הגברה איזותרמית בתיווך לולאה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ואישור סלמונלה מבידוד תרבות
20 במאי 2020
הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP) היא מבחן הגברה של חומצת גרעין (iNAAT) אשר משך עניין נרחב בתחום זיהוי הפתוגן. כאן, אנו מציגים פרוטוקולסלמונלה LAMP מרובה מעבדות כשיטה מהירה, אמינה וחזקה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ולאימות סלמונלה חזקה מבידוד תרבותי.
שיטת LAMP זו של סלמונלה שולבה במדריך האנליטי הבקטריולוגי של ה-FDA, הן כשיטת סינון במזון מן החי והן כשיטת אישור לכל מבודדי סלמונלה משוערים. השיטה מהירה, אמינה וחזקה. בהשוואה ל-PCR, היתרונות העיקריים שלו כוללים בדיקות מהירות, מכשור פשוט, שיעור שלילי שווא נמוך וזרימת עבודה גמישה.
בדיקה מהירה לפתוגנים כמו סלמונלה ממלאת תפקיד חשוב בזיהוי מהיר של מוצר שעלול להיות מזוהם ויכולה למנוע מחלות או התפרצויות בבני אדם ובעלי חיים. התחל בהכנת תבניות DNA לבדיקת LAMP. ישנם שני סוגים של דגימות המשמשות לייצור תבניות דנ"א.
להכנת תבניות מדגימות מזון מן החי, שקלו אספטית 25 גרם של דגימת מזון לשקית סינון סטרילית. הוסיפו לשקית 225 מיליליטר של מי פפטון סטריליים ודגרו אותם בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר הדגירה, העבירו מיליליטר אחד מהצד המסונן של השקית לצינור מיקרו צנטריפוגה.
צנטריפוגה את הצינור ב 900 פעמים G למשך דקה אחת. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש. צנטריפוגה את הדגימה ב-16,000 פעמים G למשך שתי דקות.
וכדי להשליך את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מגיב הכנת הדגימה וחממו אותו בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בגוש חום יבש. לאחר מכן, מצננים את הדגימה לטמפרטורת החדר ומאחסנים אותה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. הסוג השני של דגימה לבדיקת LAMP זו מגיע ישירות מתרביות סלמונלה משוערות.
להכנת תבניות DNA, העבירו 500 מיקרוליטר של תרבית סלמונלה לילה לצינור מיקרו צנטריפוגה, וחממו אותה בגוש חום של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, מצננים את הדגימה לטמפרטורת החדר ומאחסנים אותה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. כדי למנוע זיהום צולב, הפרד פיזית את האזורים המשמשים להכנת LAMP Master Mix והוספת תבניות ה-DNA.
נקו את משטחי העבודה עם איזופרופנול ותמיסה משפילה של DNA ו-DNA. לאחר מכן, נקו את הפיפטות ואת מחזיקי רצועות הצינורות. הפשירו את תערובת המאסטר האיזותרמית, תערובת פריימר 10X, מים בדרגה מולקולרית, DNA בקרה חיובית ותבניות DNA בטמפרטורת החדר.
הפעל את מכשיר ה-LAMP והזן את המידע הרלוונטי לדוגמא. הכן את ה-LAMP Master Mix לפי הוראות כתב היד, מערבולת וצנטריפוגה אותו בקצרה, וחלק 23 מיקרוליטר של המאסטר מיקס לכל באר של רצועת צינור. מערבל את כל תבניות ה-DNA וצנטריפוגה אותן בקצרה.
לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של תבנית DNA לבאר המתאימה, וכסה את הבאר בחוזקה. הסר את רצועת הצינור מהמחזיק, והחליק אותה כדי לוודא שכל הריאגנטים הצטברו בתחתית הצינור. טען את רצועת הצינור לתוך ה-LAMP מכשיר, והתחל את ה-LAMP פועל.
בזמן שתגובת ה-LAMP מתבצעת, הקש על טמפרטורה, Amplification ו-Anneal הכרטיסיות כדי לראות את השינויים הדינמיים של פרמטרים שונים במהלך ריצת ה-LAMP. ניתן לצפות בתוצאות ה-LAMP בלוח המחוונים של LAMP בזמן אמת, או באמצעות תוכנת LAMP. כדי לפרש את התוצאות בלוח המחוונים, פתח את ריצת ה-LAMP המעניינת.
שים לב לחמש הכרטיסיות המשויכות לכל ריצה. הכרטיסיות פרופיל וטמפרטורה מציגות טמפרטורות מתוכנתות ובפועל בבארות הדגימה ככל שתגובת ה-LAMP מתקדמת. כרטיסיות ההגברה והחישול מציגות קריאות פלואורסצנטיות ושינויים בקרינה במהלך שלבי ההגברה והחישול בהתאמה.
הכרטיסייה תוצאות מציגה את התצוגה הטבלאית של תוצאות ה-LAMP שניתן לפרש בהתאם להנחיות כתבי היד. הדרך השנייה view תוצאות LAMP היא באמצעות תוכנת LAMP. כדי לפרש את התוצאות באמצעות התוכנה, לחץ על סמל המחשב בחלונית השמאלית ונווט למיקום הקובץ כדי לטעון את ריצת ה-LAMP המעניינת.
שימו לב לשבע הכרטיסיות המשויכות לכל ריצה. הכרטיסיות פרופיל וטמפרטורה מציגות טמפרטורות מתוכנתות ובפועל בבארות הדגימה ככל שתגובת ה-LAMP מתקדמת. לשוניות קצב ההגברה וההגברה מציגות קריאות פלואורסצנטיות ושינויים בקרינה במהלך שלב ההגברה.
הכרטיסיות Anneal ו-Anneal Derivative מציגות קריאות פלואורסצנטיות ושינויים בקרינה במהלך שלב החישול. הכרטיסייה תוצאות מציגה תצוגה טבלאית של תוצאות LAMP. ישנן ארבע עמודות שכותרתן שם גרף, מספר באר, שם באר וערך שיא.
זמן המגבר ונגזרות החישול של כל שמונה הדגימות מוצגות. ניתן לפרש את התוצאות בהתאם להנחיות כתבי היד. ניתן להשתמש בלוח המחוונים LAMP ובתוכנת LAMP כדי להציג את תוצאות הבדיקה.
בריצת LAMP זו, דגימות S1 עד S6 הן דילולים סדרתיים פי עשרה של Salmonella enterica serovar Infantis ATCC 51741, הנעים בין 1.1 מיליון ל-11 יחידות יוצרות מושבה לכל תגובה. הבקרה החיובית, או PC, היא Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2 ב-17,000 יחידות יוצרות מושבה לכל תגובה, ובקרת ללא תבנית, או NTC, היא מים בדרגה מולקולרית. לבאר NTC יש Tmax ריק וטמפרטורת אנאלית של כ-81 מעלות צלזיוס בלוח המחוונים של LAMP, וטמפרטורת Tmax ריק וטמפרטורת חישול ריקה בתוכנת LAMP.
לבאר הבקרה החיובית יש Tmax של שבע דקות ו-45 שניות וטמפרטורת חישול של כ-90 מעלות צלזיוס בשתי הפלטפורמות. לדגימות S1 עד S6 יש Tmax בין שש דקות ל-30 שניות ו-12 דקות ו-15 שניות, וטמפרטורת חישול של כ-90 מעלות צלזיוס, כולם מצביעים על זיהוי חיובי. LAMP יעיל מאוד ומייצר כמות גדולה של DNA.
לכן זה קריטי להשתמש בשיטות מעבדה מומלצות למניעת זיהום צולב. השתמש בשיטות דומות בעת הכנת תבניות ה-DNA שלך, שכן העשרה ממזון מזוהם מן החי יכולה להכיל רמות גבוהות של סלמונלה. יש לאשר בדיקת דגימת מזון מן החי חיובית עם LAMP על ידי בידוד תרבית בהתאם להליכים במדריך האנליטי הבקטריולוגי של ה-FDA.
ניתן לדווח על דגימות שליליות ככאלה. השילוב של שיטת LAMP זו במדריך האנליטי הבקטריולוגי של ה-FDA סולל יישום רחב יותר של טכנולוגיה מהירה, חזקה וידידותית למשתמש זו בבדיקות בטיחות מזון.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול הגברה איזותרמית מתווכת בלולאות (LAMP) מאומת לגילוי מהיר של סלמונלה במזון בעלי חיים. השיטה מציעה יתרונות על פני PCR מסורתי, כולל תוצאות מהירות יותר ושיעורי שווא שליליים מופחתים, מה שהופך אותה לכלי אמין לזיהוי זיהום פוטנציאלי.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המחקר
- גילוי פתוגנים
- הגברה של חומצות גרעין
- בטיחות מזון
רקע
- חשיבות גילוי מהיר של פתוגנים במוצרי מזון
- הצורך בשיטות סינון אמינות לסלמונלה
- מגבלות של שיטות PCR מסורתיות
שיטות ששימשו
- הגברה איזותרמית מתווכת בלולאות (LAMP)
- Salmonella spp.
- שימוש בפרוטוקולי הכנת DNA ספציפיים
תוצאות עיקריות
- הדגים את היעילות של LAMP לגילוי סלמונלה
- הדגיש את שיעור השווא השלילי הנמוך של השיטה
- אימות באמצעות השוואה בין מספר מעבדות
מסקנות
- המחקר קובע את LAMP כשיטה בת ביצוע לייצורי ובאישור סלמונלה במוצרי מזון.
- הוא מדגיש את החשיבות של בדיקות מהירות לשיפור בטיחות המזון ולמניעת סיכוני בריאות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Rapid pathogen detection in animal food is critical for preventing contamination events that could impact both animal and human health. The LAMP method provides a reliable, inhibitor-tolerant nucleic acid test that supports timely screening and confirmation workflows in food safety testing. Its incorporation into the FDA BAM underscores its value as a standardized, deployable tool for biopharma and food safety laboratories seeking to reduce false negatives and accelerate decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of Salmonella presence in complex matrices like animal food enrichments.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing of contamination risk without requiring culturing timelines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for real-time monitoring of amplification kinetics.
- Operational Value: Delivers results in as little as 5 minutes with tolerance to inhibitors commonly found in food or culture samples.
- Strategic Value: Facilitates high-throughput screening readiness due to simple instrumentation and minimal hands-on time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms presumptive isolates from culture, bridging phenotypic and genotypic detection methods.
- Operational Value: Uses standardized DNA preparation protocols applicable to both food enrichment broths and pure cultures.
Pipeline & Workflow Integration
The LAMP method fits within food safety testing workflows as a rapid screening tool followed by culture-based confirmation when positive, supporting a tiered testing strategy.
- Discovery Biology: Enables early detection of Salmonella in pre-enriched animal food samples to inform hazard assessment.
- Screening: Provides inhibitor-resistant amplification suitable for complex food matrices after enrichment.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence data with defined Tmax and annealing temperature thresholds for result interpretation.
- Translational Research: Confirms LAMP-positive results via culture isolation, ensuring continuity between molecular and phenotypic validation.
- Enterprise Reuse: Compatible with existing LAMP instruments and software, allowing reuse across multiple sample types and laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High specificity via invA gene targeting reduces false positives in pathogen detection.
- Operational Value: Simple workflow with minimal equipment needs (heat block, centrifuge, LAMP instrument) increases accessibility.
- Strategic Value: Low false-negative rate improves confidence in negative results, supporting release decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of samples for further testing, optimizing resource use in safety programs.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic sample preparation and DNA template generation from enrichment broths or cultures.
- Needs access to a LAMP-capable fluorometer or real-time isothermal amplification instrument.
- Demands standardized reagent handling, including primer mixes and master mix preparation per manufacturer guidelines.
- Requires physical separation of master mix preparation and template addition zones to prevent amplicon contamination.
- Relies on proper cold storage (-20°C) of prepared DNA templates to maintain integrity between extraction and amplification.
