תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל תהליך שתוותו הפסקות DNA תקועות כפולות, מניב נתונים כמותיים מפורטים על קינטיקה. למרות שלשיטה זו יש רזולוציית מולקולה אחת, היא מודדת עד 1000 DNAs בניסוי אחד, ובכך מספקת סטטיסטיקה טובה. היישום העיקרי של שיטה זו הוא ללמוד את המנגנונים המעורבים מחייב DNA ושינוי.

לדוגמה, אנו מעוניינים לחקור חיפוש יעד DNA, אשר רלוונטי לכל החלבונים מחייב DNA. כאשר מנסים טכניקה זו בפעם הראשונה, זכור כי tethers מולקולה אחת הם עדינים, פעם צורה, יש לטפל בזהירות. חלקם הנכון של משטחים פונקציונליים הוא חיוני.

יש כמה טריקים כדי להפוך את הזרימה כל כך. בנוסף להחלפת צינורות לדוגמה במהלך איסוף נתונים, הדגמה חזותית יכולה לעזור למישהו חדש בהליך זה. כדי לשטוף את החלקות הכיסוי, מניחים אותם בצנצנות מכתים ומניקים אותם באתנול במשך 30 דקות.

ביסודיות לשטוף אותם עם מים deionized מזוקק, ולאחר מכן לטבול אותם אחד טוחנת אשלגן הידרוקסיד sonicate אותם במשך 30 דקות נוספות. חזור על רצף לשטוף, הקפד לשטוף את הכיסוי מחליק עם מים לאחר כל לשטוף. לאחסן את החלקות כיסוי ניקה בצנצנות מכתים עם מים.

השתמש סכין גילוח נקי לחתוך שמונה סנטימטר ארוך טעינה ולצאת צינורות, ולהכניס אותם לתוך חורים במגלשת זכוכית נקייה. אפוקסי צינורות ולתת תרופה במשך חמש דקות כדי לאבטח אותו. החל קלטת דו צדדית מראש לחתוך עם דפוס הערוץ על שקופיות זכוכית, ולהחליק אותו עם מדפים פלסטיק כדי להשיג חותם טוב.

מקלפים את הגיבוי מהקלטת, ולהחיל להחליק כיסוי נקי, מחליק אותו עם המדפים. לאחר מכן, אפוקסי קצה הכיסוי להחליק לאטום את תא הזרימה ולתת לו לרפא. הכן את הדנ"א המסווים לקשור על ידי ביצוע PCR בהתאם לכיווני כתב היד.

לאחר מכן לטהר את מוצר PCR עם ערכת ניקוי PCR. הכינו 10 מיליליטר של חיץ א', ודגמים אותו בביוב ואקום למשך שעה אחת לפחות. כדי לתפקד את תא הזרימה, להזריק 25 microliters של חלקיקים אנטי digoxigenin ו fab ב PBS, לתוך ערוץ הזרימה, באמצעות קצה טעינת ג'ל כדי להתאים צינורות PE60.

דגירה תא הזרימה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, למשוך 0.5 מיליליטר של חיץ A דרך הערוץ עם מזרק, דואג לא להציג אוויר לתוך הערוץ. לאחר מכן, הר תא הזרימה על מיקרוסקופ הפוך.

חבר את צינור השקע למשאבת מזרק, והכנס את צינור הכניסה לצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל חיץ A.Manually למשוך לפחות 0.5 מיליליטר של חיץ A כדי לשטוף את המערכת ואת ראש המשאבה. לאחר מכן תן למשאבה לפעול ב-10 מיקרוליטרים לדקה למשך חמש דקות לפחות כדי לצייד את המערכת. Vortex בקבוק מלאי של חרוזים, ו pipette 1.6 microliters של חרוזים לתוך 50 microliters של חיץ A, ואז מערבולת אותם שוב.

מניחים את חרוזים על מפריד מגנטי פיפטה החוצה את המאגר. להשעות אותם מחדש ב 50 microliters של חיץ A ומערבולת אותם. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את חרוזים ב 100 microliters של חיץ A עבור ריכוז סופי של 160 מיקרוגרם למיליליטר.

הכינו 480 מיקרוליטרים של מצע דנ"א מסומן 0.5 פיקומולר במאגר A, ופיפט 20 מיקרוליטרים של השעיית חרוזים לדנ"א המדולל. מניחים את התערובת על מסובב במשך שלוש דקות. לאחר שלוש דקות, מיד לטעון את המדגם לתוך התעלה בקצב זרימה של 10 microliters לדקה במשך 15 דקות, או עד חבלה חרוז מספיק נצפתה.

לשטוף את הערוץ של כל חרוזים חינם על ידי החלפת צינור inlet לצינור טרי של חיץ A, וזורם אותו ב 50 microliters לדקה לפחות 10 דקות או עד שום חרוזים רופפים נצפו. וזה מועיל להשתמש בשסתום מוטבע כדי לנתק את הזרימה ולהחליף את הצינורות. החלפת צינורות בתנועה חלקה אחת ולוודא רמות נוזלים צינורות מדגם חדשים וישנים להתאים כדי למנוע זרימה אחורית.

לפני איסוף הנתונים, להכין את הריכוז הנכון של אנזים מחשוף DNA, ולהכניס את צינור הכניסה לתוך המדגם. מנמיך את המגנט מעל תא הזרימה. הגדר את המשאבה להזריק 80 microliters של מדגם ב 150 microliters לדקה ולהתחיל איסוף נתונים.

דקה אחת לתוך איסוף נתונים, להפעיל את המשאבה. מוצגת כאן תמונה מייצגת של חרוזים קשורות לפני ואחרי התגובה. ניתוח נתונים בוצע כדי לכמת את מספר חרוזים שנותרו קשורות לאורך כל תגובת המחשוף.

טכניקה זו שימשה למדידת שיעורי מחשוף הדנ"א הספציפיים לאתר של Nde1 עבור ריכוזי חלבונים הנעים בין 0.25 לארבע יחידות למיליליטר, ושני ריכוזים שונים של מגנזיום. כל מצב שוכפל לפחות פעמיים, עם כמה 100 עד 1000 DNA קשור הוא לכל ניסוי. בריכוזי חלבון נמוכים מספיק, השיעור פרופורציונלי לחלבון ולא תלוי במגנזיום.

עבור ריכוזי חלבון גבוהים, השיעור תלוי במגנזיום, אך אינו תלוי בריכוז החלבון. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי בועות אוויר בערוץ צינורות וזרימה יכול להפעיל את הניסוי. הקפד לא לאפשר כל אוויר לתוך הקווים בעת החלפת צינורות, ו degas כל המאגרים לפני השימוש.

שיטת החבל מאפשרת לחקור את השפעת המתח בדנ"א על התגובה. זה יכול להיות מושגת על ידי שינוי חוזק המגנט או החלת זרימה במהלך איסוף נתונים.