</td> טכנולוגיות <td>DNA משולבות</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>ג'יני פלוס</td><td></td></tr><tr><td>&בטא;-קזאין מחלב בקר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C6905</td><td></td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית assay עבור מחשוף dna ספציפי לאתר

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

מחשוף DNA ספציפי לאתר (SSDC) הוא צעד מפתח בתהליכים סלולריים רבים, והוא חיוני לעריכת גנים. עבודה זו מתארת תסה קינטית המסוגלת למדוד SSDC במולקולות DNA יחיד רבות בו זמנית. DNAs של הצוללת עם חרוזים, שכל אחד מהם מכיל עותק יחיד של רצף היעד, מוכנים בערוץ זרימה מיקרו-נוזל. מגנט חיצוני מפעיל כוח חלש על החרוזים הפרמגנטיים. ניתן לפקח על שלמותם של עד 1,000 DNAs בודדים על-ידי הדמיית המיקרו-חרוזים תחת הדמיית Darkfield באמצעות מטרה רחבת-שדה, הגדלה נמוכה. הזרקת אנדונוקליז הגבלה, נדול, יוזמת את תגובת המחשוף. מיקרוסקופ וידאו משמש כדי להקליט את הרגע המדויק של כל מחשוף DNA על ידי התבוננות במסגרת שבה החרוז המשויך נע למעלה והחוצה של מישור המוקד של המטרה. ספירת חרוזים פריים אחר תמונה מכמתת את התגובה, והתאים מעריכי קובע את קצב התגובה. שיטה זו מאפשרת איסוף של נתונים כמותיים ומשמעותיים סטטיסטית על מולקולה אחת תגובות SSDC בניסוי יחיד.

באמצעות טכניקה זו, שיעורי SSDC של NdeI נמדדו עבור מגוון של ריכוזי חלבון (0.25-4.00 U/mL) בשני ריכוזים שונים של מגנזיום (2 mM ו 4 mM). כל אחד מהתנאים הללו שוכפל לפחות פעמיים, עם כמה מאות עד 1,000 DNAs קשורים לכל ניסוי. איור 2 מתאר את העיצוב הניסיוני. איור 3 מציג דוגמאות של פרטי איסוף וניתוח נתונים. איור 4 ממחיש כיצד הקצב תלוי בריכוז החלבון בשני ריכוזי המגנזיום. ניתן לצפות כי בריכוזי חלבון נמוכים מספיק, הקצב הוא פרופורציונלי לחלבון ול...

שיטה מקבילה מאוד למדידת המחשוף הספציפי לאתר של ה-DNA ברמת מולקולה אחת מתוארת. פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה באמצעות ההגבלה אנדונוקלאז Nde. ניתן לשנות את השיטה בקלות כדי ללמוד כל תהליך שתוצאות מחשוף DNA ספציפי לאתר.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל תהליך שתוותו הפסקות DNA תקועות כפולות, מניב נתונים כמותיים מפורטים על קינטיקה. למרות שלשיטה זו יש רזולוציית מולקולה אחת, היא מודדת עד 1000 DNAs בניסוי אחד, ובכך מספקת סטטיסטיקה טובה. היישום העיקרי של שיטה זו הוא ללמוד את המנגנונים המעורבים מחייב DNA ושינוי.לדוגמה, אנו מעוניינים לחקור חיפוש יעד DNA, אשר רלוונטי לכל החלבונים מחייב DNA. כאשר מנסים טכניקה זו בפעם הראשונה, זכור כי tethers מולקולה אחת הם עדינים, פעם צורה, יש לטפל בזהירות. חלקם הנכון של משטחים פונקציונליים הוא חיוני.יש כמה טריקים כדי להפוך את הזרימה כל כך. בנוסף להחלפת צינורות לדוגמה במהלך איסוף נתונים, הדגמה חזותית יכולה לעזור למישהו חדש בהליך זה. כדי לשטוף את החלקות הכיסוי, מניחים אותם בצנצנות מכתים ומניקים אותם באתנול במשך 30 דקות.ביסודיות לשטוף אותם עם מים deionized מזוקק, ולאחר מכן לטבול אותם אחד טוחנת אשלגן הידרוקסיד sonicate אותם במשך 30 דקות נוספות. חזור על רצף לשטוף, הקפד לשטוף את הכיסוי מחליק עם מים לאחר כל לשטוף. לאחסן את החלקות כיסוי ניקה בצנצנות מכתים עם מים.השתמש סכין גילוח נקי לחתוך שמונה סנטימטר ארוך טעינה ולצאת צינורות, ולהכניס אותם לתוך חורים במגלשת זכוכית נקייה. אפוקסי צינורות ולתת תרופה במשך חמש דקות כדי לאבטח אותו. החל קלטת דו צדדית מראש לחתוך עם דפוס הערוץ על שקופיות זכוכית, ולהחליק אותו עם מדפים פלסטיק כדי להשיג חותם טוב.מקלפים את הגיבוי מהקלטת, ולהחיל להחליק כיסוי נקי, מחליק אותו עם המדפים. לאחר מכן, אפוקסי קצה הכיסוי להחליק לאטום את תא הזרימה ולתת לו לרפא. הכן את הדנ"א המסווים לקשור על ידי ביצוע PCR בהתאם לכיווני כתב היד.לאחר מכן לטהר את מוצר PCR עם ערכת ניקוי PCR. הכינו 10 מיליליטר של חיץ א', ודגמים אותו בביוב ואקום למשך שעה אחת לפחות. כדי לתפקד את תא הזרימה, להזריק 25 microliters של חלקיקים אנטי digoxigenin ו fab ב PBS, לתוך ערוץ הזרימה, באמצעות קצה טעינת ג'ל כדי להתאים צינורות PE60.דגירה תא הזרימה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, למשוך 0.5 מיליליטר של חיץ A דרך הערוץ עם מזרק, דואג לא להציג אוויר לתוך הערוץ. לאחר מכן, הר תא הזרימה על מיקרוסקופ הפוך.חבר את צינור השקע למשאבת מזרק, והכנס את צינור הכניסה לצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל חיץ A.Manually למשוך לפחות 0.5 מיליליטר של חיץ A כדי לשטוף את המערכת ואת ראש המשאבה. לאחר מכן תן למשאבה לפעול ב-10 מיקרוליטרים לדקה למשך חמש דקות לפחות כדי לצייד את המערכת. Vortex בקבוק מלאי של חרוזים, ו pipette 1.6 microliters של חרוזים לתוך 50 microliters של חיץ A, ואז מערבולת אותם שוב.מניחים את חרוזים על מפריד מגנטי פיפטה החוצה את המאגר. להשעות אותם מחדש ב 50 microliters של חיץ A ומערבולת אותם. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את חרוזים ב 100 microliters של חיץ A עבור ריכוז סופי של 160 מיקרוגרם למיליליטר.הכינו 480 מיקרוליטרים של מצע דנ"א מסומן 0.5 פיקומולר במאגר A, ופיפט 20 מיקרוליטרים של השעיית חרוזים לדנ"א המדולל. מניחים את התערובת על מסובב במשך שלוש דקות. לאחר שלוש דקות, מיד לטעון את המדגם לתוך התעלה בקצב זרימה של 10 microliters לדקה במשך 15 דקות, או עד חבלה חרוז מספיק נצפתה.לשטוף את הערוץ של כל חרוזים חינם על ידי החלפת צינור inlet לצינור טרי של חיץ A, וזורם אותו ב 50 microliters לדקה לפחות 10 דקות או עד שום חרוזים רופפים נצפו. וזה מועיל להשתמש בשסתום מוטבע כדי לנתק את הזרימה ולהחליף את הצינורות. החלפת צינורות בתנועה חלקה אחת ולוודא רמות נוזלים צינורות מדגם חדשים וישנים להתאים כדי למנוע זרימה אחורית.לפני איסוף הנתונים, להכין את הריכוז הנכון של אנזים מחשוף DNA, ולהכניס את צינור הכניסה לתוך המדגם. מנמיך את המגנט מעל תא הזרימה. הגדר את המשאבה להזריק 80 microliters של מדגם ב 150 microliters לדקה ולהתחיל איסוף נתונים.דקה אחת לתוך איסוף נתונים, להפעיל את המשאבה. מוצגת כאן תמונה מייצגת של חרוזים קשורות לפני ואחרי התגובה. ניתוח נתונים בוצע כדי לכמת את מספר חרוזים שנותרו קשורות לאורך כל תגובת המחשוף.טכניקה זו שימשה למדידת שיעורי מחשוף הדנ"א הספציפיים לאתר של Nde1 עבור ריכוזי חלבונים הנעים בין 0.25 לארבע יחידות למיליליטר, ושני ריכוזים שונים של מגנזיום. כל מצב שוכפל לפחות פעמיים, עם כמה 100 עד 1000 DNA קשור הוא לכל ניסוי. בריכוזי חלבון נמוכים מספיק, השיעור פרופורציונלי לחלבון ולא תלוי במגנזיום.עבור ריכוזי חלבון גבוהים, השיעור תלוי במגנזיום, אך אינו תלוי בריכוז החלבון. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי בועות אוויר בערוץ צינורות וזרימה יכול להפעיל את הניסוי. הקפד לא לאפשר כל אוויר לתוך הקווים בעת החלפת צינורות, ו degas כל המאגרים לפני השימוש.שיטת החבל מאפשרת לחקור את השפעת המתח בדנ"א על התגובה. זה יכול להיות מושגת על ידי שינוי חוזק המגנט או החלת זרימה במהלך איסוף נתונים.

parallel-high-throughput-single-molecule-kinetic-assay-for-site

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

קורסי זמן לפעילות glycosylase של glycosylase-DNA של 8 oxoguanine הם biphasic מפגין פרץ של היווצרות מוצר ושלב מצב יציב ליניארי. תוך שימוש בטכניקות להרוות-זרימה, פרץ וניתן למדוד את שיעורי המצב יציב, אשר תואמות לכריתה של 8-oxoguanine ושחרורו של glycosylase מ-DNA של המוצר, בהתאמה.

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase

אנו מתארים מבחנים לא רציפים רגישים מבוססי ג'ל כדי לבחון את הקינטיקה של התחלת גדיל מפגר באמצעות חלבוני השכפול של בקטריופאג' T7.

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי חלבונים שכפול bacteriophage T7

פרוטוקול זה מדגים תפוקה גבוהה, עמיד ופשוט מולקולה בודדת מתיחה-זרימה assay עבור לומדת מימדי דיפוזיה (1 ד) של מולקולות לאורך הדנ א.

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת במדויק מספר שינויים גנטיים של אזור היעד בתגובה יחיד באמצעות מסירה ddPCR וזוג הידרוליזה הגששים ייחודי.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

באמצעות DNA המסומן בנקודות קוונטיות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת, אנו יכולים לחקור את מנגנון התגובה של אנדונוקלאזות הגבלה תוך שימוש בחלבון ללא תווית. טכניקה זו של מולקולה בודדת מאפשרת תצפית מאסיבית מרובבת של אינטראקציות חלבון-דנ"א בודדות, וניתן לאסוף נתונים כדי ליצור התפלגות זמן מגורים מאוכלסת היטב.

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

SAMHD1 הוא deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase עם תפקידים קריטיים בבריאות האדם ובמחלות. כאן אנו מציגים בדיקת פעילות רב-תכליתית של SAMHD1 מצומדת אנזימים, הפרוסה בפורמט מיקרו-צלחות של 384 בארות, המאפשרת הערכה של מולקולות קטנות ואנלוגים של נוקלאוטידים כסובסטרטים, מפעילים ומעכבים של SAMHD1.

בדיקת פעילות מצומדת אנזימים בתפוקה גבוהה לבדיקת אינטראקציה של מולקולות קטנות עם dNTPase SAMHD1

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.

שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין

אנו מציגים פרוטוקולים להערכת מיומנות מסלול תיקון שבר גדיל כפול בתאים באמצעות חבילה של מצעי כתב חוץ-כרומוזומליים מבוססי לומינסנציה.

הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

פרוטוקול זה מתאר בדיקת שכפול DNA חד-מולקולה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות בין פולימראזות DNA ומכשולים כגון מבני G-quadruplex.

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes

למד שיטה מקבילה בניתוח DNA ברמת מולקולה בודדת לחקר קינטיקת חיתוך ספציפי לאתר. הפרוטוקול מודד עד 1000 מולקולות DNA בניסוי אחד ומספק נתונים סטטיסטיים מדויקים על פעילות אנזימטית.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

גלה סרטונים נוספים