Name: המסך הגנטי הקדמי באמצעות כתבת סידן טרנסגניים Aequorin כדי לזהות יעדים הרומן איתות סידן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: למד מסך גנטי קדמי לזיהוי גנים חדשים במסלולי איתות סידן בצמחים. השיטה משתמשת במוטגנזת EMS וברפורטר Aequorin ב-Arabidopsis לחקירת מנגנוני הגנה צמחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאומי המכון לחקר הגנום צמח-פיטוטרון מתקן לצמיחת הצמח, בומביי באזור עבור לירות וידאו, ואת המחלקה לביוטכנולוגיה-eLibrary Consortium עבור מתן גישה משאבי e. עבודה זו היתה נתמכת על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה, הודו באמצעות המכון הלאומי למחקר הגנום צמח מענק הליבה, מקס פלאנק Ge, הודו הקבוצה השותפים התוכנית; ו-CSIR-זוטר מלגת מחקר (ל-D. M ו-S. M) והמחלקה למלגות ביוטכנולוגיה-זוטר (ל-R. P).

1. מוטזיס EMS ואוסף זרעים יחיד המבוסס על אילן יוחסין (1-3 חודשים)
<ol><li>שוקל 150 מ ג של זרעים (~ 7500) של aequorin עבור מוטארסיס EMS (M0 זרעים). שוקלים עוד 150 מ ג של זרעים לשמש כפקד.</li>
	<li>להעביר את הזרעים לצינור 50 mL ולהוסיף 25 מ ל 0.2% EMS (v/v) (התראה) (לטיפול) או 25 מ ל של מים אוטומטיים (עבור שליטה). הערה: אתיל-מתאן סולולאט הוא סוכן כימי לחומרים צמחיים מוטוניים.</li>
	<li>אטום את הצינור עם parafilm ולעטוף אותו רדיד אלומיניום. סובב את הצינור קצה-מעל-קצה עבור 18 h בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>. הניחו לזרעים להתיישב הסר את הפתרון EMS בקפידה ולהשליך במיכל פסולת המכילה 1 M NaOH בנפחים שווים (NaOH מסייע לנטרל/inactivate EMS מה שהופך אותו בטוח להשליך). התעלם מכלי הפלסטיק המשמשים בפתרון של 1 מ-NaOH. הערה: לאחר 24 שעות, להיפטר ממחיקה על פי נוהלי מעבדה חומרים מסוכנים.</li>
	<li>שטוף את זרעי המוטמושים ביסודיות עם 40 מ ל של מים אוטוקלבים לפחות 8 פעמים. התעלם מהאמס המכיל מים במיכל פסולת NaOH כפי שהוזכר לעיל.</li>
	<li>עבור השטיפה הסופית, להוסיף 40 mL של 100 mM הנתרן תיוסולפט ולשטוף 3 פעמים כדי להסיר עקבות של EMS.</li>
	<li>להשרות את הזרעים ב 40 mL של מים אוטוקלשים עבור ~ 1 h כדי לפזר EMS מתוך הזרעים ולאחר מכן למקם אותם על נייר סינון עד יבש לחלוטין.</li>
	<li>העבירו את הזרעים לצינור מיקרוצנטריפוגה, ומעבירים את הזרעים ב -4 ° c ב-40 mL של מים אוטוקלבים במשך 2-4 ימים. זה עוזר לשבור את הזרעים הזרע ומבטיח צמיחה הומוגנית.</li>
	<li>העברת הן את זרעי המוטטזים (M0) ואת הזרעים לשלוט על הקרקע (הרכב הקרקע: אגרופט: soilrite, 1:1) ולהעביר אותם חדרי צמיחה עם 16 h אור/8 h photoperiod כהה, עוצמת אור של 150μ:∙ M 2∙ s-1 ו ~ 70% לחות יחסית.</li>
	<li>כדי לקבוע אם מוטגנזה הצליחה, חפש מהירות נביטה מופחתת צמיחה שתיל, ו כלורופיל sectoring18 (איור 1a). השוו את הצמחים המוטוטניים למפעלי הבקרה כדי לזהות את ההבדלים הפיסיולוגיים וההתפתחותיים. הערה: ניתן להשתמש בשיטות שונות לקצירת זרעים מצמחי M1 . בפרוטוקול זה, השתמשנו בשיטת איסוף הזרעים המבוססת על אילן יוחסין אחת. כל מפעל M1 מוענק מספר ייחודי, החל A1 ל A3500.</li>
	<li>שמור על צמחים ממוספרים בנפרד כקווי צמחים נפרדים (איור 1B).</li>
	<li>עם התבגרות, הקציר זרעים מן הצמחים האלה בודדים מוטציה ולאחסן כמו M1 קווים (איור 2). מן האוסף המבוסס על אילן יוחסין אחד, הגענו סביב 5000 M1 שורות מתוך אשר 3500 M1 קווים הוקרן.</li>
</ol>2. הקרנת תפוקה גבוהה כדי לבחור מוטציות (8 חודשים)
<ol><li>לזהות מוטציות הרומן מבוסס על Ca2 + תגובה לגירוי שנבחר. . הנה, השתמשנו ב-2או2 כדוגמה</li>
	<li>לזיהוי מוטציות, להקרין את הדור M2 . מאז המוטנטיםהרצתיים ביניהם בשנת 1/8 תדירות ב-M 2 דור על מוטזיס EMS14, הקרנה של 8-12 m2-פנקסי צמחים מכסה אחד מ1 קו ומזהה מוטציה homozygous רצסיבי (באמצעות 12 שתילים מגביר את ההסתברות של מציאת מוטציה). מכל קו1 עצמאי, לבדוק 12 m2 שתילים עבור Ca2 + תגובה H2O2 (12 m2 שתילים לכל שורה1 ).</li>
	<li>השתמש בתפוקה גבוהה של זרע סירוס ועיקור ידרופוני צמח פרוטוקול19. מקום כמעט 12-15 M2 זרעים לכל M1 קו בארות בודדות של לוח 24-היטב של הרקמה התרבותית ולעקר באמצעות גז כלור (40 mL של 12% נתרן רדמה ו חומצה הידרוכלורית, 3:1, v/v) ב desiccator עבור 4 h ב מכסה המנוע. לאחר ההליך, לפתוח את הdesiccator ולהשאיר לילה על הגז כלור להתאדות.</li>
	<li>לאחר עיקור, להביא צלחות החוצה ולהוסיף נוזלי 1/2 MS מדיה (למחצה כוח MS ללא אגר) בארות בודדות. חותם את הצלחות עם parafilm ו stratify את הזרעים עבור 2-4 ימים ב 4 ° צ' ולאחר מכן להעביר זרעים לחדר גידול עם 10 h אור/14 h photoperiod כהה ב 20-22 ° צ' עם 70% לחות יחסית.</li>
	<li>לאחר השתילים הם 8-12 ימים, מקום 12 M2 שתילים מכל שורה בנפרד בלוח 96-ולומימטר. למדידת Ca 2+ תגובה H2O2, השתמש בקורא צלחת לומילומטר.</li>
	<li>לאחר העברת שתיל, להוסיף 150 μL של 5-10 μM הפתרון האוטומטי (מדולל במים אוטוקלשים מ 5 מ"מ מלאי ב מתנול) (זהירות) בבארות בודדים באזור כהה/נמוך אור לאחסן בחושך ב 21 ° c עבור 8 h. הערה: קומנטראטין היא קבוצה תותבת הקושרת אל איי-אאקוורין ומהווה אותה מחדש ל-aequorin תפקודית. קונטראטין הוא רגיש באור ולכן מאוחסן בבקבוקים בצבע כהה, מוגן מפני אור.</li>
	<li>למחרת, לבצע מסך מוטציה באמצעות 10 מ"מ H2O2 הגירוי ולמדוד Ca2 + תגובה הבאים.</li>
	<li>עבור מדידה בו של 24 בארות, ליצור תוכנית קינטית אוטומטית המודד את הרקע עבור 1 דקות, ואחריו תוספת גירויים (40 μL) ומדידה עבור 10 דקות, ואחריו פריקה הכולל aequorin (2 M CaCl2 ב 150 μl 20% אתנול) עבור 1-2 דקות. הערה: הפריקה הסופית עבור aequorin סה כ נדרש כדי לכמת את Ca נמדד2 + וכתוספת בקרת aequorin פונקציונלי. הפריקה הסופית היא ריצה קצרה של 1-2 דקות ואינו גורם מוות צמחי משמעותי. לחילופין, אם הצמחים למות לאחר הפריקה צעד, ואז לחדש את המסך הספציפי1 קו והצלה ללא השחרור. מוטציות כאלה ניתן אישר ב M3 ו-m4 הדורות באמצעות צעד פריקה.</li>
	<li>השתמש בשיטת סריקה בתבנית 24 שעות המודד כל שורה במרווח של 7 עם 300 ms זמן האינטגרציה לכל נקודת מדידה. השתמש שתיל מסוג פראי כמו שליטה בכל שורה להשוואה והערכה של המוטציות. הערה: יחידה 96 הבאר המכילה M2 שתילים יכסה 8 הפרט m1 קו (8 M1* 12 = 96 M2) ניתן לוקרן ב 2.5 h ו כל יום 32 M1 קווים יהיה מוקרן, 640 m1 צמחים לחודש. כל תהליך ההקרנה לאחר הצמחים מוכנים ייקח בערך 8 חודשים.</li>
	<li>זיהוי מוטציות מבוסס על אובדן או מופחת Ca2 + תגובה עם H2O2. להציל את המוטציות שנבחרו באמצעות תהליך כביסה המבוסס על אנטיביוטיקה. לשטוף את שתיל עם 25 מ"ג/L cefo, פתרון פעמיים ולאחר מכן להעביר לאמצעי הצלה המכיל 25 מ"ג/L cefoסעה בשנת 1/2 MS אגר.</li>
	<li>לגדל את לוחיות באור 10 h/14 h photoperiod כהה כדי להשיג צמח מוטציה. שטיפת הצ מסייעת להסרת כל מיקרו אורגניזמים מזיקים על שתיל. מאז שתילים לאחר החוקה נשמרים בלתי אטום, למזער זיהום כאשר מועבר חזרה למצב סטרילי.</li>
	<li>להעביר את המפעל מוטציה קרקע להשגת homozygous M3 אוכלוסיה.</li>
</ol>3. ניתוח נתונים וזיהוי מוטציה (1-3 חודשים)
הערה: הקריאות שסופקו מהשיטה הנ ל הן יחידות אור יחסיות (RLU).
<ol><li>לחישוב [Ca2 +] הריכוזcyt , השתמש במשוואה הריכוז הבאה20. pCa = 0.332588 (למטה-יומן (L/Lmax) + 5.5593 ספירות לומינסנציה () וספירות שנותרו (מקסימום).</li>
	<li>המר את ערכי ה-pCa שהתקבלו ל [Ca2 +] ערכיcyt ב-μm על-ידי הכפלה ב-106. לאחר מכן להתוות באופן גרפי נגד aequorin (הטרנסגניים Col-0 aequorin) בקרה לזיהוי הבנה H2O2 מוטציות כדי Ca2 + תגובה.</li>
	<li>שתילי הצלה מראה אובדן או מופחת התגובה H2O2 יישום שחולצו.</li>
	<li>עם התבגרות, הקציר זרעים מן המוטציות שחולצו והמסך מחדש עבור תגובה H2O2 ב M3 שתילים. אם כל 12 M3 שתילים להראות Ca2 + תגובה דומה לצמח האם, לשקול את האוכלוסיה להיות homozygous M3 מוטציה אוכלוסיה. אם כל 12 שתילים לא מראים תגובה כזאת, לאחר מכן לקחת אותם כדי4 הדור והמסך מחדש כדי להשיג homozygous אוכלוסיה.</li>
	<li>לאחר קו צמח homozygous הושג, לזהות את הגן המוביל שונה פנוטיפ באמצעות רצף הדור הבא.</li>
</ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+The+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: The lead currency of plant information processing.</a> The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Wasternack, C., Hause, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jasmonates%3A+biosynthesis%2C+perception%2C+signal+transduction+and+action+in+plant+stress+response%2C+growth+and+development.+An+update+to+the+2007+review+in+Annals+of+Botany%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany.</a> Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).</li>
<li>Kiep, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+cytosolic+Ca2%2B+elevation+is+activated+upon+wounding+and+herbivory+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+Luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>White, P. J., Broadley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Calcium in plants.</a> Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).</li>
<li>Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+impaired+in+intracellular+calcium+elevation+is+sensitive+to+biotic+and+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 162(2014).</li>
<li>Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The language of calcium signaling.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).</li>
<li>Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+calcium+signalling+and+early+signalling+elements+during+defence+responses+to+microbe-+or+damage-associated+molecular+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns.</a> The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).</li>
<li>Downie, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals+in+plant+immunity%3A+a+spiky+issue%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Calcium signals in plant immunity: a spiky issue.</a> New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).</li>
<li>Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+interplay+of+Ca2%2B+and+ROS+signaling+in+plant+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response.</a> Plant Science. 283, 343-354 (2019).</li>
<li>McAnish, M. R., Pittman, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+calcium+signature%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Shaping the calcium signature.</a> New Phytologist. 181, 275-294 (2009).</li>
<li>Colbert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+-throughput+screening+for+induced+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">High -throughput screening for induced point mutations.</a> Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).</li>
<li>Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoornneef%2C+M+%22Molecular+Plant+Biology%22">Molecular Plant Biology</a>. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).</li>
<li>Page, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanaka%2C+K+%22G+Protein-Coupled+Receptor+Signaling+in+Plants.+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).</li>
<li>Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+aequorin+monitors+cytosolic+calcium+transients+in+soybean+cells+challenged+with+beta-glucan+or+chitin+elicitors%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors.</a> Planta. 207 (4), 566-574 (1999).</li>
<li>Arisha, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethyl+methane+sulfonate+induced+mutations+in+M2+generation+and+physiological+variations+in+M1+generation+of+peppers+%28Capsicum+annuum+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.).</a> Frontiers in Plant Science. 6, 399(2015).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Rentel, M. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress-induced+calcium+signalling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).</li>
<li>Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mutagenesis+of+seed+and+vegetatively+propagated+plants+using+EMS%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).</li>
<li>Espina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Phenotypic+Screening+of+an+Ethyl+Methane+Sulfonate+Mutant+Population+in+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 394(2018).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetics+in+Arabidopsis%3A+Finding+Mutations+that+Cause+Particular+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).</li>
<li>Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaple%2C+J+%22Circadian+Rhythms.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology</a>. Rosato, E. , 362(2007).</li>
<li>Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQu%2C+LJ+%22Arabidopsis+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22">Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols)</a>. Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).</li>
<li>Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeyser%2C+HMO+%22Arabidopsis%3A+the+Complete+Guide+%28Electronic+v.+1.4%29%22">Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4)</a>. Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).</li>
<li>Pauly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleus+together+with+the+cytosol+generates+patterns+of+specific+cellular+calcium+signatures+in+tobacco+suspension+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells.</a> Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).</li>
<li>Mithöfer, A., Mazars, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+measurements+of+intracellular+Ca2%2B-signatures+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells.</a> Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).</li>
<li>Mehlmer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signatures+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation.</a> The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).</li>
<li>Sello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+Ca2%2B+fluxes+into+and+across+thylakoids+revealed+by+thylakoid-targeted+aequorin+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes.</a> Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast-localized+BICAT+proteins+shape+stromal+calcium+signals+and+are+required+for+efficient+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis.</a> New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+plant+receptor+for+extracellular+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a plant receptor for extracellular ATP.</a> Science. 343 (6168), 290-294 (2014).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSCA1+mediates+osmotic-stress-evoked+Ca2%2B+increases+vital+for+osmosensing+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis.</a> Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lectin+S-domain+receptor+kinase+mediates+lipopolysaccharide+sensing+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).</li>
<li>Johnson, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Poly%28A%29+Ribonuclease+Controls+the+Cellotriose-Based+Interaction+between+Piriformospora+indica+and+Its+Host+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).</li>
<li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+sensor+HPCA1+is+an+LRR+receptor+kinase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis.</a> Nature. 578, 577-581 (2020).</li>
</ol>

לאף אחד מהמחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

מוטגנזה EMS היא כלי רב עוצמה להפקת מוטציות באוכלוסיה. המסכים הקלאסי קדימה הגנטי באמצעות EMS כבר כלי יעיל כדי לזהות גנים הרומן שתי סיבות עיקריות: ראשית, הם לא דורשים כל הנחות מראש על זהות גנטית ושנית, הם לא מציגים כל הטיה. ישנן מספר שיטות ליצירת אוכלוסיות הקרנה כמו EMS, T-DNA הוספות, רדיוציות וכו '. מתוך כל השיטות, מוטזיס המבוסס על EMS מספר יתרונות בשיטות אחרות. ראשית, קל יותר ליצור אוכלוסיית מוטציה באמצעות חשיפה ל-EMS כפי שמתואר בפרוטוקול הנוכחי21,22. שנית, ניתן ...

שינוי בסידן ציטוסולג (Ca2 +) הריכוז על תפיסת של גירוי ביוטי או אביוטיים הוא אירוע מוקדם ללמוד איתות המפעיל הרבה1מסלולים איתות 1,2,3,4. תא במצב מנוחה בסיס שלו שומר על הנמוך ca2 + ריכוז ב ציטוזול ו-העודפים ca2 + ב אורגאואותאים שונים מוליך המוביל האחרון של ca תלולה2 + הדרגתי5,6. עם תפיסת האות, Ca2 + רמות עלייה ציטוסול בשל זרם של ca2 + מתוך החילוץ ו/או מקורות תאיים וליצור גירוי מסוים סידן חתימה7,8,9. Ca2 + הגבהים ב ציטוסול מופעלים על ידי גירויים רבים, אבל הייחוד מתוחזק על ידי חנויות נפרדות שחרור Ca2 +, Ca ייחודי2 + חתימה המתאים חלבונים חיישן10,11.
השימוש בסוכן אלקיטינג, אתיל-מתאן סולולאט (EMS) עבור מוטאוסיס הוא כלי רב עוצמה במסכים הגנטיים הקלאסיים הקדמיים כדי לזהות גנים עצמאיים מרובים המעורבים בתהליך. EMS הוא מוטגנים כימיים בעיקר גרימת C ל T ו-G כדי מעברים באופן אקראי ברחבי הגנום ומייצרת 1 שינוי bp ב כל 125 kb של הגנום. EMS מוטארסיס יהיה לגרום ≈ 1000 משני זוגות בסיס יחיד שינויים, ההכנסה/מחיקות (InDel) או בודד פולימורפיזם (SNP) לכל גנום12. מוטציות בהשפעת EMS הן מוטציות בנקודות מרובות עם תדר מוטציה הנע בין 1/300 ל 1/30000 לוקוס. זה מפחית את מספר M1 צמחים הדרושים כדי למצוא מוטציה בגן נתון. טווח של אוכלוסיית M1 הזרע של 2000-3000 משמש בדרך כלל כדי להשיג מוטציות של עניין ב arabidopsis thaliana13,14.
Aequorin transgenics הם Arabidopsis קולומביה-0 (Col-0) צמחים אקולוגיים המבטא p35S-apoaequorin (pMAQ2) ב ציטוסול15. Aequorin הוא חלבון Ca2 + מאגד המורכב האפופרוטאין וקבוצה תותבת המורכבת של מולקולה לוציב, קומרכאזין. הכריכה של Ca2 + כדי aequorin, אשר יש שלוש Ca2 + מאגד הידיים האתרים, התוצאות בתוך מחזוריות החיידקים והמחזוריות כדי לתת את dioxetanone ביניים, ואחריו שינוי מאוד של החלבון מלווה על ידי שחרורו של פחמן דו חמצני ו זינגתן-נרגש קוקונב16. Coelenteramide כל כך המיוצר פולט אור כחול (λmax, 470 nm) כי ניתן לזהות על ידי לומימטר17. מהיר ביותר Ca2 הגבהים יכולים ובכך להיות נמדד בזמן אמת, ומנוצלת מהירה קדימה מסכי גנטיות. פרוטוקול זה נועד להשתמש בספציפיות של תגובת הסידן כדי לזהות נגני מפתח חדשניים המעורבים בחתימת Ca2 + . כדי להשיג משימה זו, אנו משתמשים במוטזיס EMS בתוך הטרנסגניים aequorin ומזהים את ה-SNPs המשויך ל-Ca2 + איתות שהשתנה. הפרוטוקול מזהה מוטציות שאינן מראות או מופחת Ca2 + הגבהים על תוספת הגירוי. לאחר מכן ניתן למפות מוטציות אלה כדי לזהות את הגנים האחראים על Ca2 + תגובה. השיטה ישימה לכל סוג של גירוי נוזלי בצמחים שתוצאתו Ca2 + העלאה. מאז Ca2 + העלאה היא אחת התגובות הראשונות במסלול ההגנה הצמח איתות, זיהוי של רכיבי תגובה במעלה הזרם יכול לספק מועמדים הנדסה גנטית לפתח צמחים גמישים.

<table><tbody><tr><td>צלחת תרבית רקמות 24 באר</td><td>Jetbiofil</td><td>11024</td><td>לגידול שתילים</td></tr><tr><td>96 באר cliniplate לבן</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502887</td><td>למדידות לומינומטר</td></tr><tr><td>Aequorin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agropet</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>לגידול צמחים</td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12135</td><td>לפריקה תמיסה</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>PJK</td><td>55779-48-1</td><td>קבוצה תותבת לאקורין</td></tr><tr><td>Ehtylmethane sulfonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0880-5G</td><td>למוטגנזה של זרעים</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>מגיב אנליטי</td><td>1170</td><td>לתמיסת פריקה</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93001.0521</td><td>תמיסת עיקור</td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15465</td><td>כגירוי לעליית סידן עליית</td></tr><tr><td>לומינסקאן</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>5300172</td><td>מדידת זוהר AEQUORIN</td></tr><tr><td>MES מאגר</td><td>Himedia</td><td>RM1128-100G</td><td>גידול צמחים</td></tr><tr><td>Murashige ו-skoog media</td><td>Himedia</td><td>PT021-25L</td><td>גידול צמחים</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>27805</td><td>לנטרול EMS</td></tr><tr><td>נתרן היפוכלוריט</td><td>Merck Life Sciences</td><td>1.93607.5021</td><td>תמיסת עיקור</td></tr><tr><td>נתרן תיוסולפט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>28005</td><td>לשטיפת זרעים בשלב 1.6</td></tr><tr><td>soilrite</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>לגידול צמחים</td></tr><tr><td>עציצים מרובעים</td><td>Lab Chem India</td><td></td><td>לגידול צמחים</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S0389</td><td>גידול צמחים</td></tr><tr><td>טקסים</td><td>אלקם</td><td>7180720</td><td>להצלת שתילים</td></tr></tbody></table>

המסך הגנטי הקדמי באמצעות כתבת סידן טרנסגניים aequorin כדי לזהות יעדים הרומן איתות סידן

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

מסכים גנטיים הקדמי היו כלים חשובים בזיהוי משוחדת של רכיבים גנטיים המעורבים מסלולים ביולוגיים מספר. הבסיס של המסך הוא ליצור אוכלוסיית מוטציה שניתן להקרין באמצעות פנוטיפ של עניין. EMS (אתיל מתאן סולולאט) הוא סוכן al, המשמש בדרך כלל לגרימת מוטציה אקראית במסך הקלאסי קדימה גנטי כדי לזהות גנים מרובים המעורבים בכל תהליך נתון. סידן ציטוסולג (Ca2 +) העלאת הוא מפתח מוקדם איתות במסלול המופעל על תפיסת המתח. עם זאת, הזהות של קולטני, ערוצים, משאבות ומובילים של Ca2 + הוא עדיין חמקמק במערכות לימוד רבות. Aequorin הוא חלבון כתבת הסידן התאי מבודד מ aequorin ויקטוריה ובאופן מאוד מבוטא באריידאופזיס. אנו מנצלים את המצב הגנטי הקדמי. בו אנו מוטגנים את הטרנסאוגניים הזרעים של צמחי מוטציה נאספו (M1) והקרנה עבור הפנוטיפ של עניין נעשה בפנקסי (m2) אוכלוסיה. באמצעות פרוטוקול Ca2 + מדידה של 96-היטב, מוטציות הרומן מספר ניתן לזהות כי יש תגובת סידן משתנה והם נמדדים בזמן אמת. המוטציות עם הפנוטיפ של עניין חולצו והופץ עד homozygous מוטציה האוכלוסייה הצמח מתקבל. פרוטוקול זה מספק שיטה עבור מסכים גנטיים מתקדמים ברקע של Ca2 + עיתונאי ולזהות הרומן ca2 + מוסדר מטרות.

אוכלוסיית EMS הוקרן עבור H2O2 המושרה Ca2 + העלאת. כפי שהוזכר קודם לכן, 12 שתילים בודדים מ2 הוקרן מכל קו M1 . באיור 3, אחד כזה שורה M1 מותווים עם כל פאנל המציג 12 בודדים M2 שתילים. Aequorin מסוג פראי משמש כשליטה להשוואת והערכת תגובת המוטציות. ביחס של 1:7 (חשבונאי: לא מוטציה). כאשר ההקרנה 12 שתילים בודדים לשורה M1 , אנחנו יכולים לזהות 1 או 2 מוטציות בכל שורה. זיהינו 2 מוטציות בפוטוטיבית מ 12 M2 ש...

המסך הגנטי הקדמי מבוסס על Ca2 + העלאת כקריאה החוצה מוביל זיהוי של רכיבים גנטיים מעורבים התלויים סידן מסלולים איתות בצמחים.

המסך הגנטי הקדמי באמצעות כתבת סידן טרנסגניים Aequorin כדי לזהות יעדים הרומן איתות סידן

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...

מטרת פרוטוקול זה היא לזהות שיטה אשר ניתן להשתמש בהם לזיהוי גנים חדשניים המעורבים איתות סידן. כדי לעשות זאת, אנו משתמשים במסך הגנטי הקלאסי קדימה. איתות סידן הוא מסלול תגובה ביטחוני חשוב במספר מערכות צמחים.על מנת לזהות את הגנים המעורבים במסלול זה, השתמשנו במסך הגנטי הקלאסי קדימה. בשיטה זו, EMS ישמש כסוכן alkylating להציג מוטציות אקראיות במערכות הצמח. לאחר מכן ניתן להשתמש בדור המוטנטים המפותח להקרנה עבור פנוטיפ של עניין.לאחר שזיהו את הפנוטיפ של העניין, ניתן למפות את הגן הסיבתי. במחקר זה, אנו משתמשים בצמח המודל Arabidopsis אשר יש aequorin כתב הסידן בספקטרום שלה. לשקול 150 זרעי מ"ג של aequorin עבור MUTAGENESIS EMS ועוד 150 זרעי מ"ג לשמש שליטה.מעבירים את הזרעים לצינור פלקון 50 מ"ל ומוסיפים 2%EMS או מים אוטומטיים. בעת שימוש ב- EMS, היזהר כי זה מסרטן. יש ללבוש הילוכים מגן בעת השימוש ב- EMS ויש למנוע כל סוג של שפיכה.לאטום את צינורות פלקון עם פרפין ולעטוף אותו רדיד אלומיניום. סובב את קצה הצינור מעל הקצה במשך 18 שעות בטמפרטורת החדר. אפשר את הזרעים להתיישב ולהסיר את פתרון EMS בזהירות להשליך במיכל פסולת המכיל אחד molar NaOH.לשטוף את הזרעים mutagenized ביסודיות עם 40 מ"ל של מים autoclaved לפחות שמונה פעמים. לשטוף הסופי, להוסיף 100 מילימולאר נתרן thiosulfate ולשטוף לפחות שלוש פעמים כדי להסיר עקבות של EMS. משרים את הזרעים ב 40 מ"ל של מים autoclaved במשך שעה אחת כדי לפזר EMS מתוך הזרעים ולאחר מכן למקם אותם על נייר Whatman עד יבש לחלוטין.מעבירים את הזרעים לאפנדורף ודורגים בארבע מעלות צלזיוס למשך יומיים עד ארבעה ימים לריוד. מעבירים הן את הזרעים המושתקים והן את הזרעים המטופלים במים על אדמה ומעבירים אותם לחדרי צמיחה עם אור של 16 שעות ותהומת צילום כהה של שמונה שעות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ו-70% לחות יחסית. כדי לקבוע אם mutagenesis היה מוצלח, לחפש סקטורינג כלורופיל.השתמשנו בשיטת איסוף הזרעים היחידה המבוססת על אילן יוחסין וכל צמח M1 מקבל מספר ייחודי. עם התבגרותם, זרעים נקצרים מצמחים מוטנטים בודדים אלה ומאוחסנים כקווי M1 בודדים. נעשה שימוש בסטריליזציה של זרעי תפוקה גבוהה ופרוטוקול שורש של צמחים הידרופוניים, המותאם מ- Ranf et al.ביום הראשון, מקום כמעט 12 עד 15 זרעי M2 לכל M1 שורה אחת בארות בודדות של צלחת תרבות רקמות 24 היטב לעיקור באמצעות hypochlorite נתרן ותווית חומצה הידרוכלורית ביחס של שלושה הוא לאחד. זה משחרר גז כלור שמחקר את הזרעים. השאירו את הצלחת ללילה כדי להתאדות גז כלור שנותר לחלוטין.לאחר עיקור, מוסיפים חצי כוח נוזלי MS מדיה בארות בודדות לשכבות הזרעים במשך יומיים עד ארבעה ימים בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר את הזרעים לתא צמיחה עם תקופת צילום של אור 10 שעות ו 14 שעות כהה ב 22 מעלות צלזיוס, 70% לחות יחסית. ביום 14, לאחר השתילים הם 8 עד 12 ימים, מקום 12 שתילים M2 מכל שורה בנפרד בצלחת 96 היטב זוהר. לאחר העברת שתיל, להוסיף 150 microliters של חמישה פתרון קולנטרזין micromolar בארות בודדות ולאחסן בחושך ב 21 מעלות צלזיוס במשך שמונה שעות.Coelenterazine היא קבוצה תותבת אשר נקשר אפואקורין כדי ליצור aequorin פונקציונלי. Coelenterazine הוא רגיש לאור ולכן מאוחסן בבקבוקים בצבע כהה מוגן מפני אור. למחרת, מוטנטים מסך באמצעות מי חמצן כמו גירוי ולמדוד העלאת סידן הבאים.למדידה בו זמנית של 24 בארות, נעשתה תוכנית קינטית אוטומטית החוצה, הכוללת מדידת הרקע לדקה אחת, ואחריה תוספת גירוי ומדידה במשך 10 דקות, ואחריה הזרקת פריקה 150 מיקרוליטר ומדידה במשך שלוש עד חמש דקות. וכל פריקה עבור aequorin הבת תיכלל בקריאה לכמת את הסידן הנמדד כבקרה נוספת עבור aequorin תפקודי. הקריאות הנ"ל נמצאות ביחידות תאורה יחסיות.לחישוב ריכוז יון סידן ציטוסולי, נעשה שימוש במשוואת ריכוז שתוארה בעבר על ידי Rental and Knight בשנת 2004, המתוארת בפרוטוקול. RLUs המתקבלים זוהר מתווספים למשוואה כדי לחשב את ריכוז יון הסידן. ערכי יון הסידן הציטוסוליים המתקבלים מותווים לאחר מכן בצורה גרפית נגד בקרה מסוג פראי לזיהוי מוטציות מי חמצן לשם לתגובת סידן.זוהי תוצאה מייצגת של הפרוטוקול המוצג. הראינו קו M1 אחד עם 12 שתילים בודדים שנמדדו להעלאת ריכוז יון הסידן. הקו הירוק בגרף מציין אקורין פראי שנמדד יחד עם מוטנטים.אדום הוא ממוצע של כל 12 השתילים, ואת הקו השחור הוא שתילים בודדים M2 נמדד עבור גובה יון הסידן. שתילים המראים תגובה מופחתת מאוד ליישום מי חמצן הם הצילו לאחר מכן. לאחר מכן, מוטנטים שניצלו מאושרים מחדש בדור הבא, ולאחר מכן מיפוי לזיהוי גנים סיבתיים.זהירות צריכה להינתן בעת שימוש ב- EMS כמו mutagen מאז זה מסרטן. הילוכים מגן צריך להיות משוחק בכל עת וכל שפיכה שנעשתה צריך להיות מטופל עם שיטות מעבדה טובות. בנוסף, כאשר עושים אוסף מבוסס אילן יוחסין של זרעים, צמחים בודדים יש לקצור בזהירות מירבית, כך שאין ערבוב של זרעים כלשהם בכל שלב.זה יעזור אחד לחזור ולעקוב אחר צמח האם, שהוא צמח מוטנט הומוזיג. בנוסף, מאז שיטה זו אינה מציגה כל הטיה או כל הנחות קודמות לתוך שיטת המיון, זה יכול לשמש עבור תנאים אחד או יותר כדי לזהות פנוטיפ של עניין. בנוסף, ניתן לזהות גנים עצמאיים מרובים גם באמצעות אותו פרוטוקול.הפרוטוקול קל לשימוש שכן עם המינון הקטן, מספר עצום של צמחים ניתן mutagenized. מספר עצום זה של צמחים מוטנטים יכול לשמש עבור מספר אוכלוסיות עבור מספר תנאים ולזהות מספר גנים. אובדן תפקוד חלקי, פונקציה שהשתנתה, אובדן תפקוד מוחלט, או גם תפקוד גנים מכופתר ניתן לזהות באמצעות שיטה זו.מיפוי צריך להיות משימה קלה בהתחשב בקידום בטכנולוגיות מיפוי בתרחישים הנוכחיים. מערכת מיפוי מבוססת דה נובו, מזימה גזעית מבוססת SNP ורבים אחרים יכולים לשמש לזיהוי הגן הסיבתי הגורם לפנוטיפ העניין. בהתחשב ביישום של שיטה זו, ניתן להשתמש בו לא רק על הצמחים מודל Arabidopsis, אבל מפעלי מודל אחרים מדי בתנאי כי פנוטיפ של קריאה עניין ניתן ליצור.

forward-genetic-screen-using-transgenic-calcium-reporter-aequorin-to

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מציג את המושגים מאחורי דימות סידן וכולל פרוטוקול לדוגמה להדמיית הילוך מהיר של תולעים הכלולות בבארות אגרוז יצוקות.

הדמיית סידן: שיטה להמחשת פעילות עצבית ב- C. elegans חי

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים...

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

כאן אנו מציגים רומן Ca 2 + גישת -imaging באמצעות כתב bioluminescent. גישה זו משתמשת בGFP-aequorin מבנה התמזגה אשר נקשר Ca 2 + ופולט אור, ומבטל את הצורך בעירור אור. באופן משמעותי בשיטה זו מאפשרת הדמיה ארוכה רציפה, גישה למבני מוח עמוקים ורזולוציה גבוהה זמנית.

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

אנו מתארים גישות על המניפולציה של גנים במערכת המודל האבולוציוני Astyanax mexicanus. שלוש טכניקות שונות מתוארים: בתיווך Tol2 transgenesis, יישוב מניפולציה של הגנום באמצעות CRISPR/Cas9, ואת נוקאאוט של הביטוי תוך שימוש morpholinos. כלים אלה צריך לאפשר חקירה ישירה של גנים שבבסיס וריאציית בין פני השטח - ואת מערת המגורים טפסים.

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

אנו מתארים כאן, את הקמתו ויישום של Tg(Myh6-cre)1Jmk / J / GT (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze / J (המכונה αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 להלן) קו כתב עכבר להערכת תכנות לב. פיברובלסטים לב ילודים (NCFs) מבודדים מזן העכבר מומרים לקרדיומיוציטים מושרה (iCMs), ומאפשרים הערכה נוחה ויעילה של יעילות תכנות מחדש והתבגרות תפקודית של iCMs באמצעות שטף סידן (Ca2+).

הערכה במבחנה של תכנות לב מחדש על ידי מדידת שטף סידן ספציפי לב עם כתב GCaMP3

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בקרה ותצפית כל-אופטית של פעילות תאית מופעלת בקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC (iPSC-CMs) לצורך בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה ובדיקות רעילות. מוצג כימות רב-פרמטרי של תבניות פנוטיפיות בזמן ובמרחב. ההשפעות ארוכות הטווח של סמים לאורך שעות, או מדידות עוקבות לאורך ימים, מודגמות.

בקרה אופטית בתפוקה גבוהה ורישום אות סידן בקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC לבדיקת רעילות ובדיקת תרופות פנוטיפית

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

תותבות רשתית יש את היכולת ליצור תפיסות חזותיות. כדי לקדם את הפיתוח של תותבות חדשות, יש צורך בשיטות ex vivo כדי לבדוק מכשירים לפני ההשתלה. מאמר זה מספק פרוטוקול מקיף לחקר פעילות הסידן בשכבת תאי גנגליון הרשתית כאשר הוא נתון לגירוי חשמלי.

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

למד מסך גנטי קדמי לזיהוי גנים חדשים במסלולי איתות סידן בצמחים. השיטה משתמשת במוטגנזת EMS וברפורטר Aequorin ב-Arabidopsis לחקירת מנגנוני הגנה צמחיים.

המסך הגנטי הקדמי באמצעות כתבת סידן טרנסגניים Aequorin כדי לזהות יעדים הרומן איתות סידן

גלה סרטונים נוספים