הערכת מוות תאים באמצעות Supernatant ללא תאים של פרוביוטיקה בתרביות כדוריות תלת מימדיות של תאים סרטניים המעי הגס
13 ביוני 2020
כאן מוצגות שיטות כדי להבין השפעות אנטי סרטניות של לקטובצילוס ללא תאי supernatant (LCFS). קווי תאים סרטניים המעי הגס מראים מקרי מוות של תאים כאשר מטופלים עם LCFS בתרבויות תלת-ממד. תהליך יצירת כדוריות יכול להיות ממוטב בהתאם לפיגומים ושיטות הניתוח המוצגות שימושיות להערכת מסלולי האיתות המעורבים.
פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה כדי להקל על חקירת ההשפעה האנטי-סרטנית של סופרנטנט נטול תאי לקטובצילוס בסוגים רבים של ספרואידים של תאי סרטן המעי הגס. טכניקה זו היא הגישה הראשונה החוקרת את ההשפעות האנטי-סרטניות של LCFS על ספרואידים של סרטן המעי הגס בתנאי חיקוי in vivo. התחל בהנחת צלחת אגר MRS מעוקרת חיטוי בתא אנאירובי מימן של 37 מעלות צלזיוס עם 20 חלקים למיליון חמצן וחיסון הצלחת במלאי חיידקי לקטובצילוס שזה עתה הופשר.
הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של מרק MRS, בתוספת L-ציסטאין לצינור ואטום את הצינור עם פקק גומי בוטיל ומכסה הצינור. לאחר מכן, השתמש בלולאה כדי לאסוף מושבה בודדת ולהניח את המושבה בצינור תרבית של 1.5 מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטר PBS. השעו מחדש את המושבה בצורה הומוגנית בתוך מי המלח והעמיסו את כל תרחיף החיידקים למזרק של מיליליטר אחד.
הכנס את המחט למרכז מכסה צינור התרבות והעביר את המושבה למדיום. הניחו את התרבית באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-200 סיבובים לדקה. לאחר יומיים, מדוד את ה-OD620 של התרבית על ספקטרופוטומטר.
כאשר ה-OD620 שווה לשניים, משקעים את החיידקים על ידי צנטריפוגה ושוטפים את כדור החיידקים עם PBS. לאחר הצנטריפוגה השנייה, השעו מחדש את החיידקים בארבעה מיליליטר של RPMI 1640, בתוספת סרום בקר עוברי 10% ללא אנטיביוטיקה והניחו את החיידקים באינקובטור הרועד למשך ארבע שעות במהירות של 100 סיבובים לדקה. בתום הדגירה, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ומסנן סטרילי את הסופרנטנט המשוחזר דרך מסננת 0.22 מיקרון לאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי להכין קווי תאים של סרטן המעי הגס להיווצרות ספרואידים, תרבית התאים המעניינים כחד-שכבות בצלחות פטרי של 100 מילימטר בחממת תרבית התאים. כאשר התאים מגיעים למפגש של 70 עד 80%, שטפו את התרביות פעמיים עם ארבעה מיליליטר PBS לכל שטיפה לפני ניתוק התאים עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין-EDTA למנה. לאחר שתי דקות, בדוק אם יש דיסוציאציה במיקרוסקופ אור.
אם התאים התנתקו, נטרלו את התגובה האנזימטית עם חמישה מיליליטר של מדיום גידול. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה בצינור חרוטי אחד של 15 מיליליטר לכל תרבית תאים והשהה בעדינות את הכדורים עם שלושה מיליליטר של מצע גידול לכל צינור. לאחר מכן, ספור את מספר התאים ברי קיימא על ידי אי הכללה כחולה של טריפאן.
לאחר הספירה, יש לדלל את התאים לאחד עד פעמיים 10 עד 5 תאים לריכוז מיליליטר במדיום טרי ולהוסיף מתיל צלולוז לתאים לריכוז סופי של 0.6%. העבירו את התאים למאגר סטרילי והשתמשו בפיפטה רב-ערוצית כדי להוציא 200 מיקרוליטר תאים לכל באר של מיקרו-פלטה תחתונה עגולה עם 96 בארות חיבור נמוך במיוחד. לאחר מכן, הנח את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך 24 עד 36 שעות לפני בדיקת היווצרות ספרואידים על ידי מיקרוסקופ אור.
לטיפול ב-LCFS, יש לדלל באופן סדרתי את תמיסת מלאי ה-LCFS המופשרת המוכנה במדיום גידול טרי לריכוזים של 25, 12.5 ו-6% והשתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר בזהירות כמה שיותר סופרנטנט מכל באר של תרביות קו תאי סרטן המעי הגס המצופים. לאחר מכן, הוסיפו בעדינות 200 מיקרוליטר של מדיום גידול בתוספת LCFS בשלוש פעמים לכל קבוצה של תאים סרטניים והחזירו את הצלחת לחממה למשך 24 עד 48 שעות נוספות. ריכוז מתיל צלולוז של 0.6% הופך את תאי קו התאים הסרטניים שנבדקו לספרואידים קומפקטיים, מה שמצביע על כך שניתן לייצר ספרואידים ממספר סוגים של סרטן המעי הגס באמצעות פרוטוקול זה.
ספרואידים שגודלו עם 25% LCFS מציגים משטחים משובשים וירידה בכדאיות התאים באופן תלוי מינון. ואכן, תאים בתרבית משותפת של LCFS מפגינים רמות גבוהות יותר של ביטוי פרופידיום יודיד בהשוואה לתאי ביקורת ברי קיימא. ניתן לבצע ניתוח PCR של טרנסקריפטאז הפוך, ניתוח Western Blotting ואנקסין ציטומטרי זרימה V/7-AAD כדי להעריך את ההשפעות של LCFS על אפופטוזיס של תאים סרטניים.
הקפד לטפל בכדורים בעדינות בעת הסרת מצע הגידול מכיוון שהספרואידים יכולים להישבר בקלות, מה שלא מאפשר לצפות בהשפעת הטיפול ב-LCFS. לאחר הליך זה, ניתן לבצע בדיקות כדאיות תאים, PCR כמותי בזמן אמת, Western Blotting וניתוח FACS כדי לאפיין את ההשפעה האנטי-סרטנית של LCFS בפירוט רב יותר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבחינת ההשפעות האנטי-סרטניות של תכשיר על-נוזל נטול תאים של Lactobacillus (LCFS) על ספרואידים של סרטן המעי הגס. המחקר מבצע אופטימיזציה ליצירת הספרואידים ומעריך את מסלולי האיתות המעורבים במות התאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר הסרטן
רקע
- Lactobacillus ידועה בזכות השפעותיה החיוביות הפוטנציאליות על הבריאות.
- על-נוזלים חסרי תאים (Cell-free supernatants) עשויים להכיל תרכובות ביואקטיביות.
- סרטן המעי הגס והחלחולת נותר אתגר בריאותי משמעותי.
- תרביות תאים בתלת-ממד (3D) מדמות טוב יותר תנאי in vivo.
מטרת המחקר
- לבחון את ההשפעות נוגדות הסרטן של LCFS על ספרואידים של סרטן המעי הגס.
- לאופטימיזציה של טכניקות ליצירת ספרואידים.
- לנתח את מסלולי השילוח המעורבים בהשפעות שנצפו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של צלחות אגר MRS בתא אנאירובי.
- 接接 של הצלחות עם מ कल्चर של חיידקי Lactobacillus.
- גידול של חיידקים במצע MRS broth מועשר ב-l-cysteine.
- איסוף ותליה מחדש של מושבות חיידקים לצורך טיפול.
תוצאות עיקריות
- קווי תאי סרטן של המעי הגס והחך הרחב הפגינו מוות תאי בעקבות טיפול ב-LCFS.
- שיטות אופטימליות ליצירת ספרואידים שיפרו את תוצאות הניסוי.
- נתיבי השרטוך המעורבים במוות התאי נותחו ביעילות.
- המחקר מספק גישה חדשנית למחקר טיפולים בסרטן.
מסקנות
- LCFS מראה פוטנציאל כסוכן אנטי-סרטני.
- טכניקות תרביות בתלת-ממד חיוניות למידול מדויק.
- נדרש מחקר נוסף כדי להבין במלואו את המנגנונים המעורבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר לצוותי מו"פ בביופרמה להעריך תמליי על (supernatants) המופקים מפרוביוטיקה לבחינת פעילות אנטי-סרטנית במודלים תלת-ממדיים של סרטן המעי הגס הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. באמצעות שימוש בתמליל על נטול תאים של Lactobacillus fermentum (LCFS) בתרביות ספרואידים יציבות, השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מועמדים ממוצרי טבע ומשפרת את הביטחון החזוי במאמצי תיקוף המטרה. גישה זו מגשרת בין סריקה בשלב הגילוי לבין רלוונטיות תרגומית (translational relevance) על ידי מידול אינטראקציות של מיקרו-סביבת המעי המשפיעות על חיוניות תאי הסרטן.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות בנוגע למטבוליטים מיקרוביאליים והשפעתם על מסלולי מוות של תאי סרטן השחל והמעי הגס.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות קריאות חיוניות התלויות במינון במודלים של ספרואידים בתלת-ממד.
- ערך ניבוי: תומך במיון של תיקי פיתוח על ידי קישור של אפופטוזה המושרה על ידי LCFS לסממנים מולקולריים מדידים באמצעות qRT-PCR, Western blot ו-FACS.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקת תרכובות בהמשך, תוך שימוש ביצירה הדירה של ספרואידים בלוחיות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד.
- תוצרים כמותיים: הפקה של נתוני תגובה למינון (25%, 12.5%, 6% LCFS) המאפשרים הערכת IC50 ומידול של קשר מבנה-פעילות.
- סקביליות: שימוש בפורמט של 96 בארות התואם למערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים ולסריקת חיוניות בתפוקה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדגמי פתופיזיולוגיה של סרטן המעי הגס באמצעות ספרואידים מתאי-קו שגודלו במעבדה או כאלה שהופקו מחולים, המשקפים את ארכיטקטורת הגידול in vivo.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאי גילוי לאימות פרה-קליני על ידי שמירה על תנאי תרבית תלת-ממדיים עקביים לאורך שלבי הבדיקה.
- החלטות מותאמות סיכון: מסייע בקביעת קריטריונים להמשך או הפסקת הניסוי (go/no-go) על בסיס השראת אפו פטוזיס וספי viability שנצפו בתרביות משותפות של ספרואידים.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים לאחר זיהוי המטרה ולפני אופטימיזציית המולקולה המובילה (lead optimization), ובכך מספקת מערכת רלוונטית למחלה להערכת סמי-נזירים (supernatants) בעלי פעילות ביולוגית ממקורים מיקרוביאליים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מנגנונים מיקרוביאליים נגד סרטן והבהרה של מסלולים במודלים תלת-ממדיים החוזים טוב יותר תגובות in vivo.
- סריקה: מספק סטנדרטיזציה של בדיקות ויכולת שחזור באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים ליצירת ספרואידים ולטיפול ב-LCFS.
- אנליטיקה: מאפשר מדידות כמותיות של משתנים תלויים (חיוניות, סמני אפופטוזיס) התומכות בהשוואה סטטיסטית בין תנאי טיפול וסוגי תאים.
- מחקר תרגומי: שומר על רציפות מסריקה מבוססת ספרואידים ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שימור נאמנות התרבית התלת-ממדית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לסריקת על-נוזלים של פרוביוטיקה, תמציות ממזון מותסס או טיפולים המופקים מהמיקרוביום במגוון סוגי סרטן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות ממודלים דו-ממדיים ולכידת השפעות התלויות בסביבה המיקרוסקופית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי יצירת הספרואידים והטיפול בהם, ובכך משפר את השחזוריות בין אתרים שונים ומפחית את השונות במדידות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של התערבויות המכוונות למיקרוביום לפני מחקרים יקרים in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים מתוצרי טבע, בהתבסס על השראת אפופטוזיס ותגובה למינון במודלים רלוונטיים קלינית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות חיידקים אנאירוביות, טיפול בספרואידים בתלת-ממד וטכניקות לבדיקת אפופטוזיס (qPCR, WB, FACS).
- תלוי בציוד הכולל תאי אנאירוביים, אינקובטורים נערים, ספקטרופוטומטרים וציטומטרים למשק זרימה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי המיקרוביולוגיה והביולוגיה של הסרטן להכנה עקבית של LCFS ובקרת איכות של הספרואידים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לזני חיידקים אחרים או לסוגי סרטן מעבר למודלים של סרטן המעי הגס.
- מוגבל בשל שבירות הספרואידים במהלך החלפת המצע, דבר הדורש טיפול עדין כדי לשמר את השלמות המבנית עבור קריאות מדויקות.
שאלות נפוצות בתחומי הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Bacterial Cell Culture and Lactobacillus Cell-Free Supernatant (LCFS) Preparation
2:18
Colorectal Cancer Cell Line Preparation
3:12
Spheroid Formation
3:49
3D colorectal Cancer Cell LCFS Treatment
4:26
Results: Representative Effects of LCFS Co-Culture on Spheroid Formation and Viability
5:22
Conclusion
